На правах рукописи

ЛЕВШЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

КАРБОКСИЛСОДЕРЖАЩИЕ ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОСФЕРЫ ДЛЯ

ИЗУЧЕНИЯ ТРЕХМЕРНОГО СТРОЕНИЯ СОСУДИСТОГО РУСЛА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Специальности: 02.00.06 высокомолекулярные соединения

03.01.06 – биотехнология (в т.ч. бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 2012

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова на кафедре «Химия и технология высокомолекулярных соединений им. С.С.

Медведева» и в ФГБУН Научно-исследовательском институте физикохимической медицины ФМБА России в лаборатории морфологии.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор заслуженный деятель науки РФ ГРИЦКОВА Инесса Александровна доктор медицинских наук, профессор ГУСЕВ Сергей Андреевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор ПАПИСОВ Иван Михайлович профессор кафедры химии Московского автомобильно-дорожного государственного технического университета доктор химических наук, профессор ВАСИЛЕНКО Иван Александрович директор испытательной лаборатории ООО «ОЛФАРМ»

Ведущая организация: Государственный научный центр РФ Федеральное государственное унитарное предприятие «Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский физико-химический институт имени Л.Я.Карпова»

(ФГУП «НИФХИ им.Л.Я.Карпова»)

Защита состоится «29» ноября 2012 г. в 1500 на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.04 в ФГБОУ ВПО Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, пр. Вернадского, д. 86, корп. Т, ауд. Т-410.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО Московского государственного университета тонких химических технологий имени М.В.

Ломоносова

Автореферат разослан « » 2012 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 212.120. Доктор химических наук, профессор Грицкова И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Одной из актуальных проблемных областей применения полимерных микросфер в биотехнологии может быть их использование для исследования васкуляризации тканей (степени развития в них сосудистого русла), что необходимо для понимания патогенеза опухолевого роста.

Существующие методы исследования сосудистого русла, основанные на заполнении их смесью тушь-желатин и азотнокислым серебром или быстрополимеризующимся мономером с последующим изучением препаратов с помощью светового или растрового электронного микроскопа, не позволяют последовательно изучать закономерности ветвления сосудов, что необходимо для понимания их функционального состояния.

В этом плане могут быть перспективными полимерные микросферы, окрашенные люминесцентным красителем, с использованием флуоресцентной конфокальной микроскопии для построения трехмерной модели сосудов.

Полимерные микросферы должны обладать высокой интенсивностью флуоресценции, низкой адгезивной активностью к внутренней поверхности сосуда, что исключит их прилипание к стенкам сосуда, и не образовывать коньюгатов друг с другом и с биологическими молекулами.

Для построения модели сосудистого русла с высоким разрешением (менее 0,1 мкм) и изучения характера контуров просвета необходимо плотное заполнение сосудов полимерными микросферами. Размер микросфер выбирают, исходя из среднего размера сосудов экспериментальных животных, который колеблется в интервале 4 – 100 мкм. Минимальный размер частиц для заполнения всего русла должен быть меньше или соизмерим с длиной волны фиолетовой границы видимого излучения (0,4–0,76мкм или 25000–13158см-1).

Цель работы. Синтез карбоксилсодержащих полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам, содержащих флуоресцентные метки, для создания метода визуализации трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных для изучения ангиогенеза.

Научная новизна 1. Определены условия синтеза карбоксилсодержащих полимерных микросфер разной природы с узким распределением по диаметрам, что позволило выбрать тип и природу полимерных микросфер, позволяющих плотно заполнять сосудистое русло экспериментальных животных для изучения его строения.

2. На основании данных по изучению кинетических закономерностей полимеризации стирола и метилметакрилата и сополимеризации стирола с метакриловой кислотой в присутствии нерастворимых в воде ПАВ разработаны рецептуры синтеза полимерных микросфер разного диаметра с узким распределением по размерам, устойчивых в физиологических растворах.

3. Впервые для синтеза карбоксилсодержащих полистирольных и полиметилметакрилатных суспензий использовано кремнийорганическое гемини-ПАВ –, –бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан, и показано, что оно проявляет высокие поверхностно-активные свойства на границе мономер/вода (1,2 = 28,1 мДж/м2) и образует прочные межфазные слои на поверхности ПМЧ/вода.

';

4. Разработана методика визуализации трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных с помощью набора флуоресцентно меченных полимерных микросфер. Этот метод позволяет избирательно блокировать заполнение сосудов заданного внутреннего диаметра и последовательно анализировать их ветвление.

5. Показано, что разработанный метод визуализации трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных с помощью набора флуоресцентно меченных полимерных микросфер позволяет получить информацию о характере контура просвета сосуда для анализа наличия или отсутствия препятствий току крови и степени извитости стенки сосуда.

6. Разработанная методика визуализации трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных с помощью набора флуоресцентно меченных полимерных микросфер опробована и рекомендована для использования медицинским учреждениям.

7. Показаны перспективы использования полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер для создания иммунодиагностических тест-систем.

