На правах рукописи

РАДНАГУРУЕВА Арюна Арсалановна

ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ ТЕРМАЛЬНЫХ И

ЩЕЛОЧНЫХ ВОДНЫХ СИСТЕМ ЗАБАЙКАЛЬЯ

03.02.08 – экология (биологические наук

и)

03.02.03 – микробиология (биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан – Удэ - 2012 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей и экспериментальной биологии

СО РАН (ФГБУН ИОЭБ СО РАН)

Научный руководитель: кандидат биологических наук Лаврентьева Елена Владимировна

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Дунаевский Яков Ефимович

Официальные оппоненты: Семенов Александр Михайлович – доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Буянтуева Любовь Батомункуевна кандидат биологических наук, доцент

ФГБОУ ВПО БГУ

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Защита состоится «26» марта 2012 г. в 11.30 ч. на заседании Диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском государственном университете по адресу: 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, Биолого-географический факультет, конференц-зал Факс: (3012) E-mail: [email protected] [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского государственного университета.

Автореферат разослан «» февраля 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Шорноева Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы В последние десятилетия микробные сообщества термальных и щелочных местообитаний находятся в центре внимания исследователей (Brock, 1978; Бонч-Осмоловская, 1999; Заварзин, 2004; Жилина, 2005; Горленко, 2004; Намсараев, 2006; Кевбрин, 2007). Изучение микроорганизмов из этих сообществ на молекулярном уровне позволило выявить новые метаболические пути и механизмы биохимической адаптации, что значительно обогатило современную фундаментальную микробиологию.

Термофильные и алкалофильные гидролитические бактерии представляют одну из наиболее обширных и активно изучаемых групп микроорганизмов и являются источником новых ферментов и метаболитов для промышленности и медицины. Ha данный момент известно большое число термо-/ алкалофильных микроорганизмов, осуществляющих гидролиз полимерных субстратов - амилолитики (Krishnan и Chandra, 1983; Gupta et al., 2003), целлюлозолитики (Bergquist et al., 1999, Uhl и Daniel, 1999, Andrade et al., 2001, Kozina et al., 2009 и др.) и протеолитики. Большинство протеолитиков растут и используют в качестве источника углерода и энергии пептиды, благодаря наличию внеклеточных пептидаз, активных в широких диапазонах значений рН и температур (Klingeberg et al., 1995; Ward et al., 2002). В целом, в природных местообитаниях гидролитики занимают нишу первичных деструкторов, благодаря способности гетеротрофно расти на биополимерах различной природы (Кубланов, 2011).

Распространение аэробных органотрофных бактерий в водных системах Забайкалья ранее изучалось эпизодически (Храпцова и др., 1984; Намсараев, 2003; Nazina et al., 2004; Зайцева, 2004). Знания о видовом разнообразии и функциональной активности представителей аэробного микробного сообщества щелочных термальных источников и содово-соленых озер Забайкалья были недавно пополнены (Базаржапов, 2005; Бабасанова, 2007;

Шагжина, 2007; Митыпова, 2007).

Вместе с тем, к началу нашей работы изучены гидролитические ферменты только ограниченного числа микроорганизмов водных систем Забайкалья. Очевидно, что их разнообразие и метаболические свойства исследованы недостаточно, а биотехнологический потенциал микроорганизмов раскрыт далеко не полностью. Это делает актуальным проведение новых исследований, связанных с распространением, разнообразием и функциональной активностью бактерий в термофильных и алкалофильных микробных сообществах экстремальных водных систем Забайкалья.

Цель работы: изучить гидролитические бактерии и их функциональную роль в термальных и щелочных водных системах Забайкалья.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

Изучить распространение аэробных гидролитических бактерий в донных осадках и микробных матах термальных источников и содовосоленых озер;

Выделить чистые культуры гидролитических микроорганизмов и определить их таксономическое положение;

Изучить экофизиологические и биохимические свойства чистых культур;

Выделить пептидазы гидролитических бактерий и изучить их свойства;

Изучить функциональную роль гидролитических бактерий в микробном сообществе.

Научная новизна и практическая значимость. С помощью микробиологических и молекулярно-генетических методов выявлено распространение аэробных алкалотермофильных органотрофных бактерийпродуцентов пептидаз семейства Bacillaceae и Paenibacillaceae в термальных источниках Байкальского региона.

