На правах рукописи

Мудрецова Юлия Викторовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК АНАЛИЗА И ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ

ХОЛИНА АЛЬФОСЦЕРАТА И МЕЛЬДОНИЯ

В РАСТВОРЕ ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ

14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск – 2014

Работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте – филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель кандидат фармацевтических наук Сенченко Сергей Петрович

Официальные оппоненты:

Калёкин Роман Анатольевич – доктор фармацевтических наук, ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации, старший научный сотрудник отдела судебно-химических и химикотоксикологических научных и экспертных исследований.

Фомин Анатолий Николаевич – доктор фармацевтических наук, доцент, ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой фармацевтической и токсикологической химии.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации «18» сентября 2014 г. в 10 00 часов

Защита состоится на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медикофармацевтического института – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России и на сайте http://www.pmedpharm.ru Автореферат разослан «27» июня 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Ремезова Ирина Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения широко используются ноотропные средства с различным механизмом действия. К таковым относятся препараты холина альфосцерата. Кроме того, в медицинской практике для терапии данных заболеваний применяют препараты мельдония, которые улучшают метаболические процессы. В литературе имеются данные о совместном применении препаратов мельдония и холина альфосцерата в терапии острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, поскольку, проявляя различную фармакологическую активность, они способны дополнять и потенцировать действие друг друга. Особое значение имеют инъекционные лекарственные формы, поскольку при этом достигается максимальная биодоступность, что особенно важно в терапии острых состояний.

Таким образом, создание нового комбинированного лекарственного препарата на основе мельдония и холина альфосцерата в виде раствора для инъекций является актуальной задачей. При этом помимо решения технологических вопросов необходима также разработка надежных методов оценки его качества. Поскольку методики анализа исследуемых веществ различны, необходимо использование универсальных методов, позволяющих вести анализ обоих веществ в одной пробе.

В связи с тем, что мельдоний и холина альфосцерат не имеют в своей структуре хромофорных групп, их детектирование в УФ области спектра невозможно. Известны методики анализа холина альфосцерата методом ВЭЖХ с использованием рефрактометрического или масс-спектрометрического детекторов. Однако, данные методы требуют использования уникального и дорогостоящего оборудования.

Альтернативным методу ВЭЖХ в современной практике считается метод капиллярного электрофореза, который позволяет с помощью косвенного детектирования определять вещества, непоглощающие в УФ области спектра.

Поэтому, для разработки методики анализа холина альфосцерата и мельдония при их совместном присутствии в лекарственных препаратах целесообразным является использование метода капиллярного электрофореза.

Учитывая, что помимо идентификации и количественного определения еще одним немаловажным показателем качества лекарственных препаратов является контроль содержания в них посторонних примесей, не менее актуальным является изучение стабильности мельдония и холина альфосцерата в растворе для инъекций и условий, в которых данные вещества подвергаются деструкции.

Степень разработанности. Аналогом предлагаемого препарата является фармацевтическая композиция, содержащая 3-оксипиридин и холина альфосцерат, дополнительно содержащая производное магния, пиридоксин, никотинамид, идебенон, убихинон (коэнзим Q10) производное цинка (патент RU №2385722). Наиболее близкой к предлагаемому препарату является композиция в форме раствора для инъекций, содержащая в качестве активного ингредиента холина альфосцерат и в качестве носителя повидон (патент RU №2406506). В доступных источниках отсутствуют сведения о содержании указанной разрабатываемых лекарственных препаратах, а также разработанной методики их анализа при совместном присутствии.

Цель и задачи. Цель работы заключалась в разработке методик анализа холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии, стандартизация и изучение стабильности раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:

изучить возможности использования методов капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии для установления подлинности и количественного определения холина альфосцерата и мельдония;

изучить факторы, влияющие на поведение холина альфосцерата и мельдония в условиях мицеллярной электрокинетической хроматографии, с целью оптимизации условий их электрофоретического разделения;

установления подлинности и количественного определения холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций;

количественного определения холина альфосцерата и мельдония по показателям:

специфичность, линейность, прецизионность, правильность, диапазон применения и робастность;

разработать методики определения посторонних примесей холина альфосцерата и мельдония при их совместном присутствии в растворе для инъекций и провести ее валидационную оценку;

с использованием стресс-тестов изучить процесс деструкции холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций.

