На правах рукописи

Курашов Василий Николаевич

ЭЛЕКТРОГЕННЫЙ ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА НА ДОНОРНОМ

УЧАСТКЕ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА

ФОТОСИСТЕМЫ 2

03.01.02 – Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского и на кафедре биофизики биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук Мамедов Махир Джафар оглы доктор биологических наук Нокс Пётр Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Красновский Александр Александрович кандидат физико-математических наук Трубицин Борис Вячеславович

Ведущая организация: Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН

Защита состоится 10 июня 2010 г. в часов минут на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при кафедре биофизики биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «Новая»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «» _ 2010 г.

Учный секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фотосинтез – процесс, с помощью которого фототрофные организмы преобразуют энергию излучения Солнца в энергию химически стабильных органических соединений. В результате фотосинтеза ежегодно происходит выделение 150-200 млрд. тонн молекулярного кислорода в атмосферу Земли и образуется около 200 млрд. тонн первичной биомассы (Barber 2007).

Первичные процессы фотосинтеза в цианобактериях, водорослях и высших растениях осуществляются в тилакоидных мембранах, где локализованы трансмембранные белковые комплексы фотосистемы 2 (ФС 2), цитохрома b6f и фотосистемы 1. Светозависимое окисление воды и выделение молекулярного кислорода катализируется комплексом ФС 2, представляющим собой Н2Опластохинон-оксидоредуктазу, механизм функционирования которой до сих пор является предметом интенсивных исследований. Сложность исследования функционирования этого фермента обусловлена его лабильностью, а также тем, что суммарный процесс включает ряд сопряженных реакций:

светоиндуцированное разделение зарядов между первичным донором электронов P680 и первичным хинонным акцептором Q A, последующее одноэлектронное восстановление Р680+ редокс-активным аминокислотным остатком YZ (тирозин 161 D1-полипептида реакционного центра), двухэлектронное восстановление вторичного хинонного акцептора Q B и четырехэлектронное окисление молекулы воды.

Одной из наиболее актуальных проблем в изучении функционирования ФС 2 является выяснение механизма переноса зарядов на донорном участке фермента, содержащем кластер Mn4Ca, его лигандное окружение и близлежащий тирозин YZ. Перспективным подходом в этих исследованиях является изучение механизма генерации трансмембранной разности электрических потенциалов () комплексами ФС 2 в условиях однократного срабатывания фермента, что существенно облегчает интерпретацию наблюдаемых явлений по сравнению со стационарными процессами.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование механизмов переноса электрона на донорном участке пигмент-белкового комплекса ФС 2 с помощью флуориметрических и прямого электрометрического методов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать особенности реакции переноса электронов в ядерных комплексах ФС 2, лишенных марганцевого кластера [ФС 2 (Mn)] и сопоставить полученные данные с результатами для нативных комплексов ФС 2.

реконструированным марганцем и радикалом тирозина Y Z в комплексах ФС (Mn).

3. Изучить реакцию переноса электрона от марганца к тирозину Y Z в препаратах ФС 2 (Mn) с блокированным железом высокоаффинным сайтом связывания марганца.

4. Исследовать влияние различных экзогенных доноров электронов и синтетических марганец-содержащих комплексов на кинетику генерации мембранного потенциала.

5. Описать механизм восстановления тирозина Y Z от искусственных доноров электронов.

Научная новизна работы.

В условиях реконструкции транспорта электрона в присутствии экзогенного дополнительной электрогенной фазы, обусловленной восстановлением редоксактивного тирозина YZ от Mn. Было выявлено два участка окисления марганца и показано, что перенос электрона через низкоаффинный сайт не сопряжен с образованием мембранного потенциала. Обнаружено, что электрогенный характер восстановления тирозина YZ не является специфичным для марганца, а имеет место и в случае искусственных доноров электронов (дифенилкарбазид, синтетический трехъядерный марганцевый комплекс). При этом наблюдаемая значительная по амплитуде дополнительная электрогенная стадия свидетельствует о достаточно низкой диэлектрической проницаемости на участке белка между YZ и границей белок-вода. Предложена модель, согласно которой низкомолекулярный донор электронов гидроксиламин может диффундировать через каналы на донорной стороне белка к марганецсвязывающему сайту с последующим восстановлением YZ•.

Практическая значимость исследования. Полученные результаты существенно расширяют и углубляют современный уровень знаний о механизмах функционирования пигмент-белкового комплекса ФС 2 и важны для понимания процессов переноса зарядов на донорной стороне ФС 2.

Результаты могут быть использованы в биотехнологии для создания эффективных искусственных систем, преобразующих и запасающих солнечную энергию; в устройствах, осуществляющих фотолиз воды с образованием водорода и кислорода.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на международной конференции «Фотосинтез в пост-геномную эру: структура и функции фотосистем» (г. Пущино, Московская область, 2006); 16-ой международной ежегодной конференции по фотосинтезу «Норд-Вест» (г.

Мюльхайм, Германия, 2007); V Съезде Российского фотобиологического общества и международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (г. Пущино, 2008); XIX Пущинских чтениях по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (г. Пущино, 2009).

Работа была апробирована на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ и на кафедре биофизики биологического факультета МГУ.

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 – в реферируемых журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 29 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 164 источника.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ядерные комплексы ФС 2, содержащие весь набор функциональных кофакторов, включая вторичный хинонный акцептор QB, выделяли из шпината в присутствии глицинбетаина. Комплексы ФС 2, лишнные марганцевого кластера [ФС 2 (Mn)] получали путм обработки нативных комплексов 0,9 М Tris буфером (pH 9,0) в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы с блокированным высокоаффинным сайтом связывания марганца [ФС (Mn+Fe)] были получены путм инкубации ФС 2 в присутствии 15 мкМ FeSO при слабой интенсивности света (15 мкЕ/м2·с) (Semin and Seibert, 2002).

