«Иванова Марина Викторовна Взаимодействия вирусов с детонационными наноалмазными материалами и композитами на основе полианилина 03.02.02 – вирусология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук ...»

1

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И.

Ивановского»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

Иванова Марина Викторовна

Взаимодействия вирусов с детонационными наноалмазными материалами и композитами на основе полианилина 03.02.02 – вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Е.И.Бурцева Москва 2014 Оглавление………………………………………………………………………………..

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение…………………………………………………………………………… ….. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………………… Глава 1. Вирус гриппа птиц как источник возможных пандемических штаммов 1.1 Роль водной среды в распространении вирусных инфекций………. …………… 1.2 Структура, свойства, распространение вирусов гриппа А и В…………………….. 1.3. Распространение вирусов гриппа птиц в мире ……………………………………... 1.4. Интродукция вируса гриппа птиц в человеческую популяцию…………………… Глава 2. Вирус полиомиелита, распространение, структура, свойства … ………. Глава 3. Сорбенты, взаимодействие их с вирусами, белками и нуклеиновыми кислотами и области применения …………………………………………………….. 3.1. Сорбция как метод удаления веществ из разных средств…………………………... 3.2. Взаимодействие микро и наноразмерные сорбентов с вирусами и другими биологическими объектами, иммуносорбенты………………………………………….. 3.3. Наноалмазы, структура и свойства, перспектива использования в качестве сорбентов для вирусов …………………………………………………………………………………. 3.4. Влияние наночастиц на клетки in vitro и in vivo ……………………………………. Глава 4. Взаимодействие белков, нуклеиновых кислот, вирусов с материалами, содержащими Ag; использование препаратов в медицине, биологии и для дезинфекции воды; исследования их токсичности……………………………………. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ……

Глава 1. Материалы и методы исследований …………………………………………. 1.1. Вирусы гриппа А и В ……………………

1.2 Вирус полиомиелита, вакцинный штамм Сэбина тип 1……… ………………….. 1.3 Клеточные линии……………………………….. ………………………………….. Сорбенты …………………………………………………………………………….. 1.4.

1.4.1 неорганические - шихта и детонационные наноалмазы…………………. 1.4.2. композиты ДНА содержащих материалов с полианилином …………….. 1.4.3 углеродные нанотрубки……………………………………………………… 1.4.4. органические -полианилиновые трубки ……………………………………. 1.4.5. композиты --полианилиновые нанотрубки с содержанием Ag 30% и.

полианилиновые гранулы с содержанием Ag 70%………………………………… 1.5. Иммунные сыворотки к эталонным штаммам вируса гриппа ……………… 1.6. Культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах…………………….. 1.7 Культивирование вирусов гриппа на культуре клеток MDCK ……………… 1.8. Реакция гемагглютинации (РГА).……………………………………………… 1.9. Определение инфекционного титра вирусов гриппа………………………. …. 1.10. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)…………………….. ………… 1.11. Получение концентрированных препаратов вирусов гриппа проводили дифференциальным центрифугированием………………………………………….. 1.12. Метод изучения взаимодействия биологических материалов с сорбентами……………………………………………………………………………… 1.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле ……………………………… 1.14. Получение фрагментов ДНК…………………………………………………… 1.15. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле…………………………… 1.16. Влияние сорбентов на биологические объекты in vitro…………………….… 1.17. Влияние сорбентов на биологические объекты in vivо…………………… …. 1. 18. Определение формулы крови иммунных животных…………………………… 1.19.Электронная микроскопия сорбентов……………………………………………. 1.20. Статистическая обработку результатов ………………………………………… 1.21. Элементный анализ ДНА материалов ………………………………………………… 1.22. Инфракрасная спектроскопия (ИК спектроскопия). ………… …………………… Глава 2. Взаимодействие вирусов гриппа и ДНК с наноалмазными и полимерными материалами………………………………………………………… 2.1 Свойства наноалмазных сорбентов………………………………………………… 2.2 Взаимодействия вирусов гриппа и ДНА с наноалмазными материалам и их модификациями ……………………………………………………………………………. 2.3 Взаимодействие вирусов гриппа с ДНА содержащими материалами в зависимости от различных параметров………………………………………………………………………. 2.4. Взаимодействие вирусов гриппа и кДНК с модифицированными наноалмазами… 2.5. ИК-спектры ДНА с разной сорбционной активностью по отношению к вирусам…. 2.6. Взаимодействие вирусов гриппа с ДНА материалами, покрытыми ПАНИ………. 2.7. Сравнительное исследование УНТ и полимерных композитов, содержащих наночастицы Ag и без Ag, в качестве сорбентов вирусов гриппа А и В и к ДНК.. …. Глава 3. Деконтаминация водных растворов, содержащих вирусом полиомиелита, с помощью современных углеродсодержащих материалов и полимерных Глава 4. Изучение взаимодействия альбумина и иммуноглобулинов с ДНА содержащими материалами и композитами полианилина с Ag и без Ag……. Глава 5. Исследование влияния сорбентов на биологические объекты опытах in vivo и in vitro…………………………………………………………………………………….. 5.1.Влияние сорбентов на клетки MDCK и репродукцию вирусов гриппа…………. 5.2 Влияние сорбентов на основе ПАНИ на животных…………………………………. 5.3.Исследование влияние введения животным комплексов ДНА+вирусы гриппа ….. Обсуждение результатов ………………………………………………………………… Список литературы…………………………………………

Список публикаций по теме диссертации……………………………………………… Список сокращений и условных обозначений……………………………………… …

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение Актуальность темы исследования. Циркуляция в биосфере патогенных микроорганизмов среди восприимчивых организмов - человека, млекопитающих, птиц определяет актуальность разработки средств и методов их дезактивации и удаления из среды. Распространение вирусных инфекций может осуществляться несколькими путями, среди которых наибольшую опасность по масштабности вовлечения в эпидпроцесс представляют воздушно-капельный и водный [43]. Водная среда поддерживает жизнеспособность в природе энтеровирусов, вирусов гепатита А, аденовирусов, а также вирусов гриппа птиц. Инфицирование в начале ХХ1 века людей и животных вирусами гриппа птиц А(H5N1), А(H7N7), А(H7N3), А(H9N2), а с 2013г. -А(H7N9) представляет риск формирования нового пандемического варианта [120,184,185,186,187]. Одним из примеров стало появление в апреле 2009г. вируса гриппа свиней - тройного реассортанта А(H1N1)pdm 09 вирусов гриппа птиц, свиней и человека. Его широкое распространение среди людей вынудило ВОЗ объявить уже в июне 2009 г. 6-ую фазу пандемии [43,120,144].

Массовые заболевания полиомиелитом у людей, вызываемого полиовирусом, обусловили проведения исследований с вакцинным штаммом вируса полиомиелита Сэбина типа 1, поскольку он присутствует в списке вирусов, необходимых при исследовании эффективности вирулицидного действия дезинфицирующих средств [53]. Удаление биологических патогенов из водных растворов может быть осуществлено с помощью фильтров, состоящих из веществ, способных адсорбировать микроорганизмы.

Состояние научной разработанности проблемы. Наиболее древними в истории человечества были угольные сорбенты, в состав которых входил древесный уголь. В дальнейшем в качестве сорбентов для вирусов гриппа были предложены: силикатные пористые сорбенты [19], соли BaSO4 [20], анионообменные смолы [63], макропористое стекло из расплава кремниевого и борного ангидридов [78], модифицированный гидротермической обработкой графит [27]. В настоящее время актуальным является поиск новых методологических решений для усовершенствования защитных мер (высокоэффективных сорбентов) с привлечением современных достижений различных областей науки, в том числе и быстро развивающейся нанотехнологии. Как показали исследования, наноразмерные материалы обладают физико-химическими свойствами (оптическими, магнитными, электрическими, сорбционными и др.) отличными от своих макроскопических аналогов [60]. Так, например, для применения в сорбционных процессах были разработаны нанопористые адсорбенты с серосодержащими функциональными группами. Открытые в России в 60-е годы 20 века детонационные наноалмазы (ДНА) и их аналоги синтезируют, исследуют и некоторые из них используются в промышленности [64,168]. Они также представляют интерес для биологов за счет наличия на них поверхностных радикалов, содержащих атомы неуглеродной природы (О, Н, N, S), обуславливающей способность сорбировать биологические объекты [161]. Эти свойства позволяют рассматривать применения ДНА в качестве медицинских средств в терапии как носителей лекарств к пораженным клеткам, комплексы ДНА с ферментами - для создания новых тест систем, для сорбции бактерии, например, Е. coli [86, 136]. К началу наших исследований по взаимодействию ДНА с вирусами было известна только работа по возможности использовать ДНА, соединенных с конковалином А, при создании вакцины против ВИЧ инфекции [111]. Это обусловило наш интерес по исследованию ДНА материалов с вирусами, отнесенными к другим семействам. Интерес к другому классу соединений - полимерных композитов был обусловлен открытием способности полианилина сорбировать вирусы [29]. Создание из полианилиновых нанотрубок композитов с включением ионов Ag представило для нас интерес относительно их взаимодействий с вирусами. Исследование композитов полианилиновых нанотрубок с Ag обусловлено известными антибактериальными свойствами этого материала [83], то есть возможно получение материалов, как с антивирусными, так и антибактериальными свойствами. Одно из современных течений в нанотехнологии является создание соединение композитов, материалов, в состав которых добавлены ионы Au, Fе, Ag, Ti, Ni металлов, которые, возможно, изменят их физико-химические свойства [93, 89, 151, 173].

Магнитные сорбенты, содержащие ионы Fe, предлагалось использовать для селективного концентрирования вирусы гриппа А/Н5N1 [17], для детекции гемагглютинина вирусов гриппа А/Н5N1 [128]. Недавно появившаяся новая отрасль науки нанотоксикология ставит своей задачей изучение влияния на биологические объекты наноматериалов.

Исторически углеродсодержащие материалы рассматриваются как инертные с минимальной реактивностью для клеток тела [110]. Наноразмерные формы углерода имеют свои особенности. Исследования in vitro на разных клетках показали, что наноалмазы более толерантны к клеткам, чем многие другие углеродсодержащие материалы -нанотрубки и фуллерены [161]. Исследования влияния ДНА-содержащих материалов на жизнеспособность животных (белых мышей и белых крыс), количество лейкоцитов в их крови, изменения органов после перорального введения или инъекций показало, что эти показатели зависят от количества, частоты и способа введения ДНАсодержащих проб [59]. Однако, этот вопрос требует дальнейшего изучения. Представляло интерес изучить некоторые аспекты этой проблемы относительно взятых для исследования сорбентов.

Таким образом, является актуальным получение новых данных по взаимодействию вирусов с разными представителями углеродных и полимерных материалов. Это создает основу для создания в будущем современных высокоэффективных противовирусных фильтров и сорбентов, а также устройств для создания новых тест-систем для диагностики вирусных инфекций.

Цель исследования. Изучить способность и условия сорбции вирусов гриппа человека и птиц, полиовируса (вакцинного штамма Сэбина типа 1), ряда белков, фрагментов ДНК на современные детонационные наноалмазные материалы, их модификации и полимерные композиты полианилина различной структуры, содержащие серебро и без него.

Задачи исследования:

1. Изучить взаимодействие эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа человека и птиц с рядом новых материалов различной природы, состоящих из микро- и наноразмерных частиц на основе: 1) углеродных материалов в виде углеродных нанотрубок, наноалмазных частиц и их производных, 2) проводящих полимеров на основе полианилиновых нанотрубок, композитов -полианилиновых нанотрубок и гранул, содержащих серебро.

