на правах рукописи

Камынина Анна Владимировна

ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФРАГМЕНТОВ АЛЬФА7СУБЪЕДИНИЦЫ АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА И ПРИОННОГО БЕЛКА В

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки РАН Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Вольпина О.М.

кандидат биологических наук Бобкова Н.В.

Официальные оппоненты:

Зинченко Валерий Петрович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, заведующий лабораторией внутриклеточной сигнализации Ярилин Александр Александрович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, заведующий отделом клеточной иммунологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка РАН

Защита диссертации состоится «27» сентября 2012 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.002.038.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ИБК РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН.

Автореферат разослан «_» 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Т.И.Смолихина

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) – тяжелое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующим снижением интеллекта и расстройством памяти. На лечение болезни тратятся огромные средства, при этом существующие лекарственные средства оказывают лишь симптоматическое действие. В настоящее время не достигнуто полное понимание причин и механизмов развития БА, и поэтому не разработаны методы радикальной терапии заболевания. Таким образом, актуальным остается поиск новых подходов к лечению БА.

Один из предполагаемых механизмов развития БА заключается в связывании патогенного пептида бета-амилоида с каким-либо белком на поверхности клеток мозга, что вызывает ряд процессов, приводящих к гибели нейронов. В литературе описаны 2 белка, являющихся мишенями для действия бета-амилоида, - 7-тип ацетилхолинового рецептора (АХР) [Wang et al., 2000] и прионный белок [Lauren et al., 2009]. В настоящей работе предложен новый подход к терапии БА, основанный на индукции специфических антител к мишеням бета-амилоида. Мы предположили, что антитела к 7-типу АХР или к прионному белку будут препятствовать связыванию этих белков с бета-амилоидом и гибели нейронов и, таким образом, оказывать иммунопротективное действие в модели БА. Для индукции специфических антител были использованы синтетические фрагменты 7-субъединицы АХР и прионного белка.

Цель работы. Цель диссертационной работы состояла в исследовании активности синтетических фрагментов альфа7-субъединицы ацетилхолинового рецептора и прионного белка, а также антител к ним, в in vivo и in vitro моделях БА.

В соответствии с поставленной целью задачами исследования являлись:

1. Выбор потенциально активных фрагментов 7-субъединицы АХР и прионного белка и изучение их иммунотерапевтической активности на животных с экспериментально индуцированной формой БА.

2. Выявление наиболее активных фрагментов 7-субъединицы АХР и прионного белка и получение аффинноочищенных антител к ним.

3. Исследование протективного действия аффинноочищенных антител к выбранным фрагментам 7-субъединицы АХР и прионного белка на животных с экспериментально индуцированной формой БА.

4. Исследование действия аффинноочищенных антител к выбранным фрагментам 7-субъединицы АХР и прионного белка на клеточной модели БА, а также изучение механизма их протективного действия.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе выявлены ранее не описанные пептидные фрагменты – фрагмент 173-193 7субъединицы АХР и фрагмент 95-123 прионного белка, иммунизация которыми оказывала иммунотерапевтическое действие на животных с экспериментально индуцированной формой БА. Впервые показано, что пассивная иммунизация аффинноочищенными антителами к фрагменту 173-193 7-субъединицы или к фрагменту 95-123 прионного белка предотвращает потерю пространственной памяти мышей с экспериментально индуцированной формой БА. Было также впервые продемонстрировано, что аффинноочищенные антитела к фрагменту 173субъединицы или к фрагменту 95-123 прионного белка препятствуют индуцированной бета-амилоидом гибели клеток в первичной культуре нейронов и астроцитов, понижают скорость продукции активных форм кислорода, а также ингибируют вызванную действием бета-амилоида активацию каспазы 3.

Апробация работы и публикации. Результаты настоящей работы были представлены на VIII чтениях, посвящнных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), VIII и IX и X международной конференции «Болезнь Альцгеймреа и Паркинсона» (Австрия, 2007; Чехия, 2009, Испания, 2011), XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармаколоии и экологии» (Украина, 2007), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), 50-ой юбилейной научной конференции МФТИ (Москва, 2007), XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»

(Москва, 2008), Международной конференции «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Московской международной конференции «Иммунофизиология:

2-ой естественный аутоиммунитет в норме и патологии» (Москва, 2008), международной конференции «Пептиды 2008» (Финляндия, 2008), на 34ом конгрессе FEBS (Чехия, 2009), на международной конференции «Молекулярные механизмы нейрологических и психических заболеваний (Словакия, 2009), на X международном конгрессе по нейроиммунологии (Испания, 2010), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011), на международной конференции «Биология – наука 21 века» (Москва, 2012).