Выделен и детально охарактеризован предположительно новый вид алкалотермофильной факультативно анаэробной органотрофной бактерии «Anoxybacillus sp. nov.». Показано, что данная бактерия является активным продуцентом термостабильной сериновой субтилизин-подобной пептидазы, имеющей оптимум активности при 500С и pH 11,1.

Изученные пептидазы (сериновые субтилизин-подобного типа) алкало-/термофильных гидролитических бактерий обладают высокой температурной (от 23 до 60 °С) и рН стабильностью (от 6,3 до 11,4).

Впервые получены очищенные препараты пептидаз из источников Забайкалья, изучены их важнейшие физико-химические свойства. Впервые представлены данные по наличию ингибиторной активности пептидаз у бактерий содово-соленых озер Забайкалья.

Полученные результаты расширяют представления о разнообразии и экологическом значении гидролитических бактерий в экстремальных местообитаниях. Полученные очищенные препараты пептидаз могут найти практическое применение в биотехнологии, как ферменты устойчивые к высоким значениям температуры и рН. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе при изучении микробиологии и экологии и подготовке учебно-методических пособий.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии»

(Минск, 2008); Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); I International conference “Survey of Mongolian aquatic ecosystems in a changing climate: Results, new approaches and future outlook” (Ulaanbaatar, Mongolia, 2010); XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010); Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ – Улан-Батор, 2011).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 18 печатных работ.

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории микробиологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. Молекулярно-биологическая часть работы проводилась в Центре «Биоинженерия» РАН г. Москва. Работа по изучению внеклеточных пептидаз проводилась в НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова под руководством д.б.н. Дунаевского Я.Е.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на _ страницах машинописного текста, включает _ таблиц, _ рисунков. Библиография содержит _ наименований, в т.ч. _ - зарубежных авторов.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность за общее научное руководство научному руководителю к.б.н. Е.В. Лаврентьевой и научному консультанту д.б.н., проф. Я.Е. Дунаевскому.

Автор выражает благодарность за помощь в работе и поддержку заведующему лабораторией микробиологии ИОЭБ СО РАН д.б.н., проф. Б.Б.

Намсараеву и всем сотрудникам лаборатории, заведующему лабораторией белков растений д.б.н., проф. М.А. Белозерскому и всем сотрудникам НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, а также к.б.н. Б.Б.

Кузнецову (Центр «Биоинженерия» РАН).

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 10-04-90798_моб_ст, № 10-04-93169_Монг_а, МО РФ РНП 2.1.1/2165.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы приведены сведения по разнообразию микробного сообщества термальных источников и содово-соленых озер, рассмотрены общие свойства гидролитиков и их гидролаз, приведена современная классификация гидролитических ферментов (пептидаз) по базе данных MEROPS, представлены современные данные о роли внеклеточных пептидаз в прокариотной клетке и функционировании микробного сообщества в экстремальных местообитаниях, особое внимание уделено механизмам адаптации микроорганизмов к высоким температурам и рН, а также представлены данные о биотехнологическом применении внеклеточных пептидаз микроорганизмов.

Объектами исследования являлись термальные источники Алла, Умхэй, Гарга, Сеюя, Гусиха, Уро и Горячинск, расположенные в Курумканском, Баргузинском и Прибайкальском районах республики Бурятия. Температура воды на выходах термальных источников варьировала в широких пределах (39 - 740С). Наиболее высокотемпературными были источники Уро (69,10С), Алла (700 С), Гусиха (720С) и Гарга (740 С). Воды имели щелочную реакцию, значения рН варьировали от 8,1 до 9,7. Температура и рН в термальных водах снижалась по мере удаления от излива.

Для исследования были отобраны пробы воды, донных осадков и микробных матов в летне-осенний период с 2008 по 2010 годы.

Предметом исследований служили гидролитические бактерии: (табл.

1): Ur-6к, Br-2-2к, Ga-9-2к, Al-9-1к и Se-1к, выделенные из микробных матов и донных осадков термальных источников Бурятии (Бабасанова и др., 2006) и 5 культур SK1к, K5к, K6к, Ц3к и Nuк, выделенные из донных отложений и воды содово-соленых озер Соленое и Нухэ-Нур (Забайкалье) (Митыпова и др., 2005). Все штаммы получены из коллекции лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, г. Улан-Удэ.