Практическая значимость работы. Разработанная методика опробована в ФГБУН Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России, выдана рекомендация по ее использованию медицинским учреждениям.

Автор защищает:

Кинетические закономерности полимеризации стирола и метилметакрилата, а также сополимеризации стирола с метакриловой кислотой в отсутствие ПАВ и в присутствии нерастворимых в воде ПАВ различной природы.

Рецептуры синтеза полимерных микросфер с узким распределением по размерам и средними диаметрами в интервале 0,37 – 1,6 мкм.

Новое карбоксилсодержащее ПАВ с двумя полярными группами (геминиПАВ), - бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан в качестве стабилизатора полимерных суспензий при гетерофазной полимеризации мономеров.

Методологию, позволяющую с помощью набора флуоресцентно меченных полимерных микросфер разного размера изучать строение сосудистого русла экспериментальных животных.

Перспективы использования полистирольных и полиметилметакрилатных микросфер для создания иммунодиагностических тест-систем.

Личное участие автора являлось основополагающим на всех этапах работы и состояло в постановке цели исследования, разработке экспериментальных и теоретических подходов при выполнении эксперимента и обобщении полученных результатов.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной научнопрактической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2010»

(Москва, 2010), Научной секции ПАВ Научного совета по коллоидной химии и физико-химической механике РАН «Поверхностно-активные вещества в технологических процессах» (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 статей по теме диссертационной работы, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 107 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц, 39 рисунков.

Список литературы содержит 98 наименований.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована ее цель.

Глава 1. В Литературном обзоре рассмотрены основные области применения полимерных микросфер в биотехнологии и медицине, обсуждены материалы по способам синтеза полимерных микросфер, методам окрашивания полимерных микросфер флуоресцентными красителями, а также проведен обзор имеющихся в литературе сведений о существующих способах изучения строения сосудов.

Глава 2. В Экспериментальной части представлен перечень использованных веществ и их индивидуальных характеристик, методов синтеза полимерных микросфер и исследования их свойств (дилатометрический метод, метод сталогометрии, вискозиметрический метод, электронная сканирующая микроскопия, конфокальная сканирующая микроскопия).

Глава 3. Результаты и их обсуждение 3.1. Синтез полистиролметакриловых суспензий Наиболее часто в качестве носителей биолигандов используют полимерные микросферы с карбоксильными группами на поверхности. Это объясняется тем, что способы их синтеза относительно просты и хорошо изучены. Их получают сополимеризацией гидрофобных мономеров (чаще всего стирола) с ненасыщенными кислотами - акриловой, метакриловой, итаконовой и т.д. в присутствии или в отсутствие эмульгатора; затравочной сополимеризацией стирола и ненасыщенных кислот на полистирольных затравочных частицах; полимеризацией стирола с поверхностно-активными сомономерами или инициаторами, содержащими в своей структуре карбоксильные группы; а также полимеризацией стирола в присутствии нерастворимых в воде карбоксилсодержащих ПАВ. Однако сложность процесса состоит не только в том, что необходимо исключить полимеризацию полярного сомономера в водной фазе (для получения суспензий с узким распределением частиц по размерам), но и в концентрировании карбоксильных групп на поверхности частиц.

Распределение карбоксильных групп между поверхностью частиц и их объемом, обычно наблюдаемое при этом синтезе, является причиной постоянного изменения их свойств при хранении вследствие лиофилизации поверхности из-за миграции карбоксилсодержащих фрагментов полимерных цепей к границе раздела фаз.

Все эти процессы являются причиной того, что хорошо изученная и описанная в литературе сополимеризация стирола с метакриловой кислотой при обычно используемой ее концентрации 5-10% в расчете на стирол не позволяет синтезировать полимерные микросферы с узким РЧД.

Было высказано предположение о том, что снижение концентрации МАК в эмульсии и добавление ее не в водную, а в мономерную фазу, позволит свести к минимуму побочные процессы, приводящие к расширению распределения частиц по размерам, увеличению их числа и снижению устойчивости реакционной системы.

Сополимеризацию стирола с МАК проводили в отсутствие ПАВ при объемном соотношении стирол/вода, равном 1:9, температуре 70С, концентрации инициатора персульфата калия (ПК) 1%масс. в расчете на смесь мономеров. Концентрацию МАК изменяли в интервале от 0,05 до 2%масс. в расчете на стирол.

Было показано, что с уменьшением концентрации метакриловой кислоты существенно уменьшается скорость сополимеризации из-за снижения числа частиц, образующихся при полимеризации полярного мономера в водной фазе. Полная конверсия мономеров достигается за 7 - 12ч. Средний размер частиц уменьшается от 0,5 до 0,3 мкм с увеличением концентрации МАК от 0,05 до 2%масс. в расчете на стирол. Однако полимерные суспензии были неустойчивы в физиологических растворах, т.е. не соответствовали предъявляемым требованиям.