Материалы диссертационной работы изложены в 23 публикациях, в числе которых 3 статьи в рецензируемых научных журналах.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на _ страницах с использованием рисунков, _ таблиц и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего _ ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование иммунотерапевтической активности фрагментов 7субъединицы АХР на животных с экспериментально индуцированной Для выработки специфических антител к 7-типу АХР, препятствующих связыванию рецептора с бета-амилоидом, в качестве иммуногенов было предложено использовать синтетические фрагменты N-концевого экстрацеллюлярного домена 7-субъединицы АХР, аминокислотные последовательности которых приведены в Таблице 1. На первом этапе исследований были выбраны 2 фрагмента: пептид последовательности 1-23 (АХРI), соответствующий N-концевому -спиральному экспонированному участку молекулы 7-субъединицы АХР, и пептид последовательности (159-168)-(179-188) (АХР-II), объединяющий два гидрофильных экспонированных участка 159-168 и 179-188. В качестве контрольного соединения был выбран пептид, соответствующий фрагменту 197-213 белка VP1 вируса ящура (К1). Для получения у животных стабильно высокого уровня антител пептиды были конъюгированы с высокомолекулярным носителем – гемоцианином улитки (KLH), который усиливает продукцию антител.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности фрагментов 7-субъединицы АХР.

Пептид Аминокислотная последовательность Выделены подчеркиванием

EWDLVGIPGKRSERFYECCKE

KSIYTLRYYTDKTNNNLTLVPAVVGKPGS

Чтобы исследовать терапевтический эффект иммунизации фрагментами 7субъединицы АХР, в качестве животной модели БА были использованы мыши линии NMRI, которым проводили операцию ольфакторной бульбэктомии.

Бульбэктомированные (БЭ) мыши демонстрируют признаки, схожие с проявлениями спорадической формой БА, а именно у БЭ мышей происходит нарушение пространственной памяти, повышение уровня бета-амилоида в мозгу и развитие других признаков БА [Бобкова и соавт., 2001]. В качестве контроля были использованы ложнооперированные (ЛО) мыши, которым проводили все те же манипуляции, что и БЭ мышам, но не удаляли обонятельные луковицы.

Исследовали влияние иммунизации выбранными фрагментами 7-субъединицы АХР, конъюгированными с белком-носителем, на состояние пространственной памяти БЭ мышей в водном лабиринте Морриса. Тестирование пространственной памяти проводили совместно с сотрудниками Лаборатории клеточных механизмов патологии памяти ИБК РАН г.Пущино.

Схема иммунизации БЭ мышей была разработана таким образом, чтобы на момент развития признаков БА и на момент исследования терапевтического эффекта иммунизации выбранными фрагментами у мышей был наивысший уровень антител. Мыши были иммунизированы препаратами АХР-I-KLH, АХР-II-KLH или К1-KLH дважды. Между первой и второй иммунизациями проводили операцию ольфакторной бульбэктомии. Через месяц после операции животных обучали пространственному навыку в водном лабиринте Морриса и тестировали память, которую оценивали по способности животного выделять сектор обучения №3 от секторов №1, 2 и 4 по времени нахождения и числу заходов.

Результаты проведенных исследований показали, что неиммунизированные ЛО животные статистически достоверно выделяли 3-ий сектор обучения (рис.1). БЭ неиммунизированные мыши, или БЭ мыши, иммунизированные К1-KLH, не выделяли 3-ий сектор обучения, что свидетельствовало о нарушении памяти.

Иммунизация АХР-II-KLH приводила к сохранению памяти БЭ животных: эти мыши статистически достоверно выделяли 3-ий сектор по числу заходов и по времени нахождения в нем. В группе БЭ мышей, иммунизированных АХР-I-KLH, была выявлена лишь тенденция к сохранению памяти, поскольку не было отмечено статистически достоверных различий между анализируемыми показателями в 3-ем секторе и остальными отсеками.

Рис.1. Результаты тестирования памяти БЭ мышей, иммунизированных KLHконъюгатами фрагментов АХР-I и АХР-II.

Здесь и далее 1-4 – сектора водного лабиринта, 3 – сектор обучения.