Физико-химическая характеристика местообитаний Примечание: д.ос. – донные осадки; к – коллекционные культуры ИОЭБ СО РАН Физико-химические методы исследования гидротерм Определение физико-химических параметров воды, донных осадков в местах отбора проб проводили общепринятыми методами (Намсараев и др., 2006).

Содержание органического углерода (Сорг) в пробах определяли по методу Тюрина в модификации Никитина (Аринушкина, 1980). Определение содержания белка проводили по методу Лоури (Практикум по микробиологии, 2005). Оптическую плотность измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-20 (Россия) и спектрофотометре CECIL-1021 (Великобритания).

Методы учета численности и выделения накопительных и чистых культур гидролитических бактерий. Учет численности и выделение аэробных алкалотермофильных гидролитических бактерий проводили методом предельных разведений и высева на агар на среде Пфеннига следующего состава (г/л): NH4Cl – 0,3; KH2PO4 – 0,3; MgCl2 – 0,3; CaCl2 – 0,3;

дрожжевой экстракт – 0,5; раствор микроэлементов по Липперту, Витману – 1 мл. В качестве субстратов вносили (в %): для протеолитиков – пептон (1,5); для амилолитиков – крахмал (1,5); для целлюлолитиков – полоску фильтровальной бумаги (1); для липолитиков – твин-80 (1,5). рН25С среды доводили бикарбонатно-карбонатным буфером до 8,5–9,5, температура инкубации для культур из содово-соленых озер составляла 37С, для культур из термальных источников - 50С.

Морфотипы бактерий, размеры, подвижность и спорообразование изучали микроскопированием препаратов с помощью светового микроскопа AxioStar Plus (Karl Zeiss) в фазовом контрасте и на окрашенных препаратах при 100-кратном увеличении объектива (общее увеличение 1000) и ультратонких срезах в электронном микроскопе Jeol JEM-100C (Япония).

Молекулярно-биологические методы. Выделение ДНК проводили из биомассы бактерий (Булыгина и др., 2002). Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК была использована универсальная праймерная система (Lane, 1991).

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США).

Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, проводили по методу Сэнгера с соавт. (Sanger at al, 1977) с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Inc.,USA) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 (Applied Biosystems, Inc.,USA). Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов проводили с помощью программного пакета BLAST (Camacho at al., 2009).

Построение филогенетического древа производили с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer and De Wachter, 1994).

Метагеномный анализ проведен на пиросеквенаторе Roche 454 GS-FLX Titanium (Южная Корея). Оценку таксономической сложности сообщества проводили с помощью пакета программ CLcommunity (ver 2.58).

Анализ жирных кислот. Состав жирных кислот анализировали на хроматографе Шерлок (Microbial Identification System, MIDI Inc, USA).

Исследования выполнены в Национальном университете, Чанчон, Южная Корея.

Изучение физиолого–биохимических свойств гидролитических культур. Температурные диапазоны развития бактерий устанавливали в градиентном термостате от 20 до 80С. Диапазон рН25С устанавливали с разными концентрациями бикарбоната и карбоната натрия (от 6,0 до 11,0).

Способность к использованию различных источников углерода проверяли на минеральной среде, в которую вносили испытуемые источники углерода в концентрации 0,5 – 1 % от объема среды. Биомассу бактерий определяли по изменению оптической плотности культуры при длине волны нм. Биохимические свойства бактерий, удельную скорость роста определяли общепринятыми методами (Практикум по микробиологии, 2005).

Определение общей активности пептидаз проводили на белковых субстратах: азоказеин и желатина. Для определения субстрат-специфичной активности использовали синтетические 20 мМ п-нитроанилидные субстраты, специфичные для определенных групп пептидаз – GlpAALpNa для субтилизин-подобных, GlpFpNа – химотрипсин-подобных, BAPA – трипсин-подобных, GlpFApNa – цистеиновых, R-pNa, L-pNa, F-pNa, Y-pNa – аминопептидаз (Erlanger et al., 1961). Для выяснения природы функциональных групп активного центра использовали ингибиторы, специфичные для различных классов пептидаз: EDTA и о-фенантролин для металлопептидаз, PMSF для сериновых пептидаз, IAA для цистеиновых пептидаз. Оптимум активности в зависимости от рН25С определяли в 0,5M универсальном буфере в диапазоне рН 2,4 – 12. Температурный оптимум фермента определяли, измеряя активность фермента при значениях температуры от 23 до 800С.