провести исследования по стандартизации раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний;

с использованием метода «ускоренного старения» лекарственных средств изучить стабильность раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний;

фармакологическую оценку ноотропного и нейропротекторного действия раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний.

Научная новизна. На примере холина альфосцерата и мельдония теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены подходы для электрофоретического разделения цвиттер-ионных соединений. Показано, что в условиях использования мицеллярной электрокинетической хроматографии в боратном электролите возможно разделение как заряженных (холина альфосцерат), так и электронейтральных (мельдоний) цвиттер-ионных соединений. В качестве мицеллообразующей добавки необходимо использование натрия додецилсульфата в концентрации не менее 75 мМ.

Установлено, что повышение чувствительности анализа цвиттер-ионных веществ (в случае отсутствия хромофорных групп) возможно путем применения косвенного детектирования, где в качестве оптимального хромофора выбрана кислота ацетилсалициловая, обеспечивающая наилучшие условия детектирования.

Впервые предложена фармацевтическая композиция в форме раствора для инъекций, обладающая ноотропной и нейропротекторной активностью, содержащая холина альфосцерат и мельдоний.

На основе выбранных условий предложена методика анализа холина альфосцерата и мельдония в растворе для инъекций, валидационная оценка которой показала ее соответствие обоснованным критериям приемлемости по всем показателям: специфичность, линейность, прецизионность, правильность, диапазон применения и робастность.

Проведено изучение стабильности раствора для инъекций, содержащего мельдоний и холина альфосцерат. При этом установлены сроки его годности, которые составляют 2 года.

Впервые, с использованием различных стресс-тестов, изучена кинетика процесса деструкции холина альфосцерата и мельдония. С помощью метода массспектрометрии идентифицированы основные продукты деструкции холина альфосцерата и мельдония.

предлагаемого комплексного раствора для инъекций, в сравнении с холина альфосцератом и мельдонием, применяемыми по отдельности. Полученные данные свидетельствуют о потенцировании ноотропного и нейропротекторного действия веществ в полученной композиции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработанная методика анализа с использованием капиллярного электрофореза может быть использована для качественного и количественного определения холина альфосцерата и мельдония в растворе для инъекций при их совместном присутствии. При проведении валидации разработанной методики изучена возможность построения контрольных карт Шухарта в оценке ее робастности.

При этом выбраны условия, при которых достигается максимальная стабильность результатов в условиях использования мицеллярной электрокинетической хроматографии.

электрокинетической хроматографии, а также варианта косвенного детектирования в анализе холина альфосцерата и мельдония могут быть применены для изучения электрофоретического поведения других лекарственных средств, являющихся цвиттер-ионами.

В Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам подана заявка на изобретение фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний.

Методология и методы исследования. Для разработки методики количественного определения холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций использовался метод капиллярного электрофореза в различных вариантах. Изучение процессов деструкции и стабильности холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций проводили с применением методов мицеллярной электрокинетической хроматографии, тонкослойной хроматографии, а также методом ВЭЖХ-МС.

Положения, выносимые на защиту:

исследования по разработке и валидации методики количественного определения холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций;

результаты проведения процедуры стандартизации раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний;

результаты исследования процессов деструкции и стабильности холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций;

данные по первичной фармакологической оценке ноотропного и нейропротекторного действия раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные положения диссертационной работы доложены на региональных конференциях по фармации (Пятигорск, 2013 и 2014 гг.), а также на 2-й Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, май 2013 года).

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

По результатам работы совместно с ООО «ФармИнтеллект» разработан проект ФСП на «Холина альфосцерат + Мельдоний», раствор для инъекций 4 мл.

Данный проект был апробирован в ГУП РО «Фармацевтический центр» (г.

Ростов-на Дону).

Разработано информационное письмо на методику анализа мельдония и холина альфосцерата при их совместном присутствии в растворе для инъекций.

Методика апробирована ФГБУ «Информационно-методический центр по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения»

Росздравнадзора (г. Ростов-на-Дону).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Описана общая характеристика и применение холина альфосцерата и кровообращения. Рассмотрены способы анализа четвертичных аммониевых оснований и цвиттер-ионов. Проведен анализ литературных данных об использовании методов капиллярного электрофореза и масс-спектрометрии в анализе исследуемых веществ.