2. Исследовать влияние ряда физических (температуры и времени воздействия), и биологических (систем культивирования и степени очистки вирусов) факторов на эффект сорбции вирусов гриппа на модифицированными различными методами детонационные наноалмазные материалы,.

3.Изучить сорбцию фрагментов ДНК на различные наноалмазные и полимерные наносорбенты.

4.Исследовать взаимодействие вируса полиомиелита на модели вакцинного штамма Сэбина типа 1 с наноалмазными и полимерные наносорбентами.

5.Установить возможность использования выбранных сорбентов для удаления из растворов белков невирусной природы - бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулинов из иммунных сывороток.

6. Оценить влияние выбранных сорбентов на биологические объекты в опытах in vivo и in vitro.

Объект исследования. Эталонные, эпидемические, пандемические штаммы вирусов гриппа А и В, циркулировавшие в России и в мире в период с 1999 по 2013 годы; вирусы гриппа птиц с гемагглютинином Н5( реассортанты А(Н5N1) и А(Н5N2)); полиовирус вакционного штамма Сэбина тип 1, фрагменты ДНК ( полученные в результате амплификации РНК вирусов гриппа), иммуноглобулины.

Предмет исследования. Изучение взаимодействия вирусов гриппа человека, птиц, реассортантов, полиовируса, иммуноглобулинов, фрагментов ДНК с современными наноразмерными сорбентами различной природы (наноалмазные материалы и полимерными композитами) в зависимости от различных факторов: структуры биологических объектов, степени их очистки и методов культивирования, времени контакта объектов с сорбентами, температуры среды, концентрации вирусов и сорбентов в растворе. Изучение влияния сорбентов на состояние культуры клеток и животных, используемых для вирусологических исследований.

Теоретические и методологические основы исследования. В основу научноквалификационного исследования легли вопросы вирусологии, дезинфектологии. В работе применяли общенаучные и специальные методы исследования (методы культивирования вирусов и лабораторной медицинской диагностики, молекулярно-биологические методы изучения структуры и свойств вирионов).

Информационная база исследования. В качестве информационных источников использовали научные публикации российских и зарубежных исследователей, представленных в журналах и книгах, материалы конгрессов и конференций, состоявшихся в РФ и за рубежом, методологические инструкции и указания, инструкции к использованным в работе тест системам.

Основные научные результаты исследования, полученные лично автором.

Автором разработан метод удаления вирусов из водных растворов с помощью детонационных наноаламазных материалов. Проведена оценка влияния температурных, временных, количественных параметров, состава среды и антигенных свойств вирусов гриппа на сорбционное взаимодействие вирусов с изучаемыми сорбентами, проведена модификация наноалмазов (хлорирование, графитизация), изучено взаимодействие наноматериалов с вирусами полиомиелита, изучено влияние присутствия Ag в ПАНИ нанотрубках на сорбцию вирусов гриппа, полиомиелита, фрагменты ДНК. Проведена иммунизация животных, рассмотрено влияние исследуемых наноматериалов на клетки культуры тканей МDСК и гемопоэз лабораторных животных. Проведены анализ и интерпретация полученных данных. Впервые установлена способность детонационных наноматериалов и их модификаций, композитов ПАНИ- нанотрубок и гранул, содержащих Ag и без него, сорбировать вирусы гриппа А и В из растворов (физиологического раствора, раствора культуральной питательный среды Игла МЕМ, аллантоисной жидкости куриных эмбрионов), фрагменты ДНК из ФР.

Впервые установлена способность детонационных наноматериалов (шихты, наноалмазов, их модифицированных аналогов), композитов полианилинаполианилиновых нанотрубок, полианилиновых нанотрубок и гранул, содержащих серебро, сорбировать вирусы гриппа А и В из растворов (физиологического раствора, раствора культуральной питательный среды Игла МЕМ, аллантоисной жидкости куриных эмбрионов).

Впервые обнаружена способность детонационных наноматериалов (шихты, наноалмазов, их отобранных модифицированных аналогов, композитов полианилина полианилиновых нанотрубок, полианилиновых нанотрубок и гранул, содержащих серебро) сорбировать фрагменты ДНК из физиологических растворов.

Впервые выявлена способность детонационных наноматериалов (шихты, наноалмазов и их модифицированных аналогов) и полианилиновых нанотрубок, и гранул, содержащих и не содержащих серебро, сорбировать полиовирус (вакцинный штамм Сэбина тип 1) из раствора культуральной питательной среды Игла МЕМ.

Впервые установлено, что введение частиц серебра в структуру полианилиновых нанотрубок и гранул повышает их адсорбционную способность относительно вирусов гриппа А и В, фрагментов ДНК, полиовируса (вакцинного штамма Сэбина типа 1).

Положения, выносимые на защиту:

1. Вирусы гриппа и фрагменты ДНК ( полученные в результате амплификации участков РНК вируса гриппа) активно сорбируются из растворов на ДНА содержащие наноматериалы.

2. Параметры эксперимента – температура и время взаимодействия не оказывают влияния (после 15 минут контакта) на эффективность взаимодействия вирусов гриппа с исследуемыми наноматериалами.

3. Вирусы гриппа и фрагменты ДНК способны сорбироваться из растворов на полианилиновые нанотрубки, содержащие серебро и без серебра. Присутствие серебра увеличивает сорбционное взаимодействие.

4. Вирус полиомиелита (вакцинный штамм Сэбина тип 1) способен сорбироваться из растворов на наноматериалы на основе полианилиновых нанотрубок с серебром и без него, а также модифицированные наноалмазы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты по изучению взаимодействия вирусов гриппа А и В, ДНК с детонационными наноматериалами (шихтой, наноалмазами и их аналогами с модифицированной поверхностью при хлорировании, аминировании и графитизировании при разных температурах) составили предмет заявки: ” Сорбенты - наноалмазсодержащие материалы, полученные в результате детонационного синтеза и модифицированные с помощью химических реагентов; способ получения иммуносорбента на его основе; способ иммобилизации специфических антител” на изобретение № 2013117675 от 17.04.2013.

Изложенный в заявке метод может быть рекомендован для деконтаминации растворов, содержащих эпидемические штаммы вируса гриппа человека, пандемический штамм А(H1N1)pdm09, вирусы гриппа птиц из водных резервуаров в среде их обитания, фрагменты ДНК. Важно отметить, что ДНА материалы способны удалять из растворов вирус полиомиелита (вакцинный штамм Сэбина тип 1), внесенного в список вирусов обязательных для исследования антивирусных дезинфекционных средств [53].

Расширен спектр адсорбционных свойств полианилиновых материалов при добавлении в их состав серебра. Наряду с ранее установленными антибактериальным свойствами Ag содержащих материалов данные композиты обладают антивирусным активностью и могут использоваться материал для водных фильтров, обладающих как антивирусными, так и антибактериальным действием и имеющим практическое применение в медицине и быту.

Апробация результатов исследования. Результаты работ были представлены на международных симпозиумах, конференциях и выставках: VII Московском международном конгрессе “Биотехнология состояние и перспективы развития’’, 21- марта 2011; German-Russian Young Researchers Workshop on “Methods to study Influenza virus”.Berlin Germany 20-23.-09. 2011; IV Nanotechnology International Forum, Rusnanotech 26-28 октября 2011; 6th Nanosmat conference, Krakov, Poland, 17-20th October 2011; XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии 25-30 сентября 2011года, Волгоград;

IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 26-28 марта 2012г.; The Materials Research Society (MRS) Spring Meeting, Materials Research Society.

Symp. 2012 April 9-13, San Francisco, California, USA; Международной научнопрактической конференции” Фармацевтические и медицинские биотехнологии”, Москва 20-22 марта 2012; Юбилейной Всероссийской научной конференции “Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека’’ Санкт-Петербург”. 19–20 апреля, 2012 ;

Conference “ Colloids and Nanomedicine 2012” 15-17 July 2012 г., Amsterdam,The Netherlands; International conference “Options for the Control of Influenza VIII”. Cape Town, South Africa, 5-10 September 2013; 8-м Международном симпозиуме “Молекулярный Порядок и Подвижность в Полимерных Системах, 2-6 июня 2014 г. Санкт-Петербург, XII “International Conference on Nanostructured Materials”. Moscow.- 13-18 July. 2014; на XII международной специализированной выставке” Мир биотехнологии 2014”, Москва, 2014г.

работа была отмечена дипломом и медалью.

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 4 статьи в реферируемых и рекомендованных ВАК российских научных журналах, 2 статьи в американском и английском журналах, также 12 публикаций по материалам докладов в сборниках российских и международных конгрессов, и конференций. Оформлена 1 заявка на изобретение № 2013117675 от 17.04.13 РФ.

Структура и содержание диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 4 глав собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список литературы включает 189 отечественных и зарубежных источников. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, включая 24 таблицы и 26 рисунков.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Вирус гриппа птиц как источник возможных пандемических штаммов 1.1 Роль водной среды в распространении вирусных инфекций Без воды жизнь на земле невозможна. Вода является также средой обитания различных организмов: простейших (например, амеб), рыб, мелких и крупных млекопитающих (тюленей, китов и пр.). Вода содержит вещества, необходимые для питания и размножения этих организмов. В воде присутствуют продукты их жизнедеятельности, в том числе и продукты их выделения и разложения. Наряду с вышеуказанными организмами в водной среде присутствуют микроорганизмы, в том числе патогенные для живых существ, включая человека. К ним относятся бактерии и вирусы, которые используют большие и малые водоемы как среду для передачи соответствующей инфекции. Анализ существующей литературы показывает, что спектр вирусов, выделенных из воды, включает вирусы, поражающие различных представителей живого мира, обладающих различной структурой белков и типами нуклеиновых кислот. Очень широк диапазон размеров вирионов.

Недавно открытые гигантские вирусы имеют размеры до 750 нм. К ним относятся мимивирусы, поражающие амеб, отнесенные, к семейству Megaviridae [89]. У больного с диагнозом пневмония обнаружены антитела к представителю этого семейства, что предполагает потенциальную роль этих вирусов как респираторных патогенов [133].

Гигантские вирусы водорослей были впервые изолированы в водах соленых озер восточной Антарктиды в декабре 1999 г. [177 ].

Вирусы, вызывающие инфекционные болезни пресноводных и морских рыб, также распространяются через воду. В зависимости от возбудителя заболевания может носить острой или хронической характер, затрагиваются разные органы: кожа, глаза, жабры, желудочно-кишечный тракт. Геном вирусов рыб может быть представлен как РНК, так и ДНК. Вирусы рыб: Rhabdovirus, Herpesvirus, Iridovirus, Birnavirus, Fish Pox, относятся к семействам. Представители некоторых семейств вызывают заболевания рыб сходные с заболевания людей (герпес, оспа) [96, 172]. Водный путь является одним из основных для таких инфекций у людей как грипп, полиомиелит, гепатит А, ротовирусные инфекции и др.

Рассмотрим более подробно структуру и свойства вирусов гриппа, вызывающие эпидемии и пандемии в разных странах и континентах т эпизоотии у птиц и млекопитающих.