Устойчивость полистиролметакриловых суспензий удалось увеличить при сополимеризации стирола с метакриловой кислотой в тех же условиях, но в присутствии нерастворимого в воде ПАВ ди-п-толил-окарбалкоксифенилкарбинола (ДТК). В этом случае образование ПМЧ происходило преимущественно из микрокапель мономера, а формирование их по одному механизму и образование прочного межфазного слоя из молекул ДТК и полимера позволило получить полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам.

Присутствие в эмульсии мономеров стабилизатора ДТК (1%масс. в расчете на мономер) практически не меняет скорость сополимеризации, но увеличивает устойчивость суспензии в процессе синтеза. Распределение частиц по размерам приведено на рисунке 1. Видно, что средний размер частиц составляет 0,6 мкм при концентрации МАК в эмульсии, равной 0,05%масс. в расчете на стирол, и 0,3 мкм при концентрации МАК, равной 2%масс. в расчете на стирол.

Сополимеризация стирола с метакриловой кислотой в присутствии ДТК протекает до полной конверсии мономеров за 10-12 часов (в зависимости от содержания МАК в эмульсии).

Рисунок 1. Микрофотографии и распределение по размерам частиц, полученных при полимеризации стирола с различным содержанием МАК в присутствии ДТК: 1 – 0,05%, 2 – 2%.

Устойчивыми в физиологическом растворе оказались полимерные суспензии со средним диаметром частиц 0,3мкм, т.е. только они соответствовали требованиям, предъявляемым к полимерным суспензиям для использования при решении поставленной задачи.

3.2. Синтез карбоксилсодержащих полистирольных суспензий Синтез полистирольных карбоксилсодержащих полимерных суспензий проводили в присутствии моноэфиров ароматических дикарбоновых кислот, МАФ, с разным содержанием гидрофобных групп в молекуле, и кремнийорганического ПАВ – -(карбоксиэтил)триметилсилокси)полидиметилсилоксана, ПДС*. Эти ПАВ представляли собой лабораторные образцы, синтезированные специально для данных исследований. Было изучено влияние объемного соотношения фаз, концентрации стабилизатора и концентрации инициатора на средний диаметр частиц, распределение их по размерам и устойчивость в электролитах.

Полученные результаты представлены на рис. 2 и в таблице 1.

*Эти исследования выполнены совместно с Крашенинниковой И.Г.

Рисунок 2. Микрофотографии полимерных суспензий и распределения частиц по размерам:

1 – МАФ1; 2 – МАФ2; 3 – ПДС при соотношении фаз 1:9; 4 – ПДС при соотношении фаз 1: Таблица 1. Рецептуры синтеза полимерных суспензий (t=80°C) Тип полимерной суспензии Объемное Концентра- Концентра- Средний Устойчи- Полидисоотноше- ция ция диаметр вость в сперсние фаз стабилизат инициатора частиц, NaCl, М ность, стабилизированная МАФ стабилизированная МАФ стабилизированная МАФ Видно, что в присутствии МАФ и ПДС можно получить устойчивые карбоксилсодержащие полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам и диаметрами 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; и 0,9 мкм.

Синтезированные полимерные микросферы соответствовали необходимым требованиям и их предполагали использовать в биотехнологии.

Новые перспективы получения полимерных микросфер в заданном интервале диаметров получили свое развитие после появления в качестве коммерческих продуктов широкого спектра новых кремнийорганических ПАВ.

С начала 90-х годов прошлого столетия в зарубежной литературе стали появляться публикации по синтезу и изучению свойств димерных, гемини, ПАВ, представляющих собой амфифильные молекулы с двумя гидрофобными «хвостами» и двумя полярными группами, связанными между собой спейсорной группой. В иностранной литературе отмечалась их высокая поверхностная активность, многообразие морфологии структур, образующихся в межфазных слоях частиц, и низкие адгезивные свойства.

Эти данные позволили предполагать, что изучение таких веществ в качестве ПАВ при гетерофазной полимеризации откроет перспективы синтеза полимерных суспензий с заданными свойствами и размерами частиц и расширит границы применимости полученных результатов.

Карбоксилсодержащие гемини-ПАВ были синтезированы в ГНИИХТЭОС и предоставлены для изучения их в качестве стабилизаторов при синтезе полимерных суспензий для биотехнологии. Общая формула этого ПАВ,,– бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксана, представлена ниже:

HOOC—(CH2)10—(Me2SiO)30—SiMe2(CH2)10—COOH Это ПАВ принципиально отличается по строению от -(карбоксиэтил)триметилсилокси)полидиметилсилоксана, ПДС: ПДС состоит из олигосилоксановой цепи и одной карбоксильной группы, а КС – двух силоксановых цепей и двух карбоксильных групп.

Так как в литературе свойства этого типа ПАВ не описаны, оно впервые использовалось в качестве стабилизаторов полимерных микросфер, исследования были начаты с изучения его коллоидно-химических свойств.

