На правах рукописи

СИЛАЧЁВ ДЕНИС НИКОЛАЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ НА МОДЕЛИ

ФОКАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

03.00.13 – физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в лаборатории структуры и функции митохондрии НИИ физикохимической биологии им А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова (заведующий – д.б.н., профессор Д.Б.Зоров), на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова (декан – профессор, академик РАН В.П. Скулачёв).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории структуры и функции митохондрии НИИ физико-химической биологии им А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова Николай Константинович Исаев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Ольга Сергеевна Тарасова;

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела исследования мозга научного центра неврологии РАН Ирина Николаевна Шаронова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Защита состоится 23 ноября 2009 г. в 15 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В.

Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ им. М.В.

Ломоносова, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Автореферат разослан 22 октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.001. доктор биологических наук Б.А. Умарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди современных медико-социальных проблем инсульт занимает одно из ведущих мест. Рост числа инсультов головного мозга среди трудоспособного населения нашей страны является на данный момент одним из самых острых вопросов отечественного здравоохранения. В настоящее время в России инсульт ежегодно переносят свыше 450 тыс. человек. Среди причин смерти он занимает второе место. Показатели заболеваемости и смертности от инсульта среди лиц трудоспособного возраста в России увеличились за последние 10 лет более чем на 30%. Ранняя 30-дневная летальность после инсульта составляет 34,6%, а в течение года умирает примерно половина заболевших, что составляет более 200 тыс. человек (Гусев и др., 2007; Виленский и Яхно, 2006).

Однако на сегодняшний день все имеющиеся нейропротекторные препараты, испытанные в мультифокальных клинических исследованиях, недостаточно эффективны (Rother, 2008). Поэтому разработка новых подходов к терапии и профилактике инсульта является острейшей задачей медицины.

Так как в процессе ишемического повреждения мозга задействовано несколько различных патологических механизмов, то очевидно, что нейропротективная терапия должна быть направлена на различные мишени, принимающие участие в патологических процессах. Поэтому нами было выбрано три различных направления для нейропротекторной защиты: ингибиторы апоптоза, митохондриально-адресованные антиоксиданты и регуляторные пептиды.

Целью данной работы было исследование динамики ишемического инфаркта у крыс на модели перекрытия средней мозговой артерии (СМА) с помощью магнитнорезонансной томографии (МРТ), а также изучения возможности коррекции нарушений, вызванных ишемией, при использовании новых фармакологических препаратов.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

1. Исследовать динамику формирования фокального очага ишемического повреждения на модели перекрытия СМА с помощью метода МРТ.

2. Исследовать влияние внутрибрюшинного введения хлорида лития после индукции ишемии головного мозга на развитие ишемического очага и неврологического 3. Изучить нейропротекторные свойства пептидов ГК-2 и PGP на модели фокальной ишемии головного мозга.

4. Оценить влияние митохондриально-адресованных антиоксидантов семейства SkQ на развитие ишемического очага и неврологического дефицита.

Научная новизна и практическая значимость. В данной диссертационной работе впервые осуществлен широкий комплексный подход к исследованию процесса формирования ишемического повреждения головного мозга крыс с использованием метода МРТ и выполнен сравнительный анализ двух методов оценки области повреждения (МРТ и ТТС-окрашивание) в сопоставлении с данными об уровне неврологического дефицита, оцененного в поведенческих тестах.

Установлены сроки формирования ишемического очага в модели перекрытия СМА нитью. Проведен последовательный анализ на всех стадиях процесса формирования ишемического очага с использованием МР-изображений, начиная с первых минут ишемии и заканчивая двухнедельным сроком.

Впервые на модели фокальной ишемии мозга, вызванной перекрытием СМА, выявлено нейропротекторное действие пептидов PGP и ГК-2. Данные пептиды уменьшали развитие ишемического нейродеструктивного процесса и способствовали снижению неврологического дефицита в постишемическом периоде.

';

В исследовании влияния митохондриально-адресованных антиоксидантов семейства SkQ (SkQ1, SkQR1 и SkQRB) впервые показано, что SkQR1 очень эффективно защищает ткань мозга от ишемии, снижает неврологический дефицит при введении до или после индукции ишемии методом перекрытия СМА. Также выявлены некоторые молекулярные механизмы защитного действия SkQR1.

Таким образом, полученные нами данные, а также примененные в исследованиях оригинальные методические разработки имеют важное научно-практическое значение для патофизиологических процессах, происходящих в очаге ишемического повреждения головного мозга. Результаты исследования позволяют рекомендовать пептиды PGP и ГК-2, а также митохондриально-адресованный антиоксидант SkQR1 для дальнейших доклинических испытаний с целью выявления наиболее эффективных доз, способов и сроков введения препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Перекрытие средней мозговой артерии вызывает образование инфаркта в области коры, включая сенсомоторную область, и стриатума, что сопровождается стойким нарушением сенсомоторных функций мозга. При этом процесс образования инфаркта имеет динамический характер и его основное формирование у крыс происходит к 24-м часам после индукции ишемии.