1.2 Структура, свойства, распространение вирусов гриппа А и В Вирус гриппа впервые был изолирован Ричардом Шопом в 1931 г. в США от свиней штамм A/Swine/Iova/31 [164].В 1933г. используя его методический прием- введение носоглоточных смывов от больного гриппом в нос не иммунным животным хорькам ученым В. Смиту, К. Эндрюсу, П. Лейдлоу в Лондоне (Великобритания) удалось изолировать от людей первый штамм вирус гриппа A - A/WS /33 в расшифровке A/WilsonSmith/33 [87]. Вариант этого штамма A/WSN/33, был получен в 1940 при репликации прототипного штамма в мозгу мышей [109]. В 1940г. Т.Фенсисом и независимо Магиллом Т.П. был изолирован первый вирус гриппа В- штамм В/Lee/40 [108,117]. Вирус гриппа С был открыт Тейлором в 1951 г. [174]. Вирусы гриппа, сгруппированные в рода Influenza A, Influenza B и Influenza С, принадлежат семейству Ortomyxoviridae. Кроме вирусов гриппа в это семейство входят также вирусы родов Isavirus и Thogotovirus. Антигенные свойства внутренних белков вириона (M1 и NP) определяют принадлежность вируса гриппа к определенному роду А, В или С. Дальнейшее деление вирусов гриппа А проводится согласно структуре поверхностных белков гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). В соответствии с антигенной специфичностью поверхностных гликопротеидов HA и NA в настоящее время известно 17 подтипов НА и 10 подтипов NA [82,155]. Вирусы гриппа с новым подтипом гемагглютинина H17 и нейраминидазы N10 изолированы недавно от желтоплечих листоносов - видов фруктоядных летучих мышей- в Гватемале [176].

Эпидемическое значение для людей имеют вирусы гриппа А с тремя подтипами HA (H1, H2, H3) и двумя подтипами NA (N1, N2). Вирусы гриппа А и В содержат NA и НА в качестве основных структурных и антигенных компонентов вирусной частицы, обладающих гемагглютинирующей и нейраминидазной активностями. Было показано, что у вируса гриппа С нет NA, он обладает вместо этого гемагглютинин-эстеразным белком (HEF). Геном вируса гриппа представлен однонитевой сегментированной линейной РНК.

Вирус гриппа относится к группе вирусов с "негативным" геномом. У вирусов гриппа разных типов количество сегментов РНК различно: 8 сегментов у гриппа типов А и В, длина которых для вируса гриппа А варьирует от 890 до 2341 нуклеотидов, которые кодируют белков: PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1, NS2 [132]. PB1-F2 – короткий белок вирусов гриппа A, который транслируется с рамки считывания +1 гена PB1 [98]. сегментов у гриппа типа С. Установлено, что у вирусов гриппа А и В наиболее крупные сегменты 1, 2, 3 кодируют белки полимеразного комплекса (PB2, PB1, PA); гены 4 и 6 – поверхностные гликопротеины HA и NA; ген 5-нуклеопротеин NP; 6, 7, 8 сегменты РНК являются бицистронными генами, кодируя по два белка; 6 фрагмент, кодирует NA, у вирусов гриппа А, а у вируса гриппа В и белок NВ. Сегмент 7 кодирует матриксный белок M1 и, в основном регистрируемый в клетке, мембранный белок M2 [132]. Сегмент кодирует 2 неструктурных белка NS1 и NS2, обнаруживаемые в клетке [150]. Сегменты РНК покрывают “чехол”, состоящий из NP и полимераз, образуя комплексы RNP. При этом каждый такой сегмент (комплекс) действует самостоятельно. Схематическое строение вириона вируса гриппа с расположением белков и фрагментов РНК, их кодирующих представлено на рис.1.

Рис. 1. Схематическое изображение строения вируса гриппа Электронно-микроскопические исследования показали, что форма вирусных частиц сильно варьирует. Сферическая форма примерно 80-120 нм в диаметре выявлена у длительно пассируемых лабораторных штаммов, длинные, нитевидные формы в основном присутствуют в первичном материале или в материале, прошедшем ограниченное число пассажей через куриные эмбрионы и на культуре тканей.

Для данной работы наиболее интересна структура поверхностного белка гемагглютинина (НА) - гликопротеида, который отвечает за прикрепление и последующее проникновение вируса в клетку (рис.2). Гемагглютинин составляет от 25% до 35% всех вирионных белков. На поверхности вириона может быть от 400 до 600 единиц НА. НА тример состоит из трех идентичных полипептидов, каждый из которых является комплексом НА1+НА2.

Полипептид НА1 состоит из 319-328 аминокислотных остатков, имеет молекулярную массу 50 000, НА2 представляет собой легкую цепь молекулы НА с молекулярной массой и состоит из 221-222 аминокислотных остатков [179]. Гидрофобная С-концевая область НА2 (аминокислотные остатки в позициях 185-211) находится в липидном бислое, аминокислоты в позициях 211-221 – в вирионе. Гемагглютинин содержит 3-9 связанных гликозидных цепочек в одной молекуле мономера НА. Наличие углеводных цепочек влияет на гемагглютинацию, отсутствие последних приводит к потере данного свойства. В зависимости от клетки-хозяина изменяется число цепочек олигосахаридов, наибольшее количество возникает при пассирование вируса в клетках млекопитающих [163].

Рис.2. Схематическое изображение мономера гемагглютинина вируса гриппа А Аминокислотная последовательность определена для большого числа НА вирусов гриппа А и В. В настоящее время она определяется методами секвенирования гена, кодирующего НА. На поверхности головки мономера НА расположены антигенные сайты А, В и С, рецепторный сайт. Изменения в аминокислотах, входящих в эти сайты, приводят к появлению новых эпидемических штаммов, способных преодолеть иммунитет населения и вызвать очередную эпидемию гриппа.

Изменчивость – особенное свойство вируса гриппа, приводящее к изменению структуры вирионных белков, что в конечном счете может привести к появлению новых эпидемических или достаточно редко пандемических штаммов. Изменчивость вирусов обусловлена двумя разными механизмами – антигенным дрейфом и антигенным шифтом.

Изменения в геноме вируса гриппа в результате точечной замены нуклеотидов в разных областях нуклеотидных последовательностей могут привести в зависимости от места локализации к замене аминокислоты или к так называемым молчащим мутациям, которые не приводят к замене аминокислоты. Если мутации затрагивают области гена гемагглютинина, которые кодируют аминокислоты, формирующие «головку»

гемагглютинина, особенно антигенные или рецепторные сайты, то это может привести к появлению, новых эпидемических штаммов. В качестве примера антигенной изменчивости- почти ежегодное появление новых штаммов вирусов гриппа А(Н3N2), и реже у А(Н1N1) и В. Рецепторная специфичность вирусы гриппа в процессе эволюции выявлена у подтипов А( Н1N1) и А(Н5N1). Рецептор-связывающий сайт находится на «верхушке» головной части первой субъединицы гемагглютинина НА1: в него входят аминокислоты в положениях 190-198, 133-138, и 220-229. Клеточный рецептор для вирусов гриппа А представлен двумя основными типами ковалентной связи терминального остатка нейраминовой кислоты со следующим моносахаридом в составе сиалогликанов: 2-6 (для НА эпидемических штаммов) и 2-3 (для НА штаммов, изолированных от птиц).

Искусственные замены в рецепторном сайте НА может привести к усилению патогенных свойств вируса гриппа в лабораторных условиях [40].

Реассортация обусловлена сегментарностью генома вируса гриппа. Благодаря этому свойству возможно возникновение вирусов – реассортантов, содержащих набор генов разного происхождения: часть генома вирусов гриппа птиц, различных млекопитающих и человека. Наиболее наглядный пример реассортации это геномы пандемических штаммов двадцатого – двадцать первого века.

Самая большая пандемия гриппа, названная «испанкой», охватила большую часть населения Земли и привела к гибели в 1918-1919 гг. более 40 млн. человек.

Филогенетические данные предполагают, что вирус А(H1N1), вызвавший пандемию, произошел от вируса птиц и перешел к людям и свиньям до 1918г. [181].

Пандемия 1957-1958 гг. была вызвана азиатским вирусом А/Сингапур/57 А(Н2N2), который содержал 3 гена (PB1, HA, NA) от вирусов гриппа птиц и остальные гены от циркулировавшего до этого вируса гриппа человека А(H1N1) [129].

В 1968г. пандемия была вызвана новым пандемическим вирусом гриппа А/Гонконг/1/68(Н3N2), у которого 2 гена (PB1 и HA) были, возможно, от вируса гриппа уток и 6 генов - от вирусов гриппа А(Н2N2), до этого циркулировавшего у людей [181].

В 1977г., вирус А(H1N1) вызвал большую эпидемию, по мнению некоторых ученых, пандемию. Она охватила в основном, молодое поколение в возрасте до 20 лет,.

Практически полное сходство структуры белков вирусов гриппа А(H1N1)77 и белков штаммов А(H1N1), изолированных в 1950г., послужило основанием для версии, что штамм А(H1N1)77 результат лабораторной утечки вируса [76]. В 2009 г. ВОЗ объявил 11 июня 2009г. о начале пандемии гриппа XXI века. Пандемический штамм А/Калифорния/07/ (H1N1) pdm09 - был тройным реассортантом. Все восемь сегментов генома происходят от вирусов гриппа птиц и в составе различных вирусов были получены свиньями непосредственно от птиц или через промежуточного носителя (рис.3). Вирусы гриппа А(H1N1)pdm09 отличались по клиническим признакам, вызываемых у больных, такими как рвота, диарея [102], а также по возрастному спектру переболевших. 94% составляли лица старше 64 лет в случае сезонного гриппа, в случае заболеваний, вызванных вирусами гриппа А (H1N1)v, они составляли 19%. Наибольшие число случаев заболевания- 39% приходилось на возрастной диапазон 15-44 года [144]. Следует отметить, что появление новых пандемических штаммов в 1957 и 1968гг. приводило к исчезновению из циркуляции в человеческой популяции ранее доминировавшие пандемические штаммы А(H1N1) и А(Н2N2), соответственно. С 1977г. в мире стали циркулировать и социркулировать вирусы гриппа А подтипов A(H1N1), A(H3N2) и вирусы гриппа В двух эволюционных линий. С 2009 г. регистрируют вирусы гриппа A (H1N1) pdm09, A(H3N2) и вирусы гриппа В двух эволюционных линий в разных сочетаниях и с разной интенсивностью [46,166].

Рис.3. Происхождение вирусов гриппа А (H1N1)v [144].

1.3. Распространение вирусов гриппа птиц в мире Вирусы гриппа А активно циркулируют в мире. Они инфицируют не только человека, вызывая эпидемии и пандемии, но и многие виды млекопитающих, в их число входят свиньи, верблюды, лошади, хорьки, тюлени, киты. Вирусы гриппа вызывают эпизоотии среди диких и домашних птиц, кур и особенно уток. Вирус гриппа В поражает только людей. В настоящее время известно 116 вирусов с различными сочетаниями подтипов гемагглютинина и нейраминидазы. Большинство из них -114 изолировано от диких и домашних птиц [82]. Большинство вирусов с разным сочетаний гемагглютинина и нейраминидазы изолировано от диких и домашних птиц, главным образом от птиц, водного и околоводного комплекса (дикие и домашние утки, гуси, чайки и т.д.) Близкий контакт человека и животных способствует переходу в обе стороны вирусов - инфицированию людей вирусами гриппа птиц и млекопитающих и наоборот.

За 5 лет до появления вируса гриппа А (Н3N2), вызвавшего пандемию в 1968г., были выделены два штамма вируса гриппа: А/лошадь/Майами/1/63 (Heq2Neq2) и А/утка/Украина/1/63 (Hav7Neq2). Гемагглютинин и нейраминидаза здесь обозначены по старой классификации вирусов гриппа. Гемагглютинин вирусов, выделенных от лошадей и уток, оказался антигенно близкими НА штамма А/Гонконг/1/68 [182]. Эти факты свидетельствовали о циркуляции еще в 1963г. в генном пуле вирусов гриппа птиц и животных гена гемагглютинина, который в составе вируса А/Гонконг/1/68 вызвал пандемию среди людей.