,–бис[10-карбоксидецил]полидиметилсилоксан (КС) практически нерастворим в воде и хорошо растворим в стироле, коэффициент распределения, характеризующий отношение растворимости КС в воде к растворимости в стироле составляет 9*10-4. Стабилизатор обладает поверхностно-активными свойствами и снижает межфазное натяжение, 1,2 на границе толуольный раствор КС – вода до 28 мДж/м2 (рис.3). Максимальная адсорбция КС Гмаx составляет 3,3*10-6 моль/м2, площадь поверхности, занимаемая молекулой стабилизатора, равна 75 2, а поверхностная активность G=5,6 мН*м2/моль.

Полимеризация стирола в присутствии КС, как и в присутствии ПДС, протекает в прямой эмульсии, образование ПМЧ происходит из микрокапель мономера, размер которых определяется 1,2, концентрацией инициатора, эффективностью инициирования и объемным соотношением мономер/водная фаза.

Образующийся полимер несовместим с КС, и с ранних конверсий мономера он принудительно вытесняет КС на границу раздела фаз, формируя оболочку ПМЧ.

Образование оболочки частиц из кремнийорганического ПАВ придает им специфические свойства, присущие кремнийорганическим полимерам, например, гидрофобность, низкую адгезию, эластичность, устойчивость к агрессивным средам.

Частицы сохраняют сферическую форму и узкое распределение по размерам (рис. 3) с ранних конверсий мономера (10%) до полного превращения мономера в полимер.

Рисунок 3. Микрофотографии полистирольных частиц и гистограммы распределения полистирольных частиц по размерам, полученных в присутствии 1% КС и 1% ПК при разных Известно, что при гетерофазной полимеризации виниловых мономеров диаметр частиц и распределение их по размерам зависят от нескольких факторов: температуры полимеризации, скорости перемешивания, концентрации инициатора и стабилизатора, объемного соотношения мономер/водная фаза.

Влияние температуры на скорость полимеризации стирола и размер частиц полимерных суспензий изучали при объемном соотношении стирол/вода, равном 1:9, концентрациях инициатора ПК и стабилизатора КС, равных 1%масс. в расчете на стирол.

Увеличение температуры от 60°С до 80°С приводило к повышению скорости полимеризации и уменьшению размеров частиц (от 0,65 мкм при 60°С до 0,55 мкм при 80°С) (рис.4). Снижение температуры ниже 60С приводило к потере устойчивости реакционной системы. Энергия активации Еа составила 25,59 ккал/моль. Дальнейшие исследования проводили при температуре 80°С.

Диаметры полимерных микросфер и их распределение по размерам в значительной степени зависят от природы инициатора и его концентрации.

Обычно в качестве инициатора применяют водорастворимый инициатор персульфат калия. Его выбор обусловлен высокой эффективностью инициирования, вхождением в состав полимера ионогенных фрагментов молекулы (SO4-), участвующих в формировании электростатического фактора устойчивости в межфазных слоях частиц.

Скорость полимеризации стирола в эмульсии, инициированной персульфатом калия, намного выше инициированной любым маслорастворимым инициатором.

Для исследования влияния природы инициатора и его концентрации на кинетические закономерности полимеризации, были выбраны динитрил азоизомасляной кислоты, ДАК, и персульфат калия. Полимеризацию стирола проводили в одинаковых условиях при температуре 60°С. Были сравнены значения диаметров частиц, распределение их по размерам и устойчивости реакционной системы.

Результаты приведены на рисунке 5 и в таблице 2. Видно, что замена водорастворимого инициатора на растворимый в мономерной фазе не повлияла на устойчивость реакционной системы и распределение частиц по размерам.

Рисунок 5. Микрофотографии полистирольных частиц и гистограммы распределения частиц по размерам, полученных в присутствии: 1- ПК; 2- ДАК.

Таблица 2. Характеристики полистирольных суспензий, стабилизированных КС с водорастворимым (ПК) и маслорастворимым (ДАК) инициаторами Инициатор Средний диаметр частиц, мкм Полидисперсность Dw/Dn Коагулюм Таблица 3. Влияние концентрации ПК на характеристики полистирольных суспензий.

Таким образом, для обеспечения устойчивости полимерным микросферам на всех стадиях процесса их синтеза оказалось достаточным структурномеханического фактора стабильности, образуемого ПАВ.

Зависимость скорости полимеризации и молекулярной массы полимеров от концентрации инициатора соответствовала закону радикальной полимеризации.

Видно, что изменяя концентрацию инициатора можно синтезировать полимерные микросферы с заданными свойствами и средними диаметрами 0, и 0,55 мкм, устойчивые в физиологических растворах и при хранении.

Известно, что увеличение концентрации водорастворимого ПАВ приводит к повышению скорости полимеризации и уменьшению диаметра частиц. Это обусловлено увеличением числа частиц и их устойчивости. Иная зависимость наблюдается при увеличении концентрации нерастворимого в воде ПАВ: с увеличением концентрации ПАВ скорость полимеризации уменьшается, а диаметр частиц увеличивается (рис.6). При этом было показано, что устойчивость реакционной системы высокая, распределение частиц по размерам узкое.