При разработке методики использовали рабочие стандартные образцы (РСО) холина альфосцерата гидрата (далее холина альфосцерат) и мельдония дигидрата (далее мельдоний), производства ООО «БИОН», г. Москва, предоставленные ООО «ФармИнтеллект», г. Москва.

В работе использовали систему для капиллярного электрофореза «Капель 103Р» производства фирмы «Люмэкс» со спектрофотометрическим детектором (фиксированная длина волны 254 нм) и кварцевым капилляром длиной 65 см, эффективной длиной 55 см и диаметром 50 мкм. Ввод пробы осуществляли под давлением. Режим ввода пробы 30 мБар, 5 с. Масс-спектрометрический анализ осуществляли на квадрупольном масс-анализаторе типа «ионная ловушка»

(Amazon SL, производства фирмы Bruker, Германия), оснащенном источником ионов с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении, автосамплером и программным обеспечением обработки данных Data analysis.

Ионизацию осуществляли электрораспылением при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре и противоэлектроде составляло 4,0 кВ и 500 В соответственно. Давление на распылителе составляло 1 атм. Скорость потока газа-осушителя (азот) – 5 л/мин.

Температура в камере ионизации – 220°С.

Разработка методики. Изучение электрофоретической подвижности холина альфосцерата и мельдония в условиях капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) показало, что холина альфосцерат в щелочном электролите мигрирует в катодную область капилляра после пика веществ, мигрирующих со скоростью электроосмотического потока (ЭОП), что может свидетельствовать о том, что в этих условиях холина альфосцерат ионизируется и приобретает отрицательный заряд, в то время как мельдоний в щелочном электролите практически не ионизируется и, являясь электронейтральным, мигрирует со скоростью ЭОП. Это делает невозможным анализ исследуемых веществ методом КЗЭ и требует оптимизации условий. Далее для определения мельдония и холина альфосцерата использовался метод мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), применяемый для эффективного разделения как заряженных, так и нейтральных молекул. В качестве поверхностно-активной добавки обычно используется додецилсульфат натрия (ДДСН), образующий отрицательно заряженные мицеллы.

Рисунок 1 – Электрофореграмма раствора холина альфосцерата (2) и мельдония (1) в боратном буфере с добавлением 75 мМ ДДСН Концентрация ДДСН варьировалась от 10 до 125 мМ. При этом установлено, что концентрация 75 мМ является оптимальной для разделения указанных веществ (рисунок 1).

прикладываемого напряжения. Следующим этапом оптимизации условий анализа явилось изучение влияния концентрации ведущего электролита, а также величины прикладываемого напряжение на разделение анализируемых компонентов. В результате варьирования концентрацией электролита от 5 до мг/мл и напряжением от 16 до 25 кВ, установлено, что оптимальными параметрами являются: концентрация ведущего электролита 20±5 мг/мл и напряжение 20±2 кВ.

Так как холина альфосцерат и мельдоний являются веществами, в структуре которых отсутствуют хромофоры, их детектирования по поглощению в УФ области спектра затруднено. В мировой практике для анализа подобных веществ применяют косвенное детектирование. Поскольку анализ ведется при фиксированной длине волны (254 нм), то в состав ведущего электролита вводится легко обнаруживаемое (детектируемое) при 254 нм вещество в концентрации, обеспечивающей необходимую оптическую плотность исходного электролита. В качестве хромофора в составе ведущего электролита были выбраны кислота бензойная, кислота салициловая, кислота ацетилсалициловая, натриевая соль кислоты п-аминосалициловой и калия гидрофталата. Спектрофотометрически были определены молярный коэффициент светопоглощения 1М и удельный коэффициент светопоглощения А11% выбранных веществ в боратном электролите.

При этом установлено, что наибольшие значения показателей поглощения в боратном буфере наблюдаются у калия гидрофталата и кислоты ацетилсалициловой. Было также изучено влияние указанных хромофоров на такие электрофоретические характеристики холина альфосцерата и мельдония как площадь и асимметрия пика, что подтвердило ранее полученные данные о том, что наибольшим поглощением в УФ области обладают калия гидрофталат и кислота ацетилсалициловая. Однако, при относительно небольшой разнице в значениях площадей пиков анализируемых веществ, значение асимметрии пиков близко к оптимальному при использовании в качестве поглощающего компонента кислоты ацетилсалициловой. Кроме того, при использовании в качестве хромофора калия гидрофталата базовая линия менее стабильна, что может отрицательно сказаться на результатах анализа определяемых веществ. При использовании же в качестве хромофора кислоты ацетилсалициловой данной проблемы не возникает (рисунок 2).