Отсутствие регистрации в человеческой популяции ранее доминировавших пандемических штаммов не свидетельствует о полном их исчезновении. Вирус или его гены могут продолжать циркулировать в природе. Наглядный пример циркуляция вирусов гриппа A(H2N2) после их исчезновения из человеческой популяции в 1968 г. В животном мире вирусы гриппа A(H2N2) продолжали циркулировать в птичьих популяциях у диких и у домашних птиц (1975, 1979, 1983). Серологическая диагностика вируса A(H2N2) была проведена с положительными результатами в 157 индюшачьих фермах в различных частях США в 1988-1989 гг. Заболевания, вызванные вирусом А(H2N2) в инфицированных стаях, варьировали по клинике от бессимптомных до бурных респираторных поражений с высокой смертностью в некоторых стаях. Двадцать восемь штаммов вирусов гриппа A(H2N2) были изолированы от птиц на рынках США в 1990-1991 г. Таким образом, после исчезновения в 1968 г из человеческой популяции вирусы гриппа A(H2N2) или их гены в составе других вирусов продолжали активно персистировать у птиц.

Заболевание гриппом у птиц протекает по- разному: от бессимптомного течения до поражения центральной нервной системы, развиваются параличи, многие птицы гибнут в течение недели. У других птиц болезнь протекает по типу острой кишечной инфекции. У третьих появляется кашель, насморк. Следует иметь ввиду, что вирус гриппа у птиц размножается как в респираторном, так и в кишечном тракте [44]. Вирус А(Н5N1) является самым вирулентным вирусом гриппа птиц, как показали исследования вирусов в течении 40-летнего наблюдения за циркуляциями и свойствами вирусов гриппа птиц [180]. Столь высокая вирулентность обусловлена чувствительностью гемагглютинина к клеточным протеазам, приводящим к расщеплению молекул гемагглютинина на субъединицы НА1 и НА2. Водоплавающие птицы передают вирусы гриппа фекально-оральным путем через контаминированную воду [118]. Вирусы гриппа реплицируются в основном в клетках, выстилающих кишечник, и выделяются в высоких концентрациях в фекалиях. Сохранение вируса в воде зависит от ряда факторов: концентрация солей, рН и температуры. При 17 oC некоторые штаммы остаются инфекционными до 207 дней, при 4 oC значительно более длительное время [169,170]. Через контаминированную воду возможна передача вирусов другим особям, в том числе, новым хозяевам, а также возникновение в них реассортантных вирусов, содержащих различные гены вирусов птиц. Сезонная смена среды обитания птиц, пути их миграции, оказывают существенное влияние на распространение генного пула.

Птицы, мигрирующие вдоль континента по долготе, возможно, играют ключевую роль в процессе эволюции вирусов гриппа. Гены NP вирусов гриппа птичьего происхождения были идентифицированы в вирусах, изолированных в Европе: А/Норка/Швеция/ (Н10N4), А/Свинья/ Нидерланды/ 85 (Н1N1), А/Свинья/Германия/81 и в вирусах, изолированных в северо-восточном Китае А/Лошадь /Юлин /89 (Н3N8). Поэтому циркуляция вирусов гриппа у индюков, лошадей и свиней рассматривается как механизм реассортации генов вируса гриппа, изолированных из разных мест земного шара.

1.4.Интродукция вируса гриппа птиц в человеческую популяцию Активная циркуляция вирусов гриппа у птиц и в случае близкого контакта с заболевшей птицей может и приводит к инфицированию людей этим вирусами. При инфицировании человека вирусом гриппа птиц наблюдается повышение температуры, катаральные симптомы (ринит, боль в горле). При этом у 50% больных наблюдается дисфункция желудочно-кишечного тракта в виде повторной рвоты и диареи.

Вирусы гриппа птиц с подтипами гемагглютинина А/Н5, А/Н7, А/Н9, А/Н6 вызывают заболевания у людей. Эти вирусы обладают различными сочетаниями этих подтипов гемагглютининов и подтипами нейраминидаз. Наибольшей патогенностью для человека характеризуются вирусы с подтипом гемагглютина А/Н5. Более 50% заболеваний заканчиваются летальным исходом [189].

Впервые идентификация вирусов гриппа птиц у больного человека была в 1997 г. в Гонконге, когда от ребенка был выделен вирус гриппа с гемагглютинином А/Н5 штамм А/Гонконг/ 97 (Н5N1). С этого времени вирус А/Н5N1 стал регулярно регистрироваться в странах Юго-Восточной Азии. Всего за период с 1997 по 2013 гг. высокопатогенный штамм вируса Н5N1 вызвал заболевания в 15 странах. Общее число заболевших, подтвержденных лабораторными исследованиями на 6 мая 2014 г. составляло 664 случая, 391 которых закончились летальным исходом. Наибольшее число случаев зафиксировано в ЮгоВосточной Азии, в Китае, Бангладеш, Камбодже, Индии, Вьетнаме и на севере Африки- в Египте [121]. Показано, что люди заражались непосредственно от инфицированных птиц.

В отдельных случаях на основании выявления специфических антител к вирусу гриппа А(Н5N1) можно было предположить на возможность передачи вируса от человека к человеку. Начиная с 2004 г., в этом регионе стал циркулировать вирус с большей патогенностью, и как результат, заболевание заканчивалось в 59% случаев летальным исходом. В РФ с июля 2005 г. были выявлены эпизоотии среди домашней птицы в Западной Сибири, Южном Урале и европейской части нашей страны. На территории России были выявлены циркуляции как слабо, так и высокопатогенных штаммов вирусов гриппа А(Н5N1), но инфицирование людей не было зафиксировано [35, 81].

В марте 2003 г. в Нидерландах была выявлена вспышка гриппа, вызванная высоко патогенным штаммом А(Н7N7). Из 89 заболевших 78 пациентов имели симптомы конъюнктивита, остальные – симптомы ОРВИ и конъюнктивита или стертую симптоматику. В марте 2004 г. в Канаде были выявлены 2 случая заболевших с диагнозом гриппа А(Н7N3), который был подтвержден лабораторно [122]. С 2013 г. начали регистрировать лабораторно подтвержденные случаи инфицирования людей вирусом гриппа птиц А(Н7N9). В основном эти случаи были отмечены на востоке Китая.

Молекулярно-генетические исследования показали, что они представляют собой реассортанты, гены которых идентичны генам вирусов птиц, выделенных в разных странах Южной Корее, Чешской республике, Китае в период 2005-2011 гг. [135]. Вирусы гриппа А(Н9N2) были идентифицированы в Гонконге в 1999 – 2003 гг. Заболевания были средней тяжести, летальные исходы не были зарегистрированы [147, 160].

Вирус гриппа птиц А(Н6N1) был впервые зарегистрирован в 2013 г. на Тайване. Ранее о перенесении данной инфекции определяли по серологическим признакам ретроспективно [119].

В 2012 г. в США были зарегистрированы инфицирования людей вирусами гриппа свиней А(Н1N2) и А(Н1N1) [120].

Таким образом, приведенные данные показывают возможность инфицирования людей вирусами гриппа птиц и животных. Межвидовой переход вируса гриппа зависит от очень многих факторов и происходит достаточно редко, в основном, в юго-восточной Азии.

Такими факторами являются: близкий контакт с больной птицей (рынки, птицеводческие фермы, домашние хозяйства), отсутствие иммунитета у населения к данному вирусу, скученность населения, климатические и географические условия (теплый климат, наличие водных резервуаров). Важную роль играет такое свойство вируса как патогенность возбудителя, которое определяется особенностью структуры генома (наличие мутаций в определенных сайтах в молекуле гемагглютинина), рецепторной специфичностью данного вируса и др. факторами [6].

Резюме к главе 1.

В главе 1 рассмотрена роль водной среды в распространении инфекций, вызванных вирусами разных размеров (от 25 до 750 нм) структуры (ДНК и РНК содержащих), поражающих разных представителей мира растений и животных а также человека.

Основное внимание уделено описанию истории открытия классификации, строения и особенностей свойств вирусов гриппа А и В, обусловливающих их широкое распространение среди мира животных, способности вызывать эпидемии и пандемии у людей, эпизоотии у животных и птиц. Описаны случаи идентификации вирусов гриппа с гемагглютининами подтипов А/Н3, А/Н2, типичных для вирусов гриппа человека в мире животных и птиц. Показано, что репликации вирусов в организме птиц происходят в респираторном и желудочно-кишечном тракте и затем выделяются во внешнюю водную среду с фекалиями. Описаны случаи интродукции вирусов гриппа птиц с гемагглютининами А/Н5, А/Н7, А/Н9 в человеческую популяцию в конце 20-го и начале 21-го века. Приведенные литературные данные обусловливают важность выбора вирусов гриппа в качестве вирусной модели для исследовательских работ по изучению взаимодействия вирусов с сорбентами в водной среде.

Глава 2. Вирус полиомиелита, распространение, структура, свойства Полиомиелит – болезнь, известная еще в древнем Египте (14-19 века до нашей эры).

Описание паралитических заболеваний имелись уже во времена Гиппократа — древнегреческого врача (460- 356-377 до н. э.). В 1840 г. немецкий ортопед Гейне (J. von Heine) выделил полиомиелит как самостоятельную болезнь, а шведский педиатр Медин (Medin K., 1890) отметил его эпидемическое распространение и предположил инфекционную природу. Название полиомиелит - воспаление серого вещества спинного мозга впервые предложено немецким врачом А. Кусмаулем (1822-1902 гг.). В конце XIX — начале XX века эпидемии полиомиелита стали часто возникать в странах Европы и Северной Америки. В 40-х — начале 50-х гг. заболеваемость полиомиелитом резко возросла во многих европейских странах, США, Канаде, Австралии. Для полиомиелита характерна сезонность: в странах умеренного климата – летне-осеннее, в тропиках – в период дождей. Заболевания с тяжелыми исходами (до 10% летальности и 50 % остаточных параличей) зарегистрированы практически во всех странах мира [ 21].

В естественных условиях полиомиелитом заболевает только человек.

Инфицированный человек выделяет вирусы со слизью носоглотки и верхних дыхательных путей (в последние дни инкубации и первые дни острого периода) и с фекалиями (в первые недели заболевания или в течение одного – двух месяцев или редко – в течение периода большей длительности). Основной путь передачи фекально-оральный. Инфицирование воды, продуктов питания, сточных вод, обусловлены выделением вирусов из фекалий.

Инкубационный период 7–14 дней (может варьировать от 2 до 35 дней). Полиовирус размножается в лимфоидных клетках слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

Разрушая эти клетки при размножении, вирус переходит в слизистое отделяемое ротоглотки и ротовой полости, в фекалии. Почти у восьмидесяти процентов инфицированных лиц инфекция протекает бессимтомно, у 15% - как легкое или средней тяжести лихорадочное заболевание, у 0,1 -1% инфекция протекает с поражением ЦНС – параличами, парезами, в организме образуются специфические антитела. Формируется пожизненный иммунитет [15].

Установлено, что полиомиелит вызывает 3 антигенно различных вируса (полиовирусы, получившие название вирусы полиомиелита типа 1, 2, и 3. Иммунитет к одному из них не создает зашиты от других типов. В середине прошлого века около восьмидесяти процентов всех паралитических случаев полиомелита вызывались вирусом первого типа [95].

Вирус входит в состав семейства пикорнавирусов (Picornaviridae). Это одно из самых больших вирусных семейств, название которого происходит от итальянского "pico" маленький и RNA (РНК- рибонуклеиновая кислота) относится к числу кишечных вирусов Семейство Picornaviridae состоит из девяти родов: Enterovirus и другие рода [44 ].