Снижение скорости полимеризации можно объяснить уменьшением числа ПМЧ, а это, в свою очередь, связано с падением интенсивности диспергирования капель мономера в присутствии олигомерного кремнийорганического ПАВ.

Полученные результаты приведены в таблице 4. Видно, что изменяя концентрацию КС, можно синтезировать полимерные микросферы с диаметрами 0,55, 0,58 и 0,65 мкм и узким распределением по размерам. Все полимерные микросферы соответствовали требованиям, предъявляемым для использования в биотехнологии.

Рисунок 6. Микрофотографии частиц и гистограммы распределения полистирольных частиц по размерам, полученные в присутствии различных концентраций КС, моль/л*103: 1- 6, Таблица 4. Характеристики полистирольных суспензий при различной концентрации КС Все приведенные выше исследования проводили при объемном соотношении мономер/водная фаза, равном 1:9.

Увеличение объемного содержания мономера при сохранении постоянным концентрации инициатора и КС приводит к увеличению диаметра частиц.

Чтобы оценить влияние концентрации мономера на диаметр частиц и их распределение по размерам в присутствии КС, полимеризацию стирола проводили в тех же условиях (1% ПАВ и 1% ПК в расчете на мономер, T=80C) в интервале объемных соотношений мономер/водная фаза – от 1:2 до 1:9.

Видно (рис.7), что характер кинетических кривых конверсия-время не изменился. С увеличением объемного содержания мономера в эмульсии (от 1: до 1:6) при сохранении постоянными концентрации инициатора и стабилизатора устойчивость реакционной системы сохраняется высокой, о чем свидетельствуют данные об отсутствии коагулюма (таблица 5), а образующиеся полимерные суспензии характеризуются узким распределением частиц по размерам. Полимерная суспензия, полученная при объемном соотношении фаз 1:2, оказалась неустойчивой.

Конверсия, % Таблица 5. Характеристики полистирольных суспензий, стабилизированных КС при различном объемном соотношении фаз.

Соотношение фаз Средний диаметр Полидисперсность Коагулюм Устойчивость не удалось получить при увеличении концентрации стабилизатора более 10%масс. в расчете на мономер.

И только в присутствии смеси КС и полиоксиалкиленорганосилоксанового блоксополимера (ПООСБ) удалось провести полимеризацию стирола при высокой концентрации мономера в эмульсии (объемное соотношение стирольный раствор КС+ПООСБ/вода составляло 1:2). Повышение устойчивости полимерных микросфер объясняется участием полиоксиалкиленорганосилоксанового блоксополимера в формировании межфазного слоя. Более высокомолекулярный ПООСБ (ММ 4375), обладая меньшей совместимостью с образующимся полистиролом с большей скоростью вытесняется на межфазную границу. При этом из него формируется каркас тонкой пленки. Затем в этот каркас происходит подстройка КС, имеющего меньшую несовместимость с полистиролом. Таким образом преодолеваются кинетические несогласования между процессом формирования новой границы раздела фаз при объемном соотношении мономер/вода, равном 1:2, и скоростью формирования стабилизирующей пленки. Особое значение рассматриваемый факт имеет на начальной стадии полимеризации в момент образования ПМЧ.

Полимеризацию проводили при объемном соотношении фаз 1:2, концентрации инициатора ПК, равной 1%, концентрации КС, равной 1%масс.

на мономер, ПООСБ, равной 0,5%масс. на мономер, T=80C. Кривая конверсия – время приведена на рисунке 8.

Конверсия, % Таблица 6. Характеристики полистирольных суспензий при различной концентрации КС, а также при добавлении ПООСБ (с.ф. 1:2).

по размерам при объемном соотношении фаз мономер/вода 1:2, полученные при использовании: 1) 1% КС и 0,5% ПООСБ; 2) 2% КС и 0,1% ПООСБ.

Полученная полимерная суспензия отличалась устойчивостью (отсутствие коагулюма) и узким распределением частиц по размерам. Концентрацию ПООСБ удалось снизить до 0,1% в расчете на мономер, сохранив необходимые свойства полимерной суспензии, варьируя масс. соотношения ПАВ (таблица 6).

Микрофотографии и гистограммы распределения частиц по размерам приведены на рисунке 9.

Таким образом, в результате проведенных исследований были определены оптимальные условия синтеза полистирольных суспензий, отвечающих предъявляемым требованиям, с размерами частиц в интервале от 0,5 до 1,6мкм.

Полимеризация протекает до полной конверсии мономера за 9-12 часов (в зависимости от объемного соотношения стирол/вода).

3.3. Синтез карбоксилсодержащих полиметилметакрилатных суспензий Гетерофазную полимеризацию полярного мономера – метилметакрилата (ММА) проводили в тех же условиях: объемное соотношение фаз мономер/вода – от 1:2 до 1:9; концентрация персульфата калия – 1% масс. в расчете на мономер; концентрация КС – 1% масс. в расчете на мономер; температура полимеризации – 80°С.

