На правах рукописи

Куликова Ольга Геннадьевна

Новые адгезивные биорегуляторы растительного происхождения

03.01.02 биофизика

03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Игорь Александрович Ямсков доктор биологических наук, профессор Виктория Петровна Ямскова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Надежда Павловна Пальмина доктор биологических наук, профессор Владимир Леонидович Воейков

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.

Баха РАН

Защита диссертации состоится_2012 г. в _часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля по адресу:

119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН Автореферат разослан ""_2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 002.039. кандидат химичеких наук Мазалецкая Л.И.

Введение Актуальность работы Растения являются традиционным источником получения различных биологически активных веществ и лекарственных средств, однако к настоящему времени недостаточно изучены и охарактеризованы. Во многих случаях не выявлены вещества, ответственные за проявление фармакологического действия. Поэтому поиск новых биологически активных веществ растительного происхождения остается актуальной проблемой современной науки.

В этом аспекте особого внимания заслуживает выявление в растениях мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ), которые были обнаружены ранее в различных тканях позвоночных животных. МГТБ отличаются, прежде всего, способностью влиять на основные биологические процессы: адгезию, дифференцировку, апоптоз, миграцию и пролиферацию клеток, причем биологическая активность характеризуется наличием тканевой, но отсутствием видовой специфичности и проявляется наиболее ярко в сверхмалых дозах (СМД), соответствующих 10-8-10-15 мг белка/мл. Все члены данной группы биорегуляторов проявляют сходные физико-химические свойства. В связи с этим для их выделения и очистки применяется экспериментальный подход, включающий в себя определенную методику их экстракции из тканей и последующую очистку. Изучение МГТБ животного происхождения показало, что они имеют сложный состав, включающий в себя пептиды, белки, ионы Са2+, углеводы и липиды. Было показано, что МГТБ локализованы внеклеточно в соответствующей ткани.

В настоящей работе была предпринята попытка идентификации данной группы биорегуляторов в тканях растений, изучения их биологического действия и установления их некоторых физико-химических свойств.

Целью данной работы являлись идентификация новой группы биорегуляторов в тканях растений, изучение их структуры, физико-химических свойств, мембранотропной и специфической активности, а также их локализации в растительных тканях.

В отдельные задачи исследования входили:

1. Выделение и очистка биорегуляторов новой группы из ряда растений;

2. Изучение мембранотропной активности биорегуляторов растительного происхождения;

3. Изучение некоторых физико-химических свойств растительных биорегуляторов с помощью современных методов биохимического анализа: электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), динамического лазерного светорассеяния, MALDI-TOF масс-спектрометрии, обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ), изоэлектрофокусирования (ИЭФ), аминокислотного анализа;

4. Изучение специфической активности растительных биорегуляторов на моделях органотипического культивирования тканей животных in vitro, а также в экспериментах на мышах in vivo; изучение влияния данных биорегуляторов на рост и развитие семян различных растений;

5. Изучение локализации данных биорегуляторов в тканях растений.

В качестве основных объектов исследования изучали листья подорожника большого (Plantago major L.), укропа пахучего (Anethum graveolens L.), а также луковицы лука репчатого (Allium cepa L.) и чеснока (Allium sativum L.). Отдельные исследования были проведены также с биорегуляторами, выделенными из лимона (Citrus limon L.), алоэ древовидного (Aloe arborescens M.), кориандра посевного (Coriandrum sativum L.), которые использовали в сравнительном аспекте в экспериментах по изучению биологического действия растительных биорегуляторов.

Новизна работы Впервые в тканях растений были обнаружены новые биорегуляторы, которые по характеру мембранотропного действия и ряду физико-химических свойств проявляют сходство с МГТБ животного происхождения. Было показано, что биологически активной компонентой биорегулятора, выделенного из лука, являлся пептид с молекулярной массой 4036±2 Да. Установлена 18-членная С-концевая последовательность этого пептида. С помощью соответствующей базы данных Uniprot показана уникальность данной С-концевой последовательности, поскольку при сравнении с последовательностями известных пептидов гомологов не обнаружено.