(сборник Львова 2008). Вирус полиомиелита (типы 1-3) относится к роду Enterovirus, (от греческого Enteroh – что в переводе означает кишечник), в который входят и группы неполимиелитных энтеровирусов. Пикорнавирусы, поражающие желудочно-кишечный тракт, являются безоболочечными вирусами, не имеющие липидной оболочки.

Геномная РНК является инфекционной и при репликации пикорновирусов выступает в качестве мРНК. Инфекционность геномной РНК примерно в 10 раз меньше, чем у интактной вирусной частицы. Капсид имеет икосаэдрическую симметрию с субъединицами, каждая из которых состоит из 5 протомеров. Протомер состоит из полипептидов: VP1, VP2, VP3, VP4, которые являются производными протомера VP0.

Диаметр вириона 27-30 нм, длина генома примерно 25 нм. Репликация пикорнавирусов происходит в цитоплазм. РНК пикорнавирусов транслируется полисомами, синтезируется один полипептид. Этот полипептид имеет области с протеолитической активностью цистеинпротеазы, благодаря чему он разрезается на 3 белка-предшественника: Р1, Р2 и Р3.

Белок Р1, в свою очередь, расщепляется VP0, VP1 и VP3, VP0 образует VP2 и VP4. Р2 и Р не являются источниками структурных белков. Белки, происшедшие из Р3, являются вирусной репликазой и ферментами, которые модифицируют поведение клетки – хозяина.

Р2 – источник белков, модифицирующих клетку.

Основная часть заболеваний полиомиелита спорадических и эпидемических, связана с вирусом типа I. Установлена способность вируса полиомиелита размножаться в культурах не нервных клеток приматов с разрушением этих клеток в результате цитопатического действия [104 ].

Вирусы рода Enterovirus характеризуются устойчивостью к обработке эфиром, дезоксихалату и ряду других детергентов, стабильностью при рН 3.0 – 10.0. Полиовирус инактивируется в течение 30 мин при t° 50°C и при пастеризации. Кипячение и автоклавирование почти немедленно инактивируют его. При комнатной температуре вирус сохраняется в течение нескольких дней, при 4—6°C — в течение нескольких недель или месяцев, в замороженном виде при Т = -20°C и ниже — в течение многих лет. Быстро инактивируют вирус высушивание, действие ультрафиолетового излучения, свободного остаточного хлора (0,3—0,5 мг/л), формальдегида (в концентрации 0,3% и выше) [3 ].

Массивное выделение вируса полиомиелита с фекалиями в окружающую среду создает возможность его распространения через воду, пищевые продукты, руки, а также мухами. В городских сточных водах вирус может обнаруживаться в течение всего года. Обычные методы обработки не всегда освобождают их от вируса. Известны случаи выделения полиовируса из водопроводной воды.

К факторам, способствующим распространению вируса, относятся скученность населения, перенаселенность жилищ, отсутствие водопровода и канализации, нарушение санитарно-гигиенических правил, особенно в детских учреждениях.

Полиомиелитные вакцины являются единственным средством борьбы с полиомиелитом [44]. Из культуральных вирусов, разработанных Д. Солком, была создана трехвалентная инактивированная формалином вакцина[159]. Затем А.Сэбином были получены аттенуированные штаммы 1-го, 2-го и 3-го типов [158 ]. Эти штаммы были использованы для получения живой вакцины против полиомиелита 1959 г. в СССР [41 ].

Введение в практику инактивированной (1953г.), а затем живой вакцины обусловило резкое снижение заболеваемости полиомиелитом в Европе, Северной Америке и ряде стран других регионов. Использование вакцины позволило снизить заболеваемость, носившую эпидемический характер в 3-5 раз. Недостатком живой вакцины является вызываемой ею редкие случаи вакциноассоциированного паралитического полиомиелита (1 случай на тысяч вакцинированных), реверсия вакцинного вируса в кишечнике привитых к вирулентному фенотипу и чрезвычайно редкие случаи многолетнего носительства и выделения реверсировавшего вакцинного вируса. Полная ликвидация полиомиелита не может быть осуществлена в настоящее время из-за невозможности проведения полной вакцинации по разным причинам и трудно диагностируемых неустранимых случаев многолетнего носительства и выделения реверсивного вируса.

Резюме к главе Полиомиелит – болезнь, известная уже более 2000 лет, получила широкое распространение в мире начиная с конца 19 – начала 20 века. В тексте главы приведены клинические проявления заболевания. Указано, что основной путь передачи инфекции – фекально-оральный. Возбудитель – безоболочечные РНК содержащие вирусы, которые по своим свойствам и структуре относятся к семейству Picornaviridae. Основная профилактика –вакцинация населения. Из разработанных 3-х аттенуированных вирусов, используемых при приготовлении вакцин, штамм Сэбина типа 1 является наиболее устойчивым к химическим воздействием. Он включен в список обязательных вирусов, использованных при изучении различных дезсредств. Поэтому в качестве второй вирусной модели для исследований взаимодействия вирусов с сорбентами был выбран вакцинный штамм Сэбина типа 1.

Глава 3. Сорбенты, взаимодействие их с вирусами, белками и нуклеиновыми кислотами и области применения Сорбция как метод удаления веществ из разных средств 3. Эта глава посвящена сорбентам, которые могут быть использованы или уже используется для сорбции вирусов и других биологических объектов из водных растворов.

Слово сорбент происходит от лат. sorbens, родительный падеж sorbentis — поглощающий.

В настоящее время приняты следующие названия сорбционных процессов.

Сорбция - поглощение твердым телом или жидкостью какого-либо вещества из окружающей среды. Разновидности – адсорбция, абсорбция, хемосорбция.

Адсорбция - поглощения вещества из газовой или жидкостной среды поверхностным слоем твердого тела (адсорбента) или жидкости.

Абсорбция - поглощение вещества из газовой или жидкой среды всей массой другого вещества (абсорбента).

Хемосорбция - поглощение вещества поверхностью какого-либо тела (хемосорбента) в результате образования химической связи между молекулами вещества и хемосорбента.

Иммуносорбция – (Иммуно- от лат. immunis - свободный, освобожденный) – извлечение антител или антигенов из сложных смесей с помощью иммуносорбентов, основанное на реакции антиген-антитело («Энциклопедический словарь медицинских терминов», 1982).

Впервые употреблять сорбенты в для профилактики заболеваний предложил средневековый персидский учёный, философ и врач Авиценна ( Абу Али Хусейн ибн Абдаллах ибн Сина) (980- 1037). В Древней Греции, Индии, Египте использовали сорбенты для очистки организма от ядов, токсинов. Активированным углем дезинфицировали раны, принимали во внутрь как сорбент. Кроме угля в качестве сорбентов использовали туф, глину и природные компоненты, которые обладали очищающим действием. Они применялись от желтухи, дизентерии, различных отравлениях. На Руси в тех же целях использовали древесный или березовый уголь http://www.medmoon.ru/krasota/.

Интерес к сорбентам возобновился в начиная с тридцатых годах ХХ века, когда начали разрабатывать и начиная с 60-х применять гемодиализ, плазмофорез и плазмоферез для очищения крови, основанные на фильтрации и сорбции компонентов крови. Слово фильтр французского происхождения filtre, от позднелатинского filtrum (войлок) - прибор, приспособление или пористое тело для отделения жидкости или газа от взвешенных в них частиц. Очищение крови осуществляется с использованием искусственной мембраны, которая работает как фильтр, работающий на принципе молекулярного сита (размера пор).

Для создания высокоэффективных сорбентов, наряду с применением уже известных, идет активный поиск новых материалов, в том числе с использованием новейших технологий и в последние десятилетия на стыке разных наук - в том числе нанотехнологии.

Современные наноматериалы, синтезированные учеными физиками и химиками, находят все более широкое применение в биологии и медицине. Термин нанотехнология был предложен Н. Танигучи (Япония) в 1974 г. Слово нано происходит от слова nanos, что в переводе с греческого означает карлик. Единица длины 1нм(nm) равен 10 -9 м.

Наноматериалы вызывают большой интерес из-за ряда их уникальных свойств, таких как высокие дисперсионные свойства, большая удельная поверхность, малый размер и другие свойства. Под наноматериалами подразумеваются материалы с размером от 1 до 100 нм (Нанотехнологии, 2008).

Взаимодействие микро и наноразмерных сорбентов с биологическими 3. объектами, иммуносорбенты В литературе имеется ограниченное число работ по сорбции вирусов гриппа или противогриппозных антител из растворов для удаления комплементарных антигенов или антител из раствора. Одними из первых сорбентов для вирусов гриппа были предложены куриные эритроциты. Формализированные куриные эритроциты использовали для получения очищенных вирионов вирусов гриппа. Метод состоял из этапов сорбции из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, затем их элюции с них для получения препаратов достаточно очищенных и концентрированных вирионов вирусов гриппа А, В, и С. Иммуносорбенты (вирусы, сорбированные на эритроциты) использовали для получения набора вирусспецифических антител к вирусу гриппа в антигриппозных сыворотках (Ровнова З.И., 1959). Обработанные иммуносорбентами сыворотки в дальнейшем использовали для изучения антигенных сайтов гемагглютинина вирусов гриппа, например А(Н1N1) ( Исаева Е.И и др.,1986).

Макропористое стекло с размером пор до 0,5 мкм, полученное из расплава кремниевого и борного ангидридов, предлагалось для хроматографической очистке вируса гриппа А/Виктория/1/88(HIN1) для производства противогриппозной вакцины (Полянская Н.Ю.

Жебрун А.Б., 1982; Чубарова Н.И. и др.,1997).

В качестве неорганических сорбентов были предложены соли BaSO4. Иммуносорбенты (вирусы, соединенные с солями BaSO4) могут быть использованы для анализа спектра антител в иммунных сыворотках и для удаления противогриппозных тел из диагностических сывороток (Закстельская Л.Я., Шендерович С.Ф. и др., 1979).

Аниониты и катиониты в методе ионно-обменной хроматографии предлагалось использовать для сорбции и изоляции вирусов гриппа (Рыбинская Л.Н. и др., 1979), которые обладали низкой сорбционной емкостью, трудоемкостью и длительностью выполнения операций.

Силикатные пористые сорбенты предложено использовать для очистки и концентрирования различных штаммов вирусов гриппа ( Железнова Н.В и др.,1975).

Для приготовления иммуносорбентов в качестве сорбентов предложены целлюлозные матрицы (Гурвич А.Е., 1987).

Показано, что полимерные материалы, приготовленные в виде гранул из криогеля поливинилового спирта, способны фиксировать вирусоспецифические антитела для последующего выделения вируса гриппа из растворов. Следует отметить, что для приготовления такого сорбента требуется фабричная специальная криогранулярная установка, приготовление и иммобилизация антител на сорбент (Плиева Ф.М и др.,1998;

Лозинский В.И., Зубов А.Л., 1992).

Модифицированный графит, полученный с помощью гидротермической обработки, может быть использован как вирусный сорбент. Установлено, что вирусы гриппа активно взаимодействуют с веществом, независимо от антигенной структуры поверхностных белков в широком диапазоне температур от 8-34С в течение уже первых 15 мин. контакта вируса с сорбентом. Падение гемагглютинирующего титра вируса в растворе после контакта с сорбентом составляло от 4 до 256 раз. Комплексы модифицированного.графита с вирусами были способны взаимодействовать с гомологичными антителами из иммунных сывороток. Кроме вирусов гриппа модифицированный графит способен был сорбировать белки не вирусной природы-белки аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, иммунной сыворотки, 1% бычий сывороточный альбумин (Иванова В.Т., Курочкина Я.Е и др., 2008;

Иванова В.Т., Курочкина Я.Е., и др. патент 2007). При сравнении с бактериофагом показано, что его сорбция идет менее интенсивно, чем в случае вируса гриппа (Курочкина Я.Е., диссертация 2010). Десорбция вирусов с сорбента была крайне слаба.