На рисунке 10 приведены кривые конверсия-время. Видно, что кинетические кривые имеют характерный для гетерофазной полимеризации вид.

Отличительной особенностью наблюдаемых зависимостей является наличие гель-эффекта при конверсии ММА выше 30%. До 80 – 90%-ной конверсии полимеризация протекает с постоянной скоростью, обусловленной конкуренцией между увеличивающейся скоростью процесса из-за гель-эффекта и ее снижением в результате уменьшения концентрации мономера.

Зависимости скорости полимеризации, диаметра и распределения частиц по размерам от концентрации мономера аналогичны наблюдаемым при полимеризации стирола (таблица 7).

Полимерные суспензии, полученные при полимеризации ММА в присутствии КС, также как и полистирольные суспензии, отличаются устойчивостью с самых ранних конверсий мономера, о чем свидетельствуют данные об отсутствии коагулюма в суспензиях. Частицы имеют сферическую форму и узкое распределение по размерам (рис.11).

Конверсия, % Проведенные исследования позволили разработать рецептуры синтеза полиметилметакрилатных частиц с узким распределением по размерам в интервале диаметров от 0,37 до 0,65 мкм.

Рисунок 11. Микрофотографии полиметилметакрилатных частиц и гистограммы распределения их по размерам при разном соотношении фаз мономер/вода: 1 – 1:9; 2- 1:6; 3- 1:4; 4- 1:2.

стабилизированных КС при различном соотношении фаз.

Соотношение фаз Среднечисловой диаметр Полидисперсность Коагулюм Полистирольные суспензии с большим размером частиц получали последовательной затравочной полимеризацией стирола. В качестве исходных затравочных частиц использовали полистирол-дивинилбензольные микросферы с диаметром 2 мкм. Вначале проводили набухание полимерной суспензии затравочных частиц мономером с растворенным в нем инициатором (ДАК) и кремнийорганическим ПАВ (,–бис[10карбоксидецил]полидиметилсилоксаном) при комнатной температуре в течение Таблица 8. Рецептура проведения затравочной полимеризации.

Полимерная фаза (затравочные полистирольные частицы) 24 часов. Затем проводили затравочную полимеризацию мономера в течение часов при 70°С. Рецептура получения полистирольной суспензии с диаметром частиц 5,9 мкм и с функциональными (карбоксильными) группами на поверхности представлена в таблице 8. Видно, что полученные полимерные микросферы имеют узкое РЧР (рис.12).

3.5. Разработка метода анализа 3-х мерной организации сосудистого русла Основным методом исследования сосудистого русла предполагается использовать флуоресцентную конфокальную микроскопию, что требует заполнения сосудов окрашенными флуоресцентным красителем полимерными микросферами.

Окрашивание полимерных микросфер флуоресцентным красителем проводили по описанной в патентах методике. В качестве красителя был выбран магдаловый красный. Полимерные микросферы набухали в ацетоне, в котором растворен краситель требуемой концентрации.

Вначале были определены пороговые концентрации красителя с достаточным откликом флуоресценции. Для полистирольных и полиметилметакрилатных суспензий пороговая концентрация красителя составляет 0,1 – 0,2%об.

После окрашивания изучали агрегативную устойчивость полимерных суспензий в физиологических средах для того, чтобы исключить агрегацию микросфер и, как следствие, закупорку сосудов агрегатами при перфузии. Для применения были пригодны полимерные микросферы, устойчивые в растворе электролита (NaCl) с концентрацией не менее 0,15 М. Все полимерные суспензии характеризовались устойчивостью в физиологических растворах.

Таблица 9. Агрегативная устойчивость микросфер в различных средах.

Наряду с изучением агрегативной устойчивости полимерных микросфер в растворах электролитов было проведено изучение агрегативной устойчивости микросфер в различных растворах, применяющихся в медицине для замещения кровопотери при внутривенном переливании крови. Оказалось, что полистирольные и полиметилметакрилатные микросферы устойчивы в растворах поливидона, 10%-ном растворе фруктозы и 2,6%-ном растворе сахарозы (таблица 9). Данные растворы могут служить вариантом выбора при проведении экспериментов по заполнению сосудистого русла экспериментальных животных полимерными микросферами.

Окрашенные полимерные микросферы использовали для заполнения сосудистого русла крыс. Для анализа были выбраны фрагменты брыжейки тонкого кишечника.

Перед анализом в световом микроскопе препараты просветлялись путем плавного перевода через серию водных растворов фруктозы с восходящей концентрацией. Эта методика была выбрана, поскольку краситель, магдаловый красный, практически не растворим в воде. Препараты пропитывали фруктозой (показатель преломления 80%-ного раствора фруктозы n=1,49, который близок к показателю преломления неокрашенных тканей экспериментальных животных).

Фотографии были выполнены с помощью светового микроскопа.

Результаты просветления показаны на рисунке 13.