Выделение и очистка ферментов культур Se-1-10 и Gor-10s проводили из препаратов культуральной жидкости бактерий методами диализа, ионообменной хроматографии на колонке Mono Q в режиме FPLC. Определение молекулярных масс ферментов проводили методом гельхроматографии на Superdex 75.

Методы математического анализа. Все расчеты были проведены с использованием Excel2003 и пакета программ MathLabR2010a для Windows.

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение Исследование химического состава нативных проб Важным фактором, влияющим на активность и жизнедеятельность микробного сообщества, является качественный и количественный состав органического вещества в среде обитания.

В донных осадках оз. Соленое и Нухэ-Нур обнаружено высокое содержание Сорг (10,0-15,4 %). Основными источниками ОВ в изученных содовых озерах является фитопланктон и прибрежная растительность. Содержание белка было относительно низким (от 0,1 до 0,23 мг/см3) (Митыпова, 2007).

Общее содержание органического углерода в пробах исследованных термальных источников варьировало в пределах от 0,3% до 6,03% и зависело от вида пробы. Максимальные значения (5,57 и 6,03%) были отмечены в микробных матах гидротерм Гарга и Сеюя (табл. 2). Количество белка в исследуемых пробах составило от 1,1 (ист. Горячинск) до 4,36 мг/см (ист. Умхэй). В целом, отмечено, что концентрация органического вещества в микробных матах была выше, чем в донных осадках.

Физико-химическая характеристика проб Примечание: д.ос. – донные осадки; м.м – микробный мат; н.о – не определено Сравнительный анализ содержания Сорг и белка микробных матов и донных осадков термальных источников показал, что удельное содержание ОВ выше в микробных матах, что может быть объяснено высокой интенсивностью продукционных процессов в матах в отличие от донных осадков (Jorgensen, Nelson, 1988; Navarrete et al., 2000; Заварзин, 1993, 2003).

Основные экологические параметры воды термальных источников Забайкалья были проанализированы с использованием метода главных компонент (Geladi, 1989; Gorban, Zinovyev, 2010), что позволило определить наиболее важные факторы для функционирования системы.

Были определены четыре главные компоненты (PC – Principal Component), которые объясняют 94% наблюдаемых вариаций. РС1 объясняет 61% наблюдаемых параметров представляет собой рН и количество белка в нативных пробах. Наибольший вклад во вторую компоненту РС2 - 25% наблюдаемых изменений в среде, оказывают численность протеолитиков и тип пробы, состоящий из микробных матов и донных осадков. РС3 (минерализация и содержание органического вещества) и РС4 (температура) имеют меньшее значение, объясняя 4,2% и 3,78% изменений, соответственно.

Анализ показал, что функционирование гидролитического микробного сообщества в первую очередь, регулируется такими факторами, как рН и содержание белка в пробах.

Численность гидролитических бактерий термальных и щелочных В естественных местообитаниях гидролитические бактерии занимают нишу первичных деструкторов органического вещества.

Численность аэробных протеолитических бактерий термальных источников, lg кл/см Примечание: «-» - нет данных; *- данные Митыповой Т.Н.

Численность протеолитических бактерий в донных осадках и микробных матах варьировала в пределах от 1000 до 100 млн. кл/см3 (табл. 3).

Наибольшее число микроорганизмов обнаружено в поверхностном микробном мате источника Сеюя и в матах Гарги и Горячинск (до 10 млн.

кл/см3) и в донных осадках оз. Соленое и Нухэ-Нур (до 100 млн. кл/см3).

Максимальное число бактерий (10 тыс. кл/см 3), использующих в качестве основного субстрата – крахмал, зафиксировано в донных осадках и микробных матах источника Горячинск, оз. Соленое и Нухэ-Нур. Обнаружено, что численность аэробных протеолитиков и амилолитиков превышает численность липолитиков и ЦРБ в среднем на 2-4 порядка. Так максимальное количество липолитиков и целлюлозолитиков (анаэробы) достигало 100 кл/см3.

Таким образом, высокая численность разных физиологических групп бактерий указывает на широкое распространение первичной деструкционной ветви микробного сообщества. Отмечено, что вследствие высоких концентраций белка и ОВ, численность бактерий-деструкторов выше в микробных матах, чем в донных осадках.

Выделение и характеристика гидролитических бактерий термальных водных систем Забайкалья Из проб микробных матов и донных осадков термальных источников Бурятии: Гарга, Алла, Умхей, Сеюя и Горячинск было выделено 28 штаммов гидролитических бактерий (табл. 4).