Среди полимеров в качестве сорбентов большой интерес вызывает полианилин (ПАНИ). Этот полимер обладает дырочной проводимостью в отличие от большинства известных полимеров, которые при нормальных условиях являются изоляторами.

Основание полианилина является изолятором, а его производные (соли и интерполимерные комплексы с различными кислотами) – полупроводниками. Полианилин состоит из повторяющихся N-фенил-п-фенилендиаминных и хинондииминных блоков.

Наличие различных функциональных групп на поверхности полимера позволяет ему организовывать различные связи с органическими молекулами. Установлена способность основания полианилина, а также солей полианилина ПАН ПАМПСК (полученных с помощью низкомолекуляных и полимерных кислот) сорбировать из воды и различных растворов эталонные, эпидемические и пандемические штаммы вирусов гриппа А(Н1N1), А(Н3N2), А(Н1N1) pdm09 и вирусы гриппа В, изолированные в период с 1977 по 2009гг., отличающиеся антигенными свойствами и термочувствительностью гемеагглютитнина. Во временном интервале 15-120 минут интенсивность сорбции была одинаковая в температурном диапазоне от 4 до 7 0С. На эти сорбентах показана возможность сорбции энтеровирусов (вирус полиомиелита вакцинный штамм Сэбина типа 1) и бактериофага Т4D, а также показана возможность сорбции белков невирусной природы: бычьего сывороточного альбумина, белков иммунной сыворотки (иммуноглобулинов), белков аллантоисной жидкости куриных эмбрионов. Комплексы вирусов с сорбентами были способны взаимодействовать с гомологичными антителамии из растворов иммунных сывороток (Иванова В.Т. и др., 2009; Курочкина Я.Е., Тимофеева А.В., 2009). Фрагменты кДНК ( апликоны вирусов гриппа А(Н1N1) были также способны взаимодействовать с полианилином и ПАН ПАМПСК сорбентами (Трушакова С.В. диссертация, 2010).

Кроме функции сорбента полианилин может использоваться при биоинженерных исследованиях в качестве подложки для роста кардио или нервной тканей, где требуется биосовместимость с проводящими полимерами (Bidez P.R., 2006). Возможно использование проводящих полимеров, в частности полианилина, в медицине для лечения заболеваний периферической нервной системы (McKeon K.D., 2009).

Пленки полианилина толщиной от 30 до 105 нм также способны сорбировать вирусы гриппа А/Новая Каледония /20/99 А(Н1N1), антитела из имунных сывороток к штаммам А/ Новая Каледония /20/99 (Н1N1) и штамму В/Флорида/04/06 и фрагменты кДНК, полученные из вирионных РНК в результате полимеразной цепной реакции. Эти результаты были получены методом поверхностного плазмонного резонанса (Трушакова С.В., диссертация, 2010; Исакова А.А., Иванов В.Ф, Иванова В.Т. и др., 2010).

Углеродные нанотрубки и углеродные нанотрубки, покрытые полианилином способны сорбироваться на из водных и физиологических растворов вирусы гриппа А(Н5N2) и А(Н7N7), а также эпидемические и пандемические штаммы А(Н3N2) и А(Н1N1)pdm09.

При этом покрытие углеродных полианилином приводило к увеличению сорбции вирусов из водных растворов (Курочкина Я.Е. диссертация, 2010 ) Сложные композиты на основе полианилиновых пленок с сорбированными антителами, способны образовывать преципитационные комплексы с гомологичными вирусами при покрытии пленки нематическими жидкими кристаллами. Этот эффект может быть использован для детекции вируса В.Т. гриппа А и В (Иванов В.Ф., Иванова В.Т., Томилин М.Г., 2006а; Иванов В.Ф, Иванова В.Т., Томилин М.Г. и др.,2006).

Интродукция вирусов гриппа птиц А/Н5N1 в человеческую популяции вызвала активный интерес в различных направлениях в том числе диагностики и дезинфекции среды от возбудителей. Разработан магнитный носитель (-Fe2O3), покрытый полианилином, который способен сорбировать вирусы гриппа. Сенсор предлагалось использовать для детекции гемагглютинина вирусов гриппа А/Н5N1 (Kamikawa T.L., 2010).

Для мониторинга открытых водных объектов на наличие патогенных вирусов гриппа предлагается магноиммуносорбенты, матрицей которых является твердая магнитная основа с иммобилизованными (фиксированными) гомологичными антителами. Для селективного концентрирования для выявления вирусов гриппа птиц А/Н5N1 предложен сложный композит, в состав которого наряду с полимерами входят несколько ионов металлов (Ефременко В.И. и др., 2008).

Сорбенты и иммуносорбенты могут быть использованы и для вирусов, структура которых отлична от вирионов вируса гриппа.

Глина или древесный уголь рассмотрены как сорбенты для рота - и коронавирусов коров, вызывающих гастроэнтериты у млекопитающих и птиц (Clark K.J. et al., 1998). В патенте (Тремблен М. Э. Фиштер С. Г., Коллиас Д. Йо., 2004) предложен углеродный сорбент, представляющий собой частицы активированного угля, способный удалять из воды бактериофаг МS-2, имеющий размер от 25 нм. Активированные угли получают из разных материалов (древесный уголь, древесные опилки, скорлупа орехов, косточки плодов фруктовых деревьев (Химическая энциклопедия, 1988). Сорбционные свойства зависят от нескольких факторов: состава, способа его получения, распределения пор по размерам и величины удельной поверхности. При этом активированные угли могут резко отличаться природой поверхности из-за способа и условий получения и хранения.

Следует отметить, что углеродные сорбенты, являются наиболее древними сорбентами в истории человечества. Кроме сорбции вирусов, активированный уголь используется в качестве адсорбента для очистки воздуха от CS2, улавливания паров других летучих растворителей, для очистки водных растворов, гемосорбции, поглощения вредных веществ из желудочно-кишечного тракта и т. д.

Использование мембран из современных материалов - полипиррола позволяет удалять из водных растворов ряд вирусов животных, включающих полиовирусы, коксаки, эхо, и другие энтеровирусы, рео, рота, гепатит (Chandra А. S., Singh R. et al.,1999). Для выявления вирусспецифических антител к вирусу гепатита С в качестве матрицы (носителя) предложен полимер-полистирол, с фиксированным (иммобилизованным) на нем вирусспецифическим рекомбинантным белком или синтетическим пептидом (Падюков Л.Н. Бобкова М. Р. 1997; Мукомолов С.Л., Плотникова В.А., Жебрун А.Б. и др.

Иммуносорбент для обнаружения антител к ядерному белку вируса гепатита с в сыворотке крови Патент РФ, 2138286. 27.09.1999.

Рассматриваются монодисперсные и наноэмульсионные гели для применения в качестве сорбента для включения рекомбинантного антигена гепатита В при усовершенствования интра-оральной вакцинации рекомбинантным HBsAg (Rachmawati H. et al., 2012).

Современные сорбенты создаются не только как антивирусные материалы, но и для создания своеобразных платформ для соединения с различными лечебными препаратами и затем доставки лекарств в организмы.

Комплексы – никель-агарозные частицы (везикулы), предлагается использовать как платформы для адресной доставки лекарств, плазмидных ДНК, белков и вирусов (Asghari F. et al., 2012).

Титановые нанотрубки, модифицированные присоединением различных функциональных групп, разработаны и предложены для создания носителя молекул для терапии носа (Talon R.M. et al., 2012).

Разные производные одних и тех же соединений могут быть использованы в разных направлениях медицины и для улучшения жизнедеятельности человека.

Композиты оксида графена (производного графита), помеченные флуоресцентной меткой, предлагается использовать, для создания платформы для адресной доставки лекарств и светотермальной терапии, для диагностики рака (Hu S.H. и др., 2012).

Соединение графена, содержащее холестиринбромидпиридин, может быть использовано как лекарство против рака груди, которое вызывает апоптоз в трансформированных раковых клетках (Misra S.K. et al., 2012).

Графен, в структуру которого включены ионы железа, предлагается использовать как новый катализатор для разложения нитроароматических соединений. Это позволит предотвратить загрязнения окружающей среды нитроароматические соединения, которые используются в таких областях как фармацея, агрохимия (Atar N. et al., 2012).

Фуллерены и углеродные нанотрубки благодаря своему строению обладают большей сорбционной способностью, чем угли и графиты. Фуллерены могут быть использованы как средства целевой доставки лекарств и вакцин и в фармации для создания новых лекарств в качестве эффективных антиоксидантов (Носик Д.Н., Носик Н.Н., 2008; Андреев С.М.

Бабахин А.А., 2008).

Кроме использования углеродных нанотрубок (УНТ) в качестве сорбентов для вирусов гриппа (выше указано), они могут быть рассмотрены, в качестве контейнеров для адресной доставки лекарств. Лекарства помещают в трубки и «запаянном» виде безопасно транспортировать в место назначения, где нанотрубки раскрываются с одного и выпускают свое содержимое в строго определенных дозах назначения с заданными свойствами (Дьячков П.Н., 2008; Шляхто Е.В., 2007). Модификация УНТ влияет на биологические объекты. Проведены исследования УНТ, соединенных с различными карбоксилированными группами. Изучено влияние на B и T клетки у мышей, и выявлены различия в кинетике адсорбции данных композитов при сравнении с углеродными нанотрубками с карбоксилированными группами (Krang D. et al., 2012). Одно из вариантов использования УНТ является приготовление из них воздушных фильтров. Исследования показали, что количество адсорбированного на углеродных нанотрубках диоксина во много раз выше, чем в случае активированного угля (Long R.Q., Yang R.T., 2001). Для очистки питьевой воды от свинца и химических соединений также предложено использовать углеродные нанотрубки (Филатов С.А. и др., 2008).

Другое направление - это создание материалов, для биологических и медикобиологических работ по диагностике. Композиты золота (Au) с полимерами предложено для биометрических меток при исследовании in vivo и in vitro. Соединение композитов со структурами клеток позволяет получать стабильные агрегаты частиц, которые могут быть исследованы методами поверхностного плазмонного резонанса, поляризационной световой спектроскопии и рамановского излучения (Blakey et al., 2012).

Некоторые современные сорбенты способны взаимодействовать с антибиотиками для последующей сорбции микроорганизмов. Цель- инактивации микропатогенов или активного удаления из растворов. Разработаны органеллы – микроструктуры, образованные из органических жидкостей и представляющие собой нити, способные соединяться с антибиотиком- ципрофлоксацином. Этот комплекс обладает хорошими антимикробными свойствами относительно бактерий B. subtilis и E. сoli (Behera B. et al., 2012).