Впервые на примере исследования биорегуляторов, выделенных из подорожника и чеснока, установлен тот факт, что биорегуляторы растений локализованы внеклеточно подобно МГТБ животного происхождения.

На примере исследования биорегулятора, выделенного из подорожника, в настоящей работе впервые была установлена корреляции между биологической активностью биорегулятора и лекарственным действием растения - источника его выделения, а именно, биорегулятор, выделенный из подорожника, проявлял в СМД выраженное ранозаживляющее действие.

Впервые показано, что растительные биорегуляторы в СМД оказывают влияние на рост и прорастание семян. Установлена способность биорегулятора, выделенного из подорожника, стимулировать клеточный иммунитет.

Практическая значимость На основе биорегуляторов, выделенных из подорожника, алоэ, лука, чеснока и лимона возможна разработка новых фармакологических препаратов или БАДов, которые могут быть использованы для профилактики и коррекции работы иммунной системы, а также обладающих ранозаживляющим действием. Биорегуляторы, выделенные из лука и укропа, также могут быть применены в сельском хозяйстве.

Структура и объем диссертации Работа имеет традиционную структуру, она состоит из 3-х основных глав:

литературного обзора, в котором рассмотрены строение растительной клетки, ткани высших растений, их характеристика и химический состав, а также основные результаты исследования МГТБ животного происхождения;

экспериментальной части, в которой представлены основные методы исследования растительных биорегуляторов;

результатов и их обсуждения, в которой рассмотрены результаты настоящего исследования и представлена их интерпретация в соответствии с имеющимися литературными данными;

а также из введения, заключения и выводов.

Диссертационная работа содержит 105 страниц, 24 рисунка, 6 таблиц, 183 литературные ссылки.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на: VIII международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 11-13 ноября, 2008; IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз», Москва, 2008; I Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Донецк, 2008; V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 29 июня – 3 июля, 2009; V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 29 июня – июля, 2009; II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», 15-16 сентября, Казань, 2008; Х Ежегодной международной молодежной конференции «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы, Москва, 8-10 ноября, 2010; VI Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Алушта, 20-24 сентября, 2010; ХI Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика».

Москва, 9-11 ноября, 2011.

Публикации По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии, 6 в сборниках научных трудов, 5 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

1. Выделение, очистка и изучение физико-химических свойств растительных С применением экспериментального подхода, разработанного для выделения и исследования МГТБ животного происхождения, биорегуляторы данной группы были получены из лука репчатого, укропа пахучего, чеснока, лимона, алоэ древовидного и кориандра посевного. Для исследования были взяты именно выше упомянутые растения, поскольку известно, что они способны оказывать различное лекарственное действие.

Биологическое действие лекарственных растений находит применение при создании препаратов для профилактики и лечения различных заболеваний. Так, например, известно, что препараты из листьев подорожника весьма успешно используют в качестве ранозаживляющего средства, а препараты, полученные на основе лука, эффективно применяются при различного рода заболеваниях кишечника.

Аналогично МГТБ животного происхождения биорегуляторы, выделенные из растений, оставались в растворенном состянии в насыщенном растворе сернокислого аммония. Это было показано исследованием мембранотропной активности надосадочных жидкостей и осадков, которые получали путем высаливания соответствующих растительных экстрактов. На рис.1. в качестве примера приведена диаграмма, отражающая мембранотропное действие супернатанта, полученного из экстракта чеснока. Метод мембранотропной активности, который является методом биотестирования МГТБ животного происхождения, был использовании и для идентификации растительных биорегуляторов.

Биологически активные супернатанты растительных экстрактов далее разделяли методами ИЭФ, обращенно-фазовой ВЭЖХ, электрофореза в ПААГ. Полученные фракции биорегуляторов идентифицировали методами биотестирования, изучали MALDI-TOF массспектрометрией, динамическим лазерным светорассеянием. В отдельных экспериментальных сериях изучали специфическую активность растительных биорегуляторов.

При ИЭФ растительные биорегуляторы так же, как и МГТБ животного происхождения