Рисунок 2 – Электрофореграммы холина альфосцерата (2) и мельдония (1), в боратном буфере: а) с добавлением кислоты ацетилсалициловой; (б) с добавлением калия гидрофталата.

Водный раствор холина альфосцерата и мельдония был проанализирован в буферных растворах, содержащих в качестве хромофора кислоту ацетилсалициловую в концентрациях 5, 10, 15, 20, 30, 35, 40 и 45 мМ. Из полученных результатов следовало, что добавка кислоты ацетилсалициловой в концентрации 30 мМ является оптимальной, так при этом достигались максимальные значения площадей пиков для обоих компонентов.

Суммируя полученные данные об условиях, обеспечивающих оптимальное разделение мельдония и холина альфосцерата, была разработана методика качественного и количественного определения исследуемых веществ в растворе для инъекций, содержащем 10 г мельдония дигидрата, 25 г холина альфосцерата гидрата и воды очищенной до 100 мл.

Валидационная оценка разработанной методики. Методика анализа мельдония и холина альфосцерата в растворе для инъекций методом капиллярного электрофореза была валидирована по показателям: специфичность, линейность, прецизионность, правильность, диапазон применения и робастность.

При определении специфичности времена миграции растворов СО мельдония и холина альфосцерата совпадали с временами миграции мельдония и холина альфосцерата в испытуемых растворах. На электрофореграмме растворителя (раствора blank) нет мешающих пиков в зоне миграции определяемых компонентов. Результаты валидационной оценки разработанной методики показывают ее приемлемость по всем валидационным показателям (таблица 1).

Таблица 1 Результаты валидационных показателей методики количественного определения мельдония и холина альфосцерата Показатель Линейность Прецизионность Правильность Диапазон применения Для определения робастности разработанной методики количественного определения холина альфосцерата и мельдония были использованы карты Шухарта, контрольные линии которых вычислялись с использованием ранее полученных статистических данных.

Рисунок 3 – А) Контрольные карты размахов для содержания мельдония;

Б) Контрольные карты размахов для содержания холина альфосцерата.

Карты, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о том, что разность между значениями открываемости мельдония и холина альфоцерата при анализе модельных смесей однородна в течение длительного времени, что позволяет говорить о стабильных показателях прецизионности данной методики.

количественного определения мельдония и холина альфосцерата строили карты средних значений (рисунок 4).

Рисунок 4 – А) Контрольные карты средних значений открываемости мельдония;

Б) Контрольные карты средних значений открываемости холина альфосцерата.

Как видно из рисунка 6, разброс средних значений открываемости однороден, ни одна из точек не выходит за пределы контрольных границ, и все они расположены равномерно относительно центральной линии. Это говорит о стабильности показателя правильности.

Установлено, что методика анализа мельдония и холина альфосцерата в растворе для инъекций при изменяющемся факторе «время» робастна.

мельдония и холина альфосцерата методом ТСХ. Учитывая, что методика анализа холина альфосцерата и мельдония с использованием МЭКХ с косвенным детектированием не позволяет контролировать содержания примесей в разрабатываемом растворе для инъекций, в связи с ее недостаточной чувствительностью, целесообразным явилось использование метода ТСХ. Для этого в качестве неподвижной фазы использовались хроматографические пластины Kieselgel 60 F254 фирмы «Merk», размером 2020 см, в качестве подвижной фазы применялась система растворителей ацетон - спирт метиловый вода - кислота уксусная ледяная (5:4:2:2). Хроматографирование проводилось восходящим методом при комнатной температуре (18-22С) в камерах, насыщенных парами системы растворителей. В качестве проявителя использовался водный раствор калия перманганата. Для холина альфосцерата составило 0,25, а для мельдония 0,55, что свидетельствует о значение Rf высокой специфичности методики в отношении анализа каждого из веществ.

Учитывая отсутствие стандартных образцов примесей, контроль их содержания фармацевтических субстанций.