2. Ионы лития, пептиды PGP и ГК-2 предотвращают негативные последствия ишемии головного мозга, снижая объем инфаркта и выраженность неврологического 3. Митохондриально-адресованные антиоксиданты семейства SkQ уменьшают объем ишемического повреждения и снижают неврологический дефицит.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Kuopio Stroke Symposium 2007 (Куопио, Финляндия, 2007); III Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Пущино, 2007); XY Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008); Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (СанктПетербург, 2008); International Multidisciplinary Symposium “From experimental biology to preventive and integrative medicine” (Судак, Украина, 2008); открытом семинаре отдела биоэнергетики Научно-исследовательского института физико-химической биологии им.

А.Н.Белозерского МГУ (Москва, 2009) и на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в ведущих рецензируемых журналах и 5 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, содержит 48 рисунков и 1 таблицу. Список литературы включает источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была выполнена на самцах белых нелинейных крыс весом 300-350г (n=301).

Животных содержали в стандартных условиях вивария с неограниченным доступом к пище и воде.

Ишемию головного мозга крысы вызвали введением покрытой силиконом нейлоновой нити в правую среднемозговую артерию, как было описано ранее (Longa et al., 1989; Koizumi et al., 1986). Перекрытие кровотока сохранялось в течение 60 мин, после чего нить извлекали из сосуда, восстанавливая кровоснабжение в бассейне средней мозговой артерии. Во время и после операции температура тела животного поддерживалась на уровне 370,5°С. Ложнооперированные животные (ЛО) подвергались тем же процедурам, за исключением перерезания сосудов и введения нити.

Объем инфаркта головного мозга определяли на 1-е или 7-е сутки после моделирования инсульта морфометрическим анализом цифровых изображений, полученных методом МРТ, или сканированием срезов мозга, окрашенных 2,3,5трифенилтетразолия хлоридом (ТТС метод). Все МРТ эксперименты были выполнены на приборе BioSpec 70/30 (Bruker, Germany) с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 мТл/м.

Изучаемые вещества Изучаемые препараты вводили внутрибрюшинной (в/б) инъекцией в объеме 1 мл или закапывали интраназально (и/н) в объеме 20 мкл, по 4 мкл в каждую ноздрю с интервалом в 4 мин. В качестве контроля к изучаемым фармакологическим препаратам использовали физиологический раствор, который вводили по той же схеме и в равном объеме.

Хлорид лития вводили в/б сразу после начала реперфузии в дозе 3 ммоль/кг.

Пептид PGP был синтезирован в НИИ молекулярной генетики РАН в отделе химии физиологически активных веществ. PGP вводили в/б через 1 ч после начала реперфузии, и далее на 1 и 2 сутки после операции в дозах 0,1 и 0,5 мг/кг.

Пептид ГК-2 был предоставлен ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН.

ГК-2 вводили в/б через 1 ч после начала реперфузии, и далее на 1-2 или 1-5 сутки после операции в дозе 1 мг/кг.

Митохондриально-адресованные антиоксиданты семейства SkQ были предоставлены НИИ физико-химической биологии им. А.Н Белозерского МГУ. SkQ вводили по двум схемам: в первой за 4 дня до операции делали в/б инъекцию в дозе мкмоль/кг; во второй на 5, 4 и 3 сутки до операции делали в/б инъекцию в дозе 0, мкмоль/кг ежедневно. SkQR1 вводили в/б в дозах 0,5, 1 и 2 мкмоль/кг за 1 сутки до моделирования ишемии головного мозга, а также сразу после начала реперфузии закапывали и/н в дозах 20 нмоль/кг и 1 мкмоль/кг. SkQRB вводили в/б в дозах 1 и мкмоль/кг за 1 сутки до моделирования ишемии головного мозга, а C12R19 по той же схеме в дозе 1 мкмоль/кг.

Поведенческие тесты Тестирование животных во всех поведенческих тестах проводилось за сутки до начала индукции ишемии для выявления наличия базового уровня неврологического дефицита и на 1, 4 и 7 или 1-7 послеоперационные дни в зависимости от протокола введения исследуемого препарата.