Характеристика штаммов, выделенных из термальных Примечание: жирным шрифтом выделены штаммы с известным филогенетическим положением Морфология. Клетки бактерий представлены различными спорообразующими грамположительными палочками, размеры которых варьировали в пределах от 0,5-4,96 х 1,1-16,6 мкм. Размеры спор составляли 1,13 – 1, мкм.

Экофизиология. Исследование экофизиологии, выделенных культур протеолитиков из термальных источников, показало, что они способны развиваться в широком диапазоне температур (23-60°С) и рН (7,6-10,0), проявляя свойства алкало- и термотолерантности. В соответствии с имеющимися классификациями бактерий в отношении температуры и рН, изученные штаммы распределились следующим образом:

Штаммы бактерий-деструкторов (SK1к, K5к, K6к, Ц3к и Nuк), выделенные из содово-соленых озер Забайкалья, характеризуются как мезофилы с оптимумом роста в диапазоне от 23 до 30°С и оптимумом рН от 7, до 10;

Большая группа штаммов (Gor-10-3, Сея-09, Um-09s1, Um-09s2, Gor-10-1m, Um-09m, Га-35 и Gor-10s), выделенных из термальных источников, характеризуются как термоалкалотолерантные, с оптимумом развития в диапазоне от 40 до 45°С и оптимумом рН от 7,5 до 9,5;

Штаммы бактерий (Gor-10-2, Ur-6к, Br-2-2к, Ga-9-2к, Al-9-1к и Seк 1 ), выделенные из термальных источников, характеризуются как термоалкалофильные, с оптимумом роста в диапазоне от 50 до 60°С и оптимумом рН от 8,0 до 8,5.

Генотипическая характеристика. Методом пиросеквенирования по гену 16S рРНК микробного мата получены данные, характеризующие состав микробного сообщества.

В сообществе микробного мата, развивающегося при рН 9,47 и температуре 67оС в источнике Алла (2402 н.п., 80 ОТЕ), доминируют филы Deinococcus - Thermus (45%) и Nitrospirae (36%). Proteobactеria и Firmicutes составляют 3 и 2%, соответственно. Cloroflexi и Cyanobacteria – формообразующие компоненты микробных матов, в структуре данного сообщества занимают 3% и 0,37%, соответственно. Произведен анализ графиков, иллюстрирующие зависимость числа детектированных филотипов (т.е. числа кластеров) от числа проанализированных последовательностей (Марданов, 2010). Проведенная оценка таксономической сложности сообщества позволила показать разнообразие 83 видов бактерий.

Изучение видового разнообразия выделенных бактерий молекулярногенетическим методом показало, что выделенные культуры относятся к родам Bacillus, Anoxybacillus и Paenibacillus.

Для анализа гена 16S рРНК было отобрано 3 штамма (Um-09m, Га-35 и Gor-10s). В результате было показано, что штамм Um-09m имеет 99,8 % сходствa с Bacillus licheniformis штамм BPRIST006. Наибольшее сходство у культур Га-35 и Gor-10s выявлено с Paenibacillus dendritiformis штамм P411 (100%).

Внеклеточная протеолитическая активность в нативных пробах Изучение биохимических параметров нативных образцов показало, что наиболее высокая общая внеклеточная протеолитическая активность при использовании в качестве субстрата желатины обнаружена в источнике Сеюя – от 0,13 до 1,02 ед. в донных осадках и от 0,36 до 1,09 ед. в микробных матах. Высокая ферментативная активность, вероятно, обусловлена тем, что в местах отбора проб, зафиксированы наибольшие количества органического вещества (до 6,03%) и численности гидролитических бактерий (от 10 тыс. до 10 млн. кл/см 3). Активное разложение желатины было отмечено также в образцах источников Гусиха (0,12 – 0,51 ед.) и Алла (0,22 – 0,49 ед.). Пробы из источника Гарга имели незначительную активность по желатине (0,13 – 0,24 ед.), т.к. точки отбора проб находились на выходе источника и характеризовались низкими значениями Сорг (0,27%) и численности (до 10 тыс. кл/см3).

В образцах источников Алла, Умхей, Сеюя обнаружена трипсинподобная активность. Значения активности варьировали от следовых до 0,65 ед. Образцы источников Гарга и Гусиха характеризовались низкими