Показана возможность сорбции некоторых антибиотиков на выше указанные сорбенты (ультрадисперсный графит, полианилин, УНТ и углеродные нанотрубки, покрытые полианилином). Изучение сорбции с помощью биологических объектов более простого, чем вирусы строения, например, антибиотики показало, что активность взаимодействия сорбентов с антибиотиками зависела от структуры как сорбентов, так и антибиотиков (Катруха Г.С., Тимофеева А.В., Буравцев В.Н. и др.,2009). Композиты - углеродные нанотрубки, покрытые полианилином, обладали большими гидрофобными свойствами, чем основание полианилина, гидрофобные антибиотики грамицидин S и тейкопланин А взаимодействуют с углеродными нанотрубкками, покрытыми полианилином более интенсивно (Ivanova V.T., Katrukha G.S.et al., 2011). В процессе элюции с УНТ, покрытых полианилином, антибиотики элюировали за 1 час, с основания полианилина за 18 час.( Ivanova V. T., Sapurina I. Yu., Ivanov V. F., et al., 2009; Ivanova V.T., Katrukha G.S. et al., 2011). Многостенные углеродные нанотрубки типа «Таунит» оказались способны сорбировать ряд антибиотиков: грамицидин S, и тейкопланин А2, пеницилин G, бацитрацин, телломицин, этамицин, гризеоверидин в течение 18 часов. Однако, возможность десорбции выявлена только для тейкопланина А2 и грамицидина S (выход составлял 86 и 65% соответственно, остальные практически не элюировали с данного сорбента (Тимофеева А.В., Ильина М.В., и др. 2013; M. V. Il’ina, Timofeeva A. V.et al., 2012).

Важными свойствами сорбентов является эффективность сорбции и отсутствие токсичности для человека. В настоящее время существует много фильтров, которые устраняют бактерии из воды, но, когда речь идет о вирусов, мы сталкиваемся с проблемой размер пор, так как большинство вирусов имеют нано-размеры, и большинство современных систем фильтрации не способны очистить воду от вирусов. Поэтому идет активный поиск новых сорбентов на основе новых наноматериалов. В конце ХХ века были получены новые углеродсодержащие материалы - детонационные материалы - шихта наноалмазы, шихта, углеродные нанотрубки.

3.3 Наноалмазы, структура и свойства, перспектива использования в качестве сорбентов Наноалмазы были впервые получены в 60-х годах истекшего столетия в СССР, однако широкое исследование закономерностей синтеза, особенностей структуры и свойств порошков наноалмаза, а также его практического применения были развернуты только в последние два десятилетия (Сакович Г.В. и др., 2011). Детонационные наноалмазы (ДНА) или ультрадисперсные алмазы можно рассматривать как специфический наноуглеродный материал, входящий в обширное и все более популярное семейство наноуглеродных кластеров, состоящее из фуллеренов, нанотрубок, нанографита, «луковичной» формы углерода. ДНА – один из немногих наноматериалов, выпускаемый в странах СНГ и за рубежом (Китай, Япония, Южная Корея и другие страны), в масштабах тонн в год.

Несмотря на большой объем, он еще недостаточно изучен. Одна из причин является изменение его химического состава в зависимости от условий синтеза и очистки.

Кристаллы наноалмазов (2-10 нм) образуются обычно при взрыве смесей гексогена и тринитротолуола. Их получают из первичного продукта детонационного синтеза вещества – шихты, которая остается после взрыва на поверхности камер и затем снимается механически (скребки). Именно из нее путем различных методов очистки (кислотных, газовых и т.д.) получают наноалмазы. Наноалмаз не является чисто углеродным материалом, а сам углерод находится в нем одновременно в нескольких модификациях, и только одна из них соответствует структуре алмаза. Наноалмаз представляет собой особый тип алмазного материала, свойства которого в наибольшей степени определяются химическим состоянием его поверхности. Благодаря очистке происходит удаление не алмазных форм углерода с поверхности кристаллитов ДНА и удаления не углеродных примесей (Кулакова И.И., 2004). Блок схема процесса получения ДНА представлена на рис.4.

(температура) t=0.3 сек(время), Р=16-23 gPA (давление) Рис. 4. Блок схема получения детонационного наноалмаза На рис. 5 представлена лабораторная установка для получения ДНА. Следует отметить, что при промышленном производстве установка имеет значительно большие размеры. На фирме” Sinta” (Минск, Беларусь) она имеет вид цилиндра с высотой до 3 м и диаметром основания до 2 м.

Рис. 5. Лабораторная установка для получения детонационного наноалмаза Очищенные ДНА отличаются от шихты по ряду параметров. Удельная поверхность шихты составляет 450 м2/г, что существенно выше, чем удельная поверхность у наноалмазов, которая составляет примерно 300 м2/г., кроме того имеются отличия и в элементном составе этих материалов. Существенные отличия поверхностных свойств может быть обусловлено как различием в величине удельной поверхности, так в ее природе.

В шихте содержится аморфный углерод, большая доля атомов которого находится в sp электронном состоянии. Именно поэтому наноалмаз представляет собой особый тип алмазного материала, свойства которого в наибольшей степени определяются химическим состоянием его поверхности. При сравнении свойств алмаза и наноалмазов следует отметить, что последние имеют большую удельную площадь поверхности. Частица ДНА представляет собой надмолекулу, имеющую ядро, окруженное химически связанной с ядром оболочкой, состоящей из функциональных групп рис.6а,б) У наноалмазов среднего размера (порядка 4 нм) доля поверхностных атомов (кислорода, азота и водорода) достаточно высока и может превышать 10%. Кроме того, структура поверхности наноалмазов имеет дефекты, обусловленные способом получения и очистки. Наличие на поверхности наноалмазов атомов углерода, имеющих не скомпенсированные связи, приводит к высокой поверхностной активности наноалмазов. Процентное содержание на поверхности других атомов (рис. 6 а,б), не одинаково.

Рис.6. Модели структуры наноалмазов: а - схематическое изображение кристалита наноалмаза, б – схематическое изображение структуры наноалмаза и его поверхности Анализ химического состава наноалмазов отражен в таблице 1. В случае кислорода (О) он может достигать 10% (Долматов В.Ю., 2001). На поверхности ДНА, выделенного из шихты, обнаруживаются различные функциональные группы. Это углеводородные группы (метиленовые, метильные ); кислородсодержащие (гидроксильные, карбонильные, альдегидные; серо и азотсодержащие (сульфогруппы, нитрогруппы) и др.

Химический состав наноалмазов Элемент и его Содержание %(масс) Химическая форма Характеристика примеси Fe,Ti,Cr,Cu,K,Ca,Si,Pb и др. Оксиды, соли, карбиды Трудноудаляемые твердые Поверхность наноамазов может быть изменена путем различных манипуляций, в результате чего процент определенных примесей может быть увеличен. Функциональные группы можно изменить при окислении, восстановлении, разрушении при температуре, удалить или присоединить к ним различные органические и неорганические молекулы (Кулакова И.И. 2004). Модификация ДНА может быть проведена на установке, представленной на рис. 7. Данные элементного анализа исходного и модифицированного воздухом и водородом наноалмаза представлены в таблице 2.

Рис.7. Схема и фото установки для химического для модифицирования порошков наноалмаза.

Элементный состав модифицированного газами наноалмаза.* Условия модифицирования Содержание, % (масс.) Примечание. Рассчитано по разности. Так как содержание несгораемого остатка в навесках было постоянным (Dl% масс.), то значения, приведенные в этой колонке, характеризуют изменение именно содержания кислорода.

Количественный состав функционального покрова поверхности ДНА определяется методами кислотно-основного титрования и инфракрасной спектроскопии. При модифицировании образцов может наблюдаться изменение их окраски: при обработке воздухом они светлеют (выгорает неалмазный углерод). При обработке водородом они темнеют, что может быть обусловлено частичной графитизацией ДНА. При термообработке в результате разложения, обмена, окисления изменяется поверхностный слой ДНА. В таблице 2 представлены данные исходного и модифицированного воздухом и водородом ДНА. При обработке воздухом окисляются исходные водородсодержащие группы. В результате водород отсутствует в составе модифицированного ДНА. При обработке водородом происходит восстановление поверхностных карбонильных групп до углеводородных и гидроксильных групп. В результате наблюдается уменьшение содержания кислорода и увеличение содержания водорода. В инфракрасных (ИК) спектрах могут наблюдаться полосы поглощения карбонильных групп (1730-1790 см-1) и гидроксильных групп (1640, 3400 см-1). Таким образом, ДНА после различных методов очистки и модификации отличаются по (ИК) спектрам (Кулакова И.И., 2004).

Первый этап в исследовании ДНА после их открытия состоял в изучении их физикохимических свойств и возможного применения в промышленности, например оптоэлектронных технике, солнечной энергетики, наноэлектроники. Целью следующего этапа в изучении наноалмазов было исследования возможности их использования в биологии и медицине. Установлено, что соединенные в кластеры до 100 нм ДНА способны сорбировать лекарства и доставлять их к раковым клеткам (Adnan A., Lam R., Chen H et al., 2011). Показано, что наноалмазы способны взаимодействовать с белками (Бондарь В. С. и др., 2008). На момент начала наших исследований в научной литературе присутствовал патент США (Fujimura T. et al., 2009), в котором предлагалось использование детонационных алмазов как основание сорбентов для удаления вирусов ВИЧ и ДНК из растворов, конечная цель была создание вакцин анти ВИЧ. По сути, удаление биологических объектов проводили комплексами, состоящими из наноалмазов и полимерных молекул - лигандов, то есть эти комплексы являлись аналогами иммуносорбентов. В случае вируса в качестве переходного лиганда предлагается использовать конковалин А, который представляет собой лектин -карбогидрат связывающий растительный протеин, получаемый из особого вида фасоли - Canavalia ensiformis, которая произрастает в Бразилии и обладает сильной токсичностью. Конковалин А связывает определенные структуры в сахарах, соединяясь с разными рецепторами, содержащимися в манозных карбогидратах (Goldstein I.J., Poretz R.D., 1986). Большим достоинством наноалмазов является низкая токсичность для живых клеток и животных (Пузырь А.П., Бондарь В.С., Селимханова З.Ю. и др., 2004). Эти результаты следует рассматривать как важный начальный этап в исследовании токсических свойств ДНА материалов. Для практического применения наночастиц в биологии и медицины необходимо проведение всесторонних исследований их на токсичность как на различных культурах клеток in vitro, так и на лабораторных животных in vivo.

3.4. Влияние наночастиц на клетки in vivo и in vitro Нанотоксикология – это молодая наука, один из первых симпозиумов, посвященных результатам исследований в этом направлении, состоялся в Амстердаме, Голландия в году. Дело в том, что после создания наночастиц следовал этап изучения физикохимических свойств и их возможное применение в различных сферах человеческой деятельности. Изучение биологических свойств наночастиц и возможность их применения в биологии и медицине как задача сформировалась позднее, на следующем этапе их исследования. Именно этим объясняется небольшое число работ по токсикологии наночастиц в том числе и для ДНА материалов.

Обзор данных, приведенных в работе De Stefano D. и др. (2012) говорит о том, что на свойства наночастиц оказывает существенное влияние степень их агрегации.

Агрегированные наноматериалы могут аккумулироваться в клетках или в органах, что в некоторых случаях может приводить к разрушению в клетках также как и не агрегированные материалы. В настоящее время неизвестно, какие факторы могут оказывать доминирующее влияние на клетки. Возможно, что это совокупность разных факторов. В литературе имеется на этот счет много противоречивых результатов. Токсичность частиц может быть вызвана композициями, размерами, формой, поверхностным зарядом, модификацией используемых частиц. Кроме того, на результаты и их интерпретацию оказывают влияние использование различных биологических моделей in vivo и in vitro, исследования, проведенные различными методами, методы оценки состояния клетки, концентрации наночастиц и времени воздействия их на клетки. В силу этого крайне важно проведение исследований по многим направлениям. Результаты накопления и анализа совокупных данных позволят получить точную картину о токсических свойствах данного материала.