Для оценки неврологических нарушений, вызванных перекрытием СМА, использовали тест «Стимулирования конечностей», основанный на 14-бальной шкале (De Ryck et al., 1989), в модификации (Jolkkonen et al., 2000). Итоговый балл в ней формируется как сумма баллов в семи тестах, оценивающих ответ задних и передних конечностей на тактильную и проприоцептивную стимуляцию и наличие определённых рефлексов. Для оценки нарушений в работе конечностей использовали следующею систему подсчета: 2 балла – крыса полностью выполняла испытание; 1 балл – крыса выполняла испытание с задержкой в более чем 2 сек и/или не полностью; 0 баллов – крыса не отвечала на стимулирование конечности. Максимально возможное суммарное количество баллов равно 14 для каждой стороны тела и соответствует отсутствию нарушений.

Для оценки сенсомоторной функции передних и задних конечностей в координации и интеграции во время движения животного использовали тест «Сужающаяся дорожка»

(beam-walking test). Крыс обучали в течение 3-х дней пересекать «сужающуюся дорожку»

перед индукцией ишемии. Животных тестировали на 7-й день после ишемии. Установка теста «Сужающаяся дорожка» представляет собой две сужающиеся доски, расположенные друг под другом, где нижняя доска имеет борта для расположения конечностей животного во время соскальзывания с верхней доски. Движение крыс записывалось на видеокамеру, и анализировалось количество соскальзываний с верхней доски на нижнюю для поврежденных (являющихся контралатерально расположенными относительно поврежденного полушария) передней и задней конечности по формуле: количество соскальзываний/общее количество шагов (Schallert et al., 2002).

В тесте "цилиндр" оценивали степень асимметрии использования животным передних конечностей в течение спонтанного исследования стенок цилиндра (Schallert et al., 2000).

Вестерн-блоттинг. Исследование проводилось по протоколу, описанному DuBois R.N. et al., 1996. При этом использовались первичные антитела к pGSK-3 (1: 1000; Cell Signaling), эритропоэтину (1:1000; Santa Cruz Biotechnology Inc.), а также видоспецифичные вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (1:30000, Caltag).

Статистическая обработка результатов. Обработку результатов осуществляли при помощи статистической программы STATISTICA 6 (StatSoft. Inc., USA). Данные представлены на гистограммах и в таблице в виде средних значений+ошибка среднего, n – объем выборки. Нормальность распределения признака в выборке оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка W. Для сравнения данных в поведенческих тестах использовали U-критерий Манна-Уитни (для независимых выборок). Для оценки статистической значимости различий объемов инфаркта использовали T-критерий Стьюдента. Различия признавались статистически значимыми при допустимой вероятности ошибки < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование формирования ишемического очага с помощью метода МРТ и окраски ТТС с анализом моторного дефицита в передних конечностях крыс В ходе эксперимента животных разделили на 2 группы: ИШ – крысы, перенесшие перекрытие СМА (n=8); ЛО – ложнооперированные животные (n=7). Результаты исследования зоны ишемического повреждения, вызванного перекрытием среднемозговой артерии нитью, с помощью МРТ и окраски 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом показали, что в данной модели ишемии кора, включая сенсомоторную область, и стриатум являются основными областями повреждения. При исследовании головного мозга крыс через сутки после ишемии зона поражения определялась с помощью МРТ как повышение сигнала (гиперинтенсивность) на Т2-взвешенных изображениях по отношению к интактному белому веществу за счет развития цитотоксического отека. По результатам морфометрического анализа МР-изображений на 1-е сутки объем пораженного полушария головного мозга был на 143% больше не пораженного вследствие отека, вызванного ишемией. На 7-е сутки после инициации ишемии объем пораженного полушария существенно уменьшился и был на 31,2% больше объема контралатерального полушария, по данным МРТ прослеживалось снижение степени гиперинтенсивности зоны поражения по сравнению с первыми сутками после ишемии. При учете степени отека поврежденной зоны истинные размеры пораженной области на 1-е и на 7-е сутки как по данным МРТ, так и ТТС метода были довольно близки по абсолютным значениям (таблица). В группе ложнооперированных животных при МРТ исследовании и ТТС методом повреждения не были обнаружены. По данным МРТ на первые сутки объем повреждения от всего полушария составил 553,3%, а на 7-е сутки 59,33,3%. Эти данные указывают на то, что в используемой нами модели основной процесс формирования ишемического очага происходит в течение первых суток после ишемии.

коррелировали с сенсомоторными нарушениями конечностей этих животных, оцененных с помощью поведенческих тестов. В тесте «Цилиндр» перед индукцией ишемии независимое использование контра- и ипсилатеральной передней лапы было 19% и 13% соответственно от всех касаний стенки цилиндра. На 7-й день после операции у крыс с ишемией использование поврежденной лапы (контралатеральной поврежденному полушарию головного мозга) статистически значимо снижалось в 2 раза (до 10%). Это снижение компенсировалось повышением использования ипсилатеральной лапы в 4 раза,