На микрофотографии 13 А представлен фрагмент микрососудистого русла, заполненного микросферами диаметром 6 мкм, окрашенными магдаловым красным. Четко видны микросферы и хорошо видно, что микрососуд (1) имеет несколько ветвей (2,3,4), 2 из которых (2 и 4) находятся не в фокусе и выглядят размытыми. Внутри просвета ветви (3) микросферы расположены в один ряд, ветвь заполнена на расстояние 24 мкм. Вероятно, дальнейшее продвижение микросфер по этой ветви было остановлено наличием сужения. Размытые линии (5) на микрофотографии являются границами жировых клеток.

Рисунок 13. Кровеносные сосуды брыжейки крысы, заполненные микросферами диаметром Видно, что полимерные микросферы плотно заполнили сосудистое русло и останавливаются в том месте, где внутренний диаметр сосуда становится меньше диаметра микросфер. Следовательно, данный подход позволяет анализировать артериальную часть сосудистого русла. В сосудистом русле существуют «шунты», позволяющие крови, минуя капилляры попадать в венозное русло, и диаметр которых сопоставим с диаметром артерий. Поэтому не исключается возможность попадания микросфер диаметром 6 мкм в венозное русло. Однако, в тех участках, где мы проводили исследования, вен, заполненных микросферами, обнаружено не было. Но это необходимо принимать во внимание при дальнейших исследованиях.

На микрофотографии 13 Б представлен фрагмент микрососудистого русла, заполненного микросферами диаметром 0,4 мкм, окрашенными магдаловым красным. Четко виден сосуд (1), имеющий 2 ответвления (2 и 3). Хорошо видно, что сосуд заполнен окрашенными микросферами.

Просветленные препараты, заполненные полиметилметакрилатными микросферами с диаметром частиц 0,4мкм и полистирольными микросферами с диаметром частиц 6мкм, окрашенными флуоресцентным красителем, магдаловым красным, исследовались на конфокальном микроскопе Nikon Eclipse C1 plus.

На микрофотографии 14 Б представлен фрагмент микрососудистого русла, заполненного микросферами диаметром 0,4 мкм, окрашенными магдаловым красным. Виден раздваивающийся сосуд (1), плотно заполненный микросферами, и вена (2).

Рисунок 14. Микрососуды брыжейки крысы. А - капилляр (заполнен суспензией с размером частиц 6 мкм); Б – артериола (1) и венула (2) (заполнены суспензией с размером частиц 0, мкм); В – артериола (заполнена суспензией с размером частиц 0,4 мкм).

На микрофотографии 14 В видна артериола (1), от которой вправо и влево отходят 4 ветви. Ветви (2) и (3) делятся на капилляры со средним диаметром 4 мкм.

Интенсивность флуоресценции артериолы (1) в левом верхнем углу фотографии меньше, чем по всей длине артериолы, что говорит о том, что эта часть артериолы находится выше плоскости оптического среза (4).

Для селективного анализа сосудов разного диаметра необходимо использовать набор полимерных микросфер разного размера. В качестве примера, на микрофотографии 14 А показано заполнение капилляра микросферами с размером 6 мкм. Это позволит анализировать полную картину 3-х мерного ветвления сосудов в процессе ангиогенеза в условиях нормы и патологии.

Была выполнена серия оптических срезов (ОС) препарата (рис.15), заполненного полиметилметакрилатными микросферами с диаметром 0,4 мкм.

Оптические срезы были сделаны через каждые 25 мкм по глубине препарата от поверхности до основания. Исследуемый препарат имел толщину 275 мкм.

Полученные данные дают возможность определить плотность (количество) сосудов в объеме препарата с помощью программы ImageJ. В этой программе есть возможность сделать проекцию всех ОС на основание препарата по схеме, приведенной на рисунке 16. Из полученного изображения (рис.17) возможно определить площадь сосудов в препарате и, зная толщину препарата, представляется возможным рассчитать количество сосудов в его объеме.

1.Поверхность преперата 2. ОС на глубине 25 мкм 3. ОС на глубине 50 мкм 4. ОС на глубине 75 мкм 5. ОС на глубине 100 мкм 6. ОС на глубине 125 мкм 7.ОС на глубине 150 мкм 8. ОС на глубине 175 мкм 9. ОС на глубине 200 мкм 10. ОС на глубине 225 мкм 11. ОС на глубине 250 мкм 12. ОС на глубине 275 мкм Рисунок 15. Серия оптических срезов (ОС), сделанных на расстоянии 25 мкм друг от друга Таким образом, была разработана методика анализа сосудов, основным преимуществом которой является возможность построения трехмерной модели, позволяющей проанализировать плотность (количество) сосудов в объеме препарата, а так же определить их пространственное положение.

Полученные полимерные микросферы характеризуются высокой стабильностью во времени, наличием карбоксильных групп на поверхности, агрегативной устойчивостью в растворах электролитов. Эти свойства позволяют использовать при создании иммунодиагностических тест-систем.