Липосомы получали в результате озвучивания суспензии азолектина (L-лецитин, тип II-S, Sigma) в среде, содержащей 50 мМ HEPES-NaOH (pH 7,5) буфера и 1,4% холата натрия до просветления. Протеолипосомы готовили путем смешивания липосом с ФС 2 в соотношении липид:белок 50:1 по весу.

Удаление детергента осуществлялось на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной соответствующим буфером.

Кинетику индукции и переменную флуоресценцию образцов измеряли при помощи флуорометра FL3000 (Photon Systems Instruments, Чехия) в кювете толщиной 10 мм при 20°С. Интенсивности измерительного и действующего света при регистрации переменной флуоресценции составляли 6,6 мВт/м ( = 617 нм) и 60 Вт/м2 ( = 625 нм), соответственно. Кинетику индукции флуоресценции измеряли при интенсивности света равной ( = 625 нм). Концентрация хлорофилла в образцах ФС 2 составляла 10 мкг/мл.

Исследования кинетики генерации в ответ на вспышку света проводили с помощью прямого электрометрического метода. Суть метода сводится к регистрации разности электрических потенциалов по обе стороны коллодиевой плнки, пропитанной раствором фосфолипидов в декане, со встроенными в нее замкнутыми белково-липидными везикулами, сохраняющими внутреннюю водную полость. Разность потенциалов измеряли при помощи экранированных от света хлорсеребряных электродов, соединенных через операционный усилитель фирмы «Burr Brown» 3554 ВМ (США) с аналого-цифровым преобразователем «CompuScope 8012A» и персональным компьютером.

Для возбуждения образцов использовался неодимовый лазер «Quantel YGФранция) (длина волны 532 нм, полуширина импульса 12 нс).

Анализ полученных кривых проводили при помощи программных пакетов Pluk (Kalaidzidis et al., 1997) и Origin 7.5 (OriginLab Corporation, США).

Аппроксимация кинетик фотоэлектрического ответа проводилась методом последовательных приближений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Транспорт электрона на донорном участке ФС 2 и его реконструкция в препаратах, лишённых марганцевого кластера Ядерные комплексы ФС 2 представляют собой минимальную структурнофункциональную единицу, способную катализировать окисление воды. В нативных препаратах ядерных комплексов ФС 2 наличие Mn4Ca кластера предотвращает реакцию окисления экзогенных доноров электронов редоксактивным аминокислотным остатком – тирозином YZ. Поэтому для исследования реакции переноса зарядов на донорном участке фермента в присутствии экзогенных доноров электрона нами были использованы ядерные комплексы ФС 2 (Mn). Экстракция ионов Mn сопровождается также удалением иона Ca2+ и трх периферических белков, локализованных на донорном участке ФС 2.

На рис. 1 показаны светоиндуцированные изменения переменной флуоресценции (F) в нативных ядерных комплексах и в ФС 2 (Mn). Видно, что экстракция Mn приводит к значительному уменьшению F. Это, вероятно, обусловлено отсутствием донирования электрона на фотоокисленный первичный донор электронов P680. Добавление Mn2+ в соотношении 4 иона Mn на один РЦ приводит к увеличению максимального уровня флуоресценции (F m), что может свидетельствовать о существенном восстановлении электронного транспорта к P680+.

Рис. 1. Фотоиндуцированные изменения переменной флуоресценции в нативных ядерных комплексах ФС 2 и в комплексах ФС 2 (Mn). Среда инкубации: 25 мМ HEPES (pH 7,5), 300 мМ сахарозы и 15 мМ NaCl. Концентрация хлорофилла 10 мкг/мл. Короткая стрелка соответствует измерительному свету, длинные стрелки вверх и вниз – включению и выключению возбуждающего света, соответственно.

Кроме того, реконструкция электронного транспорта на донорном участке фермента также была продемонстрирована с помощью регистрации кинетики индукции флуоресценции (данные не представлены).

На рис. 2 (кривая 1) показан электрический ответ протеолипосом, содержащих ядерные комплексы ФС 2 (Mn) при возбуждении единичными лазерными вспышками. Быстрая генерация за время короче временного разрешения измерительной установки (100 нс) обусловлена переносом электрона от Р680 к первичному хинонному акцептору Q A, с последующим ревосстановлением P680+ тирозином YZ (Semenov et al., 2006).

Рис. 2. Кинетика фотоэлектрических ответов в протеолипосомах, содержащих ядерные комплексы ФС 2(Mn) в отсутствие (1) и в присутствии 10 мкМ MnCl2 (2). На вставке показан результат вычитания кривой 1 из кривой 2. Среда инкубации как на рис. 1.

В отсутствие экзогенных доноров и акцепторов электронов, кинетика спада фотоэлектрического ответа хорошо аппроксимируется двухэкспоненциальной кривой с характеристическими временами 1 ~0,24 мс (амплитуда А1 ~14%) и ~250 мс (амплитуда А2 ~86%). Основная компонента спада 2 обусловлена рекомбинацией электрона между Q A– и YZ. Минорная компонента 1, вероятно, обусловлена рекомбинацией электрона между Р680+ и QA– во фракции комплексов с поврежденным переносом электрона от YZ на P680+.

При добавлении Mn наблюдается существенное замедление кинетики спада, которая аппроксимируется двумя экспонентами с 1 ~486 мс (~30%) и ~2 с (~70%) (кривая 2) и, вероятно, обусловлена пассивной утечкой через липосомальную мембрану. Кроме того, замедление кинетики спада на коротких