Резюме к главе В начале главы определены разные виды сорбции, краткий исторический обзор об использовании сорбентов в прошлом и возобновлении интереса к ним в 20-м веке.

Приведены данные о сорбции вирусов гриппа, полиовируса, коксаки, рото- и короновирусы на сорбентах разной природы, в том числе углеродных сорбентах и полимерных сорбентах.

Отмечено, что сорбенты могут быть использованы для адресной доставки лекарств, ферментов, вакцин в организмы животных и человека. На основании литературных данных Глава 4. Взаимодействие белков, нуклеиновых кислот, вирусов с материалами, содержащими Ag; использование препаратов в медицине, биологии и для дезинфекции воды; исследования их токсичности Одно из направлений борьбы с вирусными инфекциями является дезактивация возбудителей. Наиболее известными веществами, используемые в настоящее время, являются серебро и его соединения, хлор и его соединения, озон и другие вещества.

История использования серебра для обеззараживания воды и для лечебных целей насчитывает порядка 2500 лет. Использование серебряных сосудов для безопасного хранения жидкостей было известно с давних времен. В 550 – 529 гг. до нашей эры. Cyrus Great, царем Персии было установлено, что безопасное долговременное хранение воды и водных растворов должно осуществляться в серебряных сосудах [116]. В 78 г. нашей эры римский ученый Плиний Старший писал, что обожженное серебро обладало целебными свойствами при добавлении его в составе пластырей для перевязки ран [149]. В 1884 г. Ф.

Крит предложил использовать 1% раствор для предотвращения инфекций глаз, вызванных бактериальным возбудителем – гонококком. Впервые серьезные научные исследования серебра как антисептика были начаты в 1887г. Von Behring, который обнаружил, что нитрат серебра за 48 часов разрушает споры сибирской язвы [83].

Об антибактериальных свойствах серебра и применении этого эффекта в медицине имеется достаточно число публикаций [83]. Недавние исследования показали, что биохимические реакции йонного серебра приводят к инактивации бактерий, грибков, протозоа, спирохет, вирусов, протеиновых мембран [156]. Предложено три механизма, с помощью которых серебро взаимодействует с микроорганизмами:

1. Разрушение микроорганизмов посредством окисления, катализируемого серебром;

2. Разрушение транспорта электрона в бактериях с помощью одновалентного серебра, и/или предотвращение раскручивания ДНК в вирусах с заменой ионов водорода одновалентным серебром.

3. Разрушение бактерий и вирусов с помощью дву- и тривалентного серебра.

Установлено, что атомарный кислород, адсорбированный на поверхности серебра, мгновенно окисляет органические вещества при контакте. Показано, что взаимодействие Ag с тиоловыми группами ферментов играют важную роль в инактивации бактерий [71].

Суммарный кислород, адсорбированный на серебре, в водной фазе реагирует с парой (- SH-) группой, на поверхности бактерий или вирусов, заменяя атом водорода в паре атомов серы на R-S –S-R – связи, которая блокирует дыхательный и электронный транспорт [100].

При исследовании йонов Ag с серосодержащими аминокислотами и цистеинсодержащими пептидами обнаружено, что наибольшим сродством к ионам Ag обладают цистеин и гомоцистеин [51]. Спектроскопические исследования взаимодействия Ag с нуклеиновыми кислотами в водных растворах показали, что при постоянной концентрации ДНК или РНК и различных концентрациях Ag формирует комплексы с ДНК путем связывания катиона с гуанином (при низкой концентрации) и с аденином (при более высоких концентрациях). Взаимодействие Ag не происходит с боковыми фосфатными группами [88].

В настоящее время нет больших исследований, посвященных инактивации вирусов с помощью Ag. В структуре вирусов отсутствует в отличие от бактерий клеточная мембранная оболочка. Однако наличие в вирионных белках групп с (- S-H-) связью говорит о том, что реакция с Ag может протекать у вирионных белков по механизму, предложенному для бактериальных белков. Известно, что соединение серебра c сульфадиазином, эффективно против герпеса и везикулярного стоматита [175].

Исследования наноматериалов, содержащих серебро, ставят своей целью как создание новых антимикробных материалов и усиление антимикробных свойств существующих, так и создание новых лекарств против известных возбудителей в связи с проблемой резистентности многих патогенов к современным лекарствам. При этом основными объектами исследования являются микропатогены не вирусной природы. Препараты, содержащие наночастицы серебра, которые подавляют активность белков плазмодия путем взаимодействия с тиоловыми (SH) группами этих белков, предлагаются использовать против заболеваний малярией. Интерес к соединениям Ag, вызван возникновением у Plasmodium falciparum резистентности к лечебным препаратам [139].

В связи с развитием резистентности к грамположительным и грамотрицательным бактериям и грибковым штаммам предлагается использовать серебросодержащие гидроапатитные наночастицы Ca 10-x.Agx (PO4)6 (OH)2 [151].

Гидроксиапатит, допированный серебром, является многообещающим средством для устойчивой тканевой регенерации из-за антибактериальных свойств серебра и остеопроводимости гидроапатита Композиционные пленки, содержащие серебро и полимерные матрицы (полисахариды), предлагается использовать в качестве упаковочного материала для пищевых продуктов, т.к. по данным исследователей такие пленки разрушают споры грибка Aspergillus niger, поражающие пищевые продукты. [148].

Показано, что наночастицы серебра, введенные в ткани из хлопка (100%) или ткань, содержащая полиэстер вискоза 50/50 и которые в производстве одежды обладают антибактериальными свойствами относительно грамположительных и грамотрицательных бактерий-Staphylococus и Esherichia coli [142].

Композиты –грибки, поражающих растений, соединенные с наночастицами серебра, обладали антимикробной активностью против патогенов человека, таких как Staphylococus aureus, Salmonella typhy, Esherichia coli, Candida albicans представляющие собой шарики с ядром Ag @ SiO2, покрытые полимером, и соединенные с флуоресцентной меткой, предлагается использовать как метку при изучении клеток рака легких. Установлено, что наличие Ag внутри ядра увеличивает интенсивность флуоресценции. Данные частицы монодисперсны и обладают низкой токсичностью.

Нанокомпозиты, содержащие серебро и полимер -полиэтилбутилакрилат, предлагается использовать в качестве метки при биодетекции в рамановской спектроскопии [106].

Примером промышленного использования антибактериальных свойства серебра являются водоочистительные приборы, которые используются уже в 20 веке для предотвращения бактериального загрязнения воды. С этой целью в небольших установках соединения серебра включают в материалы фильтров или проводят обработку воды ионами серебра.

Исторически серебро использовали как в металлическом, так в ионном виде. Кульский П.А.

в 1987 показал, что серебряная вода активнее хлора, хлорной извести, гипохлорита натрия и других сильных окислителей, в 1750 раз сильнее карболовой кислоты и в 3.5 раза сулемы (в одинаковых концентрациях). Этот эффект был использован для консервирования питьевой воды ионаторами ЛК-28(ИЭМ-50)– аппаратами, обеспечивающими анодное растворение серебра в воде. В СССР ионаторами было оснащено свыше 70 крупных морских судов черноморского, балтийского и мурманского флотов [84]. Кроме того, аналогичное оборудование использовалось для космических полетов различной продолжительности. На американских судах использовалась комбинированная очистка воды целлюлозой и ионным серебром до 0,025 мг/ л. [83].

Серебро для очистки воды применяется только при наличии специальной технологии, поскольку его предельно допустимая концентрация в питьевой воде не должна превышать 0.05 мг/л.

Десятки тысяч бассейнов для плавания в Европе и США оборудованы серебро-медь ионными генераторами, что позволяет уменьшить существенно присутствие хлора или вообще его исключить из- за аллергических реакций человеческого организма на хлор.

О токсичности серебра написано большое количество статей и обзоров. В России первые работы на эту тему были опубликованы в начале 20-го века [62]. Введение разными способами серебра в организм приводит к следующему: при втирании и подкожном введении серебро фиксируется кожей и клетчаткой, при внутривенном введении серебро быстро удаляется из организма. За 100 лет клинических исследований не было зарегистрировано ни одного смертного случая, обусловленного действием серебра и его соединений [10]. Однако, серебро в ионной растворимой форме токсично для водных организмов, в то же время для млекопитающих токсичность серебра низка, при этом нет данных о мутагенной или канцерогенной активности соединений серебра [114,115,154].

Токсичность серебросодержащих наночастиц зависела не только от времени контакта, но и от дозы. На клетках пуповины вены человеческого эмбриона при исследовании методом электронной микроскопии, ультрафиолетовой спектроскопии, а также с помощью микропроточной установки установлено, что наночастицы имеют низкую цитотоксичность и гомогенное распределение частиц в культуральной среде за время наблюдения биологических объектов [107].

Резюме к главе В тексте главы приведен краткий обзор литературных данных об истории использовании серебра в лечебных целях и в качестве дезсредства для получения питьевой воды. На основании изучения взаимодействия серебра с химическими соединениями и с бактериями описаны возможные механизмы, обусловливающие действие серебра на биологические объекты. Приведены данные об использовании серебра для очистки воды в промышленности, при получении лечебных и антибактериальных материалов, в том числе и для одежды. Обзор данных позволяет сделать вывод, что, несмотря на многочисленные публикации о воздействии серебра на бактерии и значительно меньшие информации о воздействии серебра на грибки, в литературе имеются единичные работы о воздействии серебра на вирусы. Это дало основание для проведения настоящего исследования по взаимодействию серебросодержащих материалов (композитов) на вирусы.

Заключение ко всем главам литературного обзора В главах лит. обзора были рассмотрены распространение, свойства и строение разных вирусов: гриппа, полиомиелита, играющих значительную роль в жизнедеятельности человека и имеющие водный путь передачи. Чтобы обеспечить безопасность используемой воды, необходимо создание фильтров, способных очищать воду не только от механических примесей и химических элементов, а также и от патогенной микрофлоры. В связи с этим были изучены различные материалы, полученные в разное время, иммуносорбенты, способы их получения, а также их свойства и отобраны наиболее перспективные в качестве сорбентов. Среди них были вещества на основе углерода и полимеров, а также композиты, полученные с использованием нанотехнологий и обладающие новыми свойствами.

Направлением исследования настоящей работы являлось изучение взаимодействия выбранных материалов с разными вирусами для определения возможности использования их в качестве сорбентов для очистки воды и других жидкостей от вирусов, белков и ДНК;

в лечебно – профилактических целях как подход для производственных целей концентрирования вирусов при наработке гриппозных вакцин и иммунопрепаратов; для биосенсоров в тест- системах.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1. Материалы и методы исследования 1.1.Вирусы гриппа А и В Использовано 9 эталонных и 6 эпидемических штаммов вирусов гриппа типов А и В, циркулировавших в России и в мире в период с 1999г. по 2013г.; в том числе пандемические штаммы А(Н1N1)pdm09, выделенные в лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа (таблица 3). Вирусы были получены из Государственной коллекции вирусов, из коллекции вирусов лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ, а также из справочных центров ВОЗ.

Вирусы гриппа А и В, использованные в работе 14 B/Виктория/2/ А(H5N1) реассортант R22/II А/ Утка/Приморье//2621/01 x PR/8/ А(H5N2) реассортант R22 А/ Утка/Приморье/ 2621/01 х PR/8/ Примечание* эталонные штаммы Вирус гриппа птиц А/Утка/Приморье /2621/01 (H5N2) и 2 реассортанта вируса гриппа птиц и штамма А/PR/8/34: R22/II А(H5N1), R22 А(H5N2) были любезно предоставлены академиком РАМН, дмн проф Н.В Кавериным (лаборатория физиологии ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ).