На правах рукописи

ТРУБНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ У

ЖИТЕЛЕЙ КУРСКОЙ ОБЛАСТИ И ВКЛАД ПОЛИМОРФИЗМОВ

ГЕНОВ ФАКТОРОВ ИХ ТРАНСКРИПЦИИ И ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ

БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В ЕЁ ФОРМИРОВАНИЁ

03.07.02 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2012 1

Работа выполнена на базах научно-исследовательской лаборатории «Генетика» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный университет» и лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, акадеИванов Владимир Петрович мик РАЕН, заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой биологии, медицинской генетики и экологии ФГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития РФ

Официальные оппоненты:

доктор биологиеских наук, профессор, завеСпицин Виктор Алексеевич дующий лабораторией экологической генетики Государственного учреждения

МГНЦ РАМН

Доктор медицинских наук, профессор, и.о.

Шипков Валерий Петрович заведующего кафедрой биологии и общей генетики ФГБОУ ВПО Российского университета дружбы народов Доктор биологичексих наук, профессор, завеШевелёв Алексей Борисович дующий лабораторией биоинженерии ФГБУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный университет»

Защита состоится 26 декабря в часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. МиклухоМаклая, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент О.Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Основой существования живых систем является обмен веществ и энергии, а также способность сохранять динамичное равновесие всех внутренних процессов вне зависимости от условий окружающей среды [Грин Н и др., 2005, Ярыгин В.Н., 2010].

При несогласовании внутренней координации нарушается установленный баланс и возникают различные патологические состояния, которые в некоторых случаях могут характеризоваться широким спектром симптомокомплексов [Бочков Н.П, 2002]. У человека одной из интегрирующих систем организма является кровеносная, которая реализует свои функции за счет составляющих [Воробьёв А.И., 1990]. Единственными клетками переферической крови, способными модифицировать собственный пролиферативный статус являются лейкоциты, из которых максимальное количество составляет группа лимфоцитов (от 25 до 50%) [Волкова М.А. 2001;

http://medbiol.ru/medbiol/immunology/0007a025.htm; Кассирский, И.А. Алексеев, Г.А., 1990.;]. Пролиферация и последующая дифференцировка, не зависимо от тканевой принадлежности, в любой клетке обеспечивается функционированием белоксинтетического аппарата, начиная с молекулы ДНК и заканчивая посттрансляционной модификацией [Вейко Н.Н., 2001, Газарян К.Г., 1983].

Существует большое количество механизмов, способных тем или иным образом изменять уровень белкового синтеза, среди которых выделяют три основные группы: регуляцию на этапе транскрипции, процессинга и трансляции [Сингер М, 1998; Зайцева Г.Н., 1994, Мушкамбаров Н.Н., 2003, Заяц Г.Р., 2002]. Если в первом случае скорость в большей степени зависит от сохранности матрицы и от качественного и количественного состава факторов транскрипции, то во втором – от наличия соответствующих ферментов. В третьем – от количества функционирующих рибосом:

чем больше рибосом в клетке, тем больше количество белков [Сингер М, 1998]. Информация о нуклеиновом остове рибосом, в свою очередь, закодирована в последовательности так называемых рибосомных генов, которые являются уникальными в своем роде [Прокофьева-Бельговская А.А., 1969, Ляпунова Н.А., 2001].

Рибосомные гены – это участки молекулы ДНК, у человека локализованные в парах акроцентрических хромосом [Ляпунова Н.А., 2001; Захаров А.Ф., 1982; Колчанова И.О., 2005] и кодирующие транскрипцию 45S предшественника рРНК (13 т.п.н.) [Мамаев Н.Н., 1992; Worton RG, 1988].

В результате процессинга под действием рибонуклеаз из первичного транскрипта выщепляются три функциональные структуры - 28S, 18S и 5,8S рРНК, которые в комплексе с рибосомными белками и низкомолекулярной 5S [Тимофеева М.Я., 1993] рРНК формируют каркас малой и большой субъчастиц рибосомы [Сингер М, 1998].

На каждой хромосоме РГ собраны в кластеры, разделенные спейсерами, и многократно повторены [Зацепина О.В., 1995]. В период деления клетки эти участки не спирализуются, образуя вторичные перетяжки, и удерживают некоторые элементы комплекса транскрипции [Сабанеева Е.В., 1989]. В период интерфазы интенсивность их активности настолько высока, что в ядре они визуализируются как отдельные морфологические структуры – ядрышки [Созанский О.А., 1983], а соответствующие участки ДНК носят названия ядрышкообразующих районов [Зацепина О.В., 1988, Тимофеева М.Я., 1993].

Таким образом, именно функциональная активность рибосомных генов (ФАРГ), на базовом уровне, определяет интенсивность основного обмена.

Необходимость изучения механизмов – в целом и поиска факторов – в частности, способных модифицировать экспрессию РГ и потребность в дальнейшем расширении представлений о состоянии генетического материала на фоне ухудшающейся экологической обстановки определили актуальность проведения настоящего исследования.

Цель исследования Изучить особенности комплекса показателей функциональной активности рибосомных генов у жителей Курской области и вклад полиморфизмов генов факторов их транскрипции и генов ферментов биотрансформации кенобиотиков в её формирование Задачи исследования 1. Изучить уровень функциональной активности рибосомных генов у русского населения Курской области Российской Федерации.

2. Рассмотреть особенности внутрикомплексного взаимодействия показателей функциональной активности рибосомных генов в курской популяции.

2. Сравнить уровень внутрикомплексной сопряженности показателей функциональной активности рибосомных генов при трех патогенетически самостоятельных группах мультифакториальных заболеваний: детских церебральных параличах, детских аллергозах (бронхиальной астме, атопическом дерматите и аллергическом рините) и патологии дыхательной системы (хронической обструктивной болезни легких и профессиональном бронхите).

3. Изучить популяционную распространенность полиморфных вариантов генов факторов транскрипции рибосомных генов и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков среди русских жителей Курской области Российской Федерации.

4. Провести анализ ассоциаций полиморфизмов генов факторов транскрипции рибосомных генов и ферментов детоксикации с предрасположенностью к каждой из групп рассматриваемых мультифакториальных заболеваний.

5. Исследовать влияние полиморфизмов генов факторов транскрипции РГ и ферментов детоксикации на показатели функциональной активности рибосомных генов для здоровых жителей Курской области в различных возрастных группах и с учетом полового диморфизма, а также в пределах каждого из рассматриваемых заболеваний.

6. Установить особенности проявления связей парных сочетаний генных маркеров с количественными характеристиками комплекса функциональной активности рибосомных генов в каждой из рассматриваемых групп.

7. Разработать концептуальную модель вовлеченности полиморфизма генов факторов транскрипции РГ и ферментов детоксикации в формирование модификационной изменчивости уровней функциональной активности рибосомных генов у человека.

Научная новизна исследования Основным научным результатом исследования явилось впервые проведенное изучение внутрикомплексной взаимосвязи цитогенетических показателей функциональной активности рибосомных генов у человека, как в норме, так и при трех патогенетические самостоятельных группах мультифакториальных заболеваний: детских церебральных параличах, детских аллергозах (бронхиальной астме, атопическом дерматите и аллергическом рините) и патологии лёгких (хронической обструктивной болезни легких и профессионаном бронхите) на примере коренных жителей Курской области. Также впервые определена роль полиморфизмов генов факторов транскрипции рибосомных генов и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в формировании показателей функциональной активности рибосомных генов для рассматриваемых групп. Впервые доказана зависимость уровня функциональной активности рибосомных генов от полиморфизмов изучаемых генов, как для здоровых, так и для больных жителей Курской области разных возрастных групп. Впервые установлены особенности влияния парных сочетаний генных маркеров на количественные характеристики комплекса функциональной активности рибосомных генов при различных мультифакториальных патологиях. Впервые разработана концептуальная модель вовлеченности полиморфизма генов факторов транскрипции рибосомных генов и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в модификацию уровня функциональной активности рибосомных генов у человека. Впервые было установлено, что в основе формирования генетической предрасположенности к патогенетически самостоятельным нозологическим формам мультифакториальных заболеваний лежат структурно-функциональные особенности взаимодействия генов ферментов детоксикации и генов факторов транскрипции рибосомных генов, а также цитогенетических особенностей показателей функциональной активности рибосомных генов.

Научно-практическая значимость работы Результаты выполненной работы открывают новые перспективы для более глубокого понимая процессов функционирования и регуляции транскрипционного комплекса рибосомных генов у человека, для изучения цитогенетических и молекулярногенетических механизмов, посредством которых полиморфные варианты генов факторов транскрипции рибосомных генов, а также ферментов детоксикации, вовлекаются в развитие и патогенез не только детских церебральных параличей, детских аллергозов, патологии лёгких, но и многих других распространенных мультифакториальных заболеваний. Для доклинической диагностики мультифакториальных заболеваний генетическое тестирование полиморфизмов генов факторов транскрипции рибосомных генов и генов ферментов детоксикации ксенобиотиков в комплексе с цитогенетическими характеристиками показателей функциональной активности рибосомных генов позволяет не только выявить ключевые межгенные взаимодействия, но и идентифицировать спектр возможных средовых факторов, способных спровоцировать возникновение или обострение той или иной патологии.

Полученные в результате генетического тестирования данные могут быть применены для определения подходов к профилактике мультифакториальной патологии в отягощенных семьях в рамках медико-генетического консультирования. Полученная концептуальная модель вовлеченности полиморфизма генов факторов транскрипции рибосомных генов и ферментов детоксикации в модификацию уровня функциональной активности рибосомных генов открывает широкие возможности для практического применения элементов индивидуальной генотип-специфической терапии и профилактики широкого спектра мультифакториальных заболеваний, посредством контроля над потенциально регулируемыми средовыми факторами риска.

Полученные данные также представляют интерес для специалистов в области цитогенетики, генетики развития, молекулярной генетики, пренатальной генетической диагностики, детской невропатологии и аллергологии, специалистовофтальмологов, терапевтов и профпатологов.

Полученные результаты рекомендуются к использованию при чтении специальных курсов по медицинской и клинической генетике, биохимии, патофизиологии, внутренним болезням в вузах медицинского и медико-биологического профиля, а также на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Установлены показатели комплекса функциональной активности рибосомных генов для жителей Курской популяции с учетом полового диморфизма и возрастного состава.

2. Показатели функциональной активности рибосомных генов среди больных ДЦП, в группе с детскими аллергозами и при патологии лёгких характеризуются своими особенностями. У детей с ДЦП установлено снижение показаний функциональной активности рибосомных генов (18,69 у.е.) в сравнении с контролем (19, у.е.). Другие нозологические формы статистически значимо не отличались от популяционных данных.

3. Частоты генотипов полиморфизмов генов TP53, DNMT3B, TAF1B, CYP1A1, EPHX1, GSTM1, GSTT1, GSTP среди жителей популяции Курской области и больными рассматриваемых нозологических форм (ДЦП, аллергозы и патология лёгочной системы).

4. Формирование ДЦП ассоциировалось с увеличением частоты вариантного аллеля С гена TAF1B; предрасположенность к аллергозам с геном TP53; патология легких – с аллельными вариантами двух полиморфных генов фактора транскрипции рибосомных генов TAF1B и EPHX.

5. Доказана связь изучаемых полиморфизмов факторов транскрипции рибосомных генов и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с отдельными цитогенетическими показателями функциональной активности рибосомных генов как в общей популяции, так и среди больных отдельных нозологических форм.

6. Установлено влияние отдельных парных сочетаний исследуемых полиморфизмов генов факторов транскрипции рибосомных генов и ферментов биотрансформации ксенобиотиков на показатели функциональной активности рибосомных генов, как в общей популяции, так и среди больных отдельных нозологических форм.

Внедрение в практику Результаты исследования внедрены в работу Курской областной детской клинической больницы, лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, научно-исследовательской лаборатории «Генетика»

Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Курского государственного университета, кафедры общей биологии Курского государственного университета, областной медикогенетической консультации, научно-исследовательской лаборатории биохимии и молекулярно-генетического анализа Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»), в учебный процесс кафедры биологии и методики её преподавания Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Набережночелнинский институт социально-педагогических технологий и ресурсов».

Апробация работы и публикации Результаты работы представлены на IV международной научно-практической конференции «Динамика научных достижений – 2005» (Днепропетровск, 2005), международного научного форума «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005), I Всероссийской конференции молодых учёных (Воронеж, 2007), IV международной медикопрактической конференции «Знание и технологии: взгляд в будущее – 2008» (Днепропетровск, 2008), итоговой научной сессии КГМУ и отделения медикобиологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2005ежегодной Международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 2005-2012), Международного медицинского конгресса студентов и молодых ученых (Тернополь, Украина, 2009), Международной конференции «Теоретические и прикладные проблемы социально-правовых, медико-биологических и техникоэкономических сфер жизни общества» (Курск, 2008, 2009), V Съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (Москва, 2009), Международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Охрана репродуктивного здоровья – будущее России» (Белгород, 2010), V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2010), VI Съезда Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), II Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии», (Курск, 2011), IV международном молодежном исследовательском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения»

(Санкт-Петербург, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании’2011» (Одесса, 2011), Международной научно-практической конференции «Современная медицина: тенденции развития» (Новосибирск, 2011), IV Республиканской научно-практической конференции с международным участием студентов и молодых ученых «Проблемы и перспективы развития современной медицины» (Гомель, 2012). По материалам диссертации опубликовано 42 печатных работ, четыре монографии. Диссертантом получен диплом на открытие.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка и приложения. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 53 таблицы и 22 рисунков. Библиографический список литературы включает 411 источников, 105 из которых на русском языке, 306 – зарубежные.

Личный вклад автора Диссертационная работа представляет собой законченный, самостоятельно выполненный автором труд. Все представленные в диссертации результаты получены лично Трубниковой Е.В. на базе научно-исследовательской лаборатории «Генетика»

ГБОУ ВПО «Курский государственный университет» (цитогенетическая часть) и лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ (молекулярно-генетическая часть). Ею проведена комплексная статистическая обработка и анализ сформированной базы данных, проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертации, получены и обобщены результаты исследования. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследований с долей личного участия автора от 75 до 85%.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования послужила популяционная выборка (n=1764) неродственных индивидов русских жителей Курской области Российской Федерации, которая включала в себя две крупные группы – детей (до 18 лет) и взрослых (от лет и старше). В рамках данных групп отдельно рассматривались выборки: детей с церебральными параличами (n=98), детей с аллергопатологией (n=397): с бронхиальной астмой (n=147), с атопическим дерматитом (n=130), аллергическим ринитом (n=120), и взрослых с патологией легких (n=351): больные с профессиональным хроническим бронхитом (n=164) – стаж работы от 7 до 38 лет и больные с хронической обструктивной болезнью легких (n=187). Контрольная группа включала 918 относительно здоровых индивидов и также была разделена на детскую (n=223) и взрослую подгруппы (n=695). При формировании контрольной группы учитывалось отсутствие у индивида соответствующих заболеваний. Группы больных не отличались от контрольной группы, как по полу, так и по возрасту (р> 90 >>> Рассчитанные показатели ФАРГ для различных возрастных групп представлены в таблице 5 и рисунках 1-6.

Установлено, что в целом суммарный уровень ФАРГ с возрастом постепенно снижается, однако данные колебания для популяции статистической выраженности не имеют (р=0,25), достоверные различия наблюдаются лишь между группой лиц пожилого возраста и старческой группой (р=0,03), причем они были обусловлены изменением ФАРГ только в хромосомах группы D (р=0,05). Показатель ФАРГ по хромосомам группы G при этом проявлял относительную стабильность (р=0,27).

ФАРГ G АсХ Рисунок 1-6. Показатели комплекса ФАРГ в различных возрастных группах популяции Курской области: 1 – ФАРГ по 10 хромосомам; 2 – ФАРГ по хромосомам группы D; 3 – ФАРГ по хромосомам группы G; 4 – количество активных рибосомных цистронов; 5 – количество ассоциаций хромосом; 6 – количество хромосом в ассоциациях.

Количество активных рибосомных цистронов, количество ассоциаций акроцентрических хромосом и количество хромосом в ассоциациях в популяции изменяются