Синтезированные полимерные микросферы были переданы для испытаний в институт физико-химической медицины, где на их основе были разработаны модельные тест-системы, которые показали высокую специфичность и чувствительность. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные полимерные микросферы для создания различных тестсистем медицинского назначения.

ВЫВОДЫ:

Синтезированы карбоксилсодержащие полимерные микросферы различной природы с диаметрами частиц в интервале 0,3 – 1,6 мкм и 6, мкм с узким распределением по размерам, и на их основе создана методика анализа архитектуры сосудистого русла.

Для создания метода анализа структуры сосудистого русла с различным диаметром синтезированы полимерные суспензии трех типов:

полистиролметакриловые, полистирольные и полиметилметакрилатные.

Все полимерные суспензии имели узкое распределение по диаметрам, не содержали ассоциатов, были устойчивы в буферных растворах и при Впервые в качестве ПАВ для синтеза полистирольных и полиметилметакрилатных суспензий использован новый тип кремнийорганического функционального ПАВ,–бис[10карбоксидецил]полидиметилсилоксан. Изучены его коллоиднохимические свойства.

Предложен новый подход к созданию методики анализа сосудов, позволяющий с помощью конфокальной микроскопии построить трехмерную модель сосудистого русла.

На примере полистирольных микросфер с диаметром 6 мкм, окрашенными люминесцентным красителем, показана возможность с помощью конфокальной микроскопии увидеть архитектуру артериального русла.

Полученные полимерные микросферы были рекомендованы для создания диагностических тест-систем медицинского назначения.

Список печатных работ:

Статьи, опубликованные в журналах ВАК:

кремнийорганических ПАВ различной природы / И.А. Грицкова, Е.Н.

Левшенко, Е.Р. Мансурова, И.В. Хачатурян, Н.И. Прокопов, Г.А. Симакова, В.М. Копылов // Вестник МИТХТ. – 2008. – Т. 3. – №5. – С. 111-114.

2. Грицкова И.А. Полимеризация стирола в присутствии поверхностноактивных кремнийорганических веществ различной природы / И.А.

Грицкова, В.М. Копылов, Г.А. Симакова, С.А. Гусев, И.Ю. Маркузе, Е.Н.

Левшенко // Высокомолекулярные соединения. – 2010. – серия А. – Т. 52. – №7. – С.1-7.

3. Волкова Е.В. Полимеризация метилметакрилата в присутствии кремнийорганических ПАВ / Е.В. Волкова, И.А. Грицкова, Л.А. Злыднева, Е.Н. Левшенко, Н.В. Рассоха, П.Н. Чадаев, Д.И. Шрагин // Известия ВУЗов.

– Химия и химическая технология. – 2011. – Т.54. – №9. – С.70-73.

4. Солодухина Н.М. Полистирольные микросферы как носители биолиганда при определении -9-тетрагидроканнабинола в моче человека / Н.М.

Солодухина, Л.А. Злыднева, Е.Н. Левшенко, М.А. Мягкова, И.А. Грицкова // Биотехнология. – 2012. – №1. – С. 90-96.

иммунофлуоресцентного анализа / Е.В. Волкова, И.А. Грицкова, С.А. Гусев, А.Д. Лукашевич, А.А. Гусев, Е.Н. Левшенко, Л.А. Злыднева, К.О. Сочилина // Биотехнология. – 2012. – №4. – С.74-77.

Тезисы докладов в других изданиях:

6. Грицкова И.А. Полимеризация стирола в присутствии кремнийорганических ПАВ различной природы / И.А. Грицкова, Е.Н.

Левшенко, И.В. Хачатурян, Н.И. Прокопов, В.М. Копылов // Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: тез.

докл. Междунар. научно-практич. конф. 22-25 сентября 2008г. – Москва, 2008. – С. 35.

7. Мансурова Е.Р. Полимеризация стирола в присутствии кремнийорганических ПАВ различной природы / Е.Р. Мансурова, Е.Н.

Левшенко // Ломоносов-2009: тез. докл. XVI Международн. конф.

студентов, аспирантов и молодых ученых. 13–18 апреля 2009 г. – Москва, 2009. – С.67.

8. Злыднева Л.А. Полимеризация стирола в присутствии поверхностноактивных кремнийорганических веществ / Л.А. Злыднева, Е.Н. Левшенко // Ломоносов-2010: тез. докл. Международ. молодежн. науч. форума. 12– апреля 2010 г. – Москва, 2010. – С. 81.

9. Злыднева Л.А. Полимеризация стирола в присутствии кремнийорганических поверхностно-активных веществ для создания полимерных носителей биолигандов / Л.А. Злыднева, Е.В. Волкова, Е.Н. Левшенко, Н.В. Рассоха, И.А. Грицкова, С.А. Гусев // Поверхностно-активные вещества в технологических процессах: тез. докл. Науч. секции ПАВ Науч. совета по коллоид. химии и физико-химич. механике РАН. 21-22 сентября 2010г. – Москва, 2010. – С.12.

Подписано в печать 26.10. Типография ООО “Генезис” 119571, г. Москва, пр-т Вернадского,