Изучение стабильности мельдония и холина альфосцерата. Как мельдоний, так и холина альфосцерат относят к высокостабильным веществам.

Поэтому были изучены условия, в которых данные вещества подвергаются разложению с целью идентификации возможных продуктов деструкции.

Испытания включали такие эффекты как воздействие температуры, влажности, окисления (перекись водорода) и гидролиз в агрессивной среде. В результате проведенных исследований было установлено, что мельдоний и холина альфосцерат остаются стабильными при их хранении как в нейтральных условиях, так и в присутствии окислителя.

Изучение стабильности мельдония и холина альфосцерата в условиях кислотного гидролиза. Согласно рекомендациям международной конференции по гармонизации (ICH), для моделирования стресс-условий использовали хлористоводородную кислоту 0,1 М, 0,5 М и 1 М при нагревании. Стабильность мельдония и холина альфосцерата оценивали по изменению площади пиков и, соответственно, концентрации анализируемых веществ в растворах.

растворов мельдония (1), при нагревании растворов холина альфосцерата (1), с хлористоводородной кислотой в без нагревания с кислотой (а) и при Из полученных электрофореграмм следует, что только в среде 1 М раствора хлористоводородной кислоты пик мельдония существенно уменьшился. Кроме того, наблюдалось появление сателлитного пика, что может свидетельствовать о наличии продукта деструкции. Анализ электрофореграмм холина альфосцерата показал, что при термостатировании его растворов в среде 0,1 М кислоты хлористоводородной площадь и характер пика остаются неизменными. При нагревании с кислотой хлористоводородной 0,5 М площадь пика холина альфосцерата существенно уменьшилась, а в 1 М растворе кислоты холина электрофореграммы не позволяют определить примеси холина альфосцерата, образующиеся в результате процесса деструкции.

Кроме того, при анализе исследуемых растворов методом ТСХ на хроматограмме мельдония при его гидролизе в среде 0,1 М и 0,5 М кислоты хлористоводородной посторонних пятен не наблюдалось. При анализе же раствора мельдония, подвергшегося гидролизу в среде 1 М кислоты хлористоводородной, на хроматограмме наблюдалось появление дополнительного пятна с Rf 0,45, что свидетельствовало о наличии продукта деструкции. На хроматограмме холина альфосцерата при его гидролизе в среде 0,1 М кислоты хлористоводородной также не наблюдалось посторонних пятен.

При анализе раствора, термостатируемого в среде 0,5 и 1 М кислоты хлористоводородной, на хроматограмме наблюдалось появление дополнительного пятна с Rf 0,33, что свидетельствовало об образовании продукта деструкции. При анализе раствора модельной смеси, термостатируемого в среде 1 М кислоты хлористоводородной на хроматограмме наблюдалось появление двух дополнительных пятен с Rf 0,45 и 0,33, что свидетельствовало об образовании тех же продуктов деструкции мельдония и холина альфосцерата.

Полученные результаты свидетельствует о способности методики разделять анализируемые компоненты и между собой и с возможными примесями, образующимися в процессе хранения. Это говорит о специфичности выбранных условий и обуславливает возможность использования данной методики для контроля содержания посторонних примесей в растворе для инъекций.

Изучение процесса деструкции мельдония и холина альфосцерата. Для дальнейшего изучения процесса деструкции готовили растворы мельдония и холина альфосцерата (5 мг/мл) в 1 М и 0,5 М растворах кислоты хлористоводородной соответственно и нагревали их на кипящей водяной бане, варьируя временем от 10 до 60 минут, после чего каждый из анализируемых растворов затем использовали для количественного определения, результаты которого представлены в виде кинетических кривых (рисунок 7).

Рисунок 7 Кинетические кривые мельдония (а) и холина альфосцерата (б) при действии на них кислоты хлористоводородной при нагревании Анализ полученных кривых показывает, что процесс деструкции мельдония сопровождается расщеплением его структуры через две последовательных стадии с константами скорости 0,0305 мин-1 для первой стадии и 0,0544 мин-1 для второй, что может говорить о наличии нескольких примесей, образующихся в процессе деструкции мельдония. Процесс деструкции холина альфосцерата также сопровождается расщеплением его структуры через две последовательных стадии с константами скорости 0,0642 мин-1 для первой стадии и 0,0364 мин-1 для второй.

Однако константа скорости на 1-м этапе существенно выше таковой на втором.

Низкое значение константы скорости на втором этапе деструкции может говорить о том, что основной процесс разрушения проходит на первой стадии, а на второй происходит окончательный распад молекулы холина альфосцерата и накопление примеси, образовавшейся на 1-м этапе. Исходя из химической структуры данного соединения наиболее вероятно образование в данных условиях продуктов деметилирования как для мельдония, так и для холина альфосцерата.

Идентификацию продуктов деструкции мельдония проводили путем сопоставления значений молекулярных масс этих соединений со значениями m/z+ сигналов масс-спектра. Масс-спектры, полученные в вышеописанных условиях, представлены на рисунке 8.

Рисунок 8 Масс-спектр примесей мельдония, полученный в результате деструкции.

Анализ ионного тока показал наличие двух примесей с молекулярной массой 104 и 118, что подтверждается также наличием аддукт-ионов с молекулярной массой 127 и 141 (таблица 2).

Таблица 2 Возможные примеси мельдония, образующиеся в процессе Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что потенциально возможными примесями, образующимися в процессе хранения препаратов мельдония могут быть 3-(2-метилгидразин) пропионовая кислота и 3гидразинпропионовая кислота.

проводили путем сопоставления значений молекулярных масс этих соединений со значениями m/z+ сигналов масс-спектра.

Полученные масс-спектры, представлены на рисунке 9.

Рисунок 9 – Масс-спектр примеси холина альфосцерата, полученной в результате деструкции В результате деструкции холина альфосцерата в среде 0,5 М кислоты хлористоводородной образуется примесь с массой 243, что соответствует продукту, образующемуся на 1-м этапе деметилирования и имеющего формулу:

Таким образом, в результате проведенного исследования установлена структура продукта деструкции холина альфосцерата, который может являться потенциально возможной примесью, образующейся в процессе хранения.

Стандартизация комплексного препарата на основе мельдония и холина альфосцерата. Были проведены исследования по стандартизации комплексного препарата в форме раствора для инъекций, содержащего 100 мг/мл мельдония дигидрата и 250 мг/мл холина альфосцерата гидрата объемом 4 мл по (потенциометрическое определение), механические включения, номинальный объем, испытание на чистоту и допустимые пределы примесей, количественное определение мельдония и холина альфосцерата, а также сроки годности (согласно ОСТ 42-91500.05.001–00). Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Стандартизация раствора для инъекций, содержащего мельдоний и холина альфосцерат Прозрачность Раствор должен быть прозрачным рН (потенциометрически) 6,5-7, Механические включения В соответствии с РД 42-501- Посторонние примеси и не более 0,5% для мельдония Количественное определение холина альфосцерата Количественное определение показателям. Исследование стабильности и срока годности комплексного препарата мельдония и холина альфосцерата в форме раствора для инъекций проводили методом ускоренного старения. Установлено, что исследуемый раствор остается стабильным в течение двух лет.

Изучение фармакологических свойств комплексного препарата на основе мельдония и холина альфосцерата. Фармакологические исследования проводились на кафедре биологии и физиологии Пятигорской ГФА под руководством кандидата фармацевтических наук Дьяковой И.Н.

Нейропротекторный эффект оценивали по выживаемости животных после билатеральной окклюзии общих сонных артерий. Ноотропный эффект определяли с помощью теста экстраполяционного избавления, а также оценивая психоэмоциональную и исследовательскую активности животных. В группе животных, которым вводили композицию мельдония и холина альфосцерата наблюдались более высокие показатели двигательной и исследовательской активности через сутки после операции. Полученные данные свидетельствовали о потенцировании ноотропного и нейропротекторного действия веществ в полученной композиции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проведенных научных исследований можно сделать следующие выводы:

1. Изучено электрофоретическое поведение мельдония и холина альфосцерата в условиях капиллярного зонного электрофореза и МЭКХ. Установлено, что разделение указанных веществ достигается только в условиях использования МЭКХ.

2. Показано, что основными факторами, влияющими на подвижность анализируемых веществ, является концентрация мицеллообразующего компонента, концентрация ведущего электролита и прикладываемое напряжение. Повышение чувствительности анализа обоих веществ возможно путем использования косвенного детектирования, где в качестве оптимального хромофора была выбрана кислота ацетилсалициловая, обеспечивающая наилучшие условия детектирования.

3. В выбранных условиях разработана методика установления подлинности и количественного определения мельдония и холина альфосцерата при совместном присутствии в растворе для инъекций. Выполнена валидационная оценка разработанной методики по показателям специфичность, линейность, прецизионность, правильность, диапазон применения и робастность. Установлено, что методика соответствует критериям приемлемости по всем показателям.

4. Разработана методика установления подлинности и контроля содержания посторонних примесей в растворе для инъекций, содержащем мельдоний и холина альфосцерат методом ТСХ. Показана специфичность и высокая чувствительность разработанной методики.

5. Изучен процесс деструкции мельдония и холина альфосцерата в растворе для инъекций с использованием стресс-тестов (в нейтральных условиях, в присутствии окислителя и при нагревании с кислотой). Установлено, что мельдоний подвергается разрушению только при кипячении в среде 1 М хлористоводородной кислоты, а холина альфосцерат в среде 0,5 и 1 М хлористоводородной кислоты.

6. С помощью разработанной методики количественного определения мельдония и холина альфосцерата изучена кинетика процесса деструкции обоих веществ при их гидролизе в среде кислоты хлористоводородной. Методом массспектрометрии идентифицированы основные продукты деструкции исследуемых веществ.

7. Проведена стандартизация комплексного препарата мельдония и холина альфосцерата в форме раствора для внутривенного и внутримышечного введения, мл. Согласно требованиям ОСТа 91500.05.001-00 установлены нормы его качества.

8. Методом «ускоренного старения» изучена стабильность раствора для инъекций, содержащего мельдоний и холина альфосцерат. При этом срок годности препарата составил 2 года.

9. Проведена первичная фармакологическая оценка раствора для инъекций, содержащего мельдоний и холина альфосцерат. Установлено, что ноотропный и нейропротекторный эффект анализируемой композиции достоверно превышают таковые у каждого из веществ по отдельности.

Проведенные исследования по разработке методик анализа и изучению стабильности холина альфосцерата и мельдония в растворе для инъекций являются основой для создания ноотропного препарата, содержащего лекарственные вещества, проявляющие различный механизм действия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Разработка методики количественного определения холина альфосцерата и мельдония методом капиллярного электрофореза / М.В. Гаврилин, Ю.В.

Мудрецова, С.П. Сенченко [и др.] // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии – 2012. № 4. – С. 12-16.

Гаврилин, М.В. Определение стабильности показателей правильности и прецизионности методики анализа мельдония и холина альфосцерата с использованием контрольных карт Шухарта / М.В. Гаврилин, Ю.В. Мудрецова // Современные проблемы науки и образования: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.science-education.ru/106-7711.

Гаврилин, М.В. Изучение стабильности мельдония в водных растворах методами мицеллярной электрокинетической хроматографии и массспектрометрии / М.В. Гаврилин, Ю.В. Мудрецова // Хим.-фармац. журн. 2014.

Том 88, № 2. С. 52-56.

Гаврилин, М.В. Исследование электрофоретического поведения холина альфосцерата и мельдония при использовании метода мицеллярной электрокинетической хроматографии в условиях косвенного детектирования / М.В. Гаврилин, С.П. Сенченко, Ю.В. Мудрецова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2012. – Вып. 67. – С. 226-229.

Дьякова, И.Н. Изучение ноотропного и нейропротекторного действия холина альфосцерата и мельдония при совместном применении / И.Н. Дьякова, Ю.В.

Мудрецова, М.В. Гаврилин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2012. – Вып. 67. – С. 326-327.

Мудрецова, Ю.В. Изучение зависимости электрофоретической подвижности мельдония и холина альфосцерата от электропроводности системы / Ю.В.

Мудрецова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2013. – Вып. 68. – С. 272-273.

электрофоретическую подвижность мельдония и холина альфосцерата / М.В.

Гаврилин, Ю.В. Мудрецова // Материалы Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез». Краснодар, 2013.

– С. 63.

Автор выражает искреннюю благодарность кандидату фармацевтических наук, старшему преподавателю кафедры физиологии и патологии Пятигорского медико-фармацевтического института Дьяковой И.Н. за помощь в проведении фармакологических исследований.

МУДРЕЦОВА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК АНАЛИЗА И ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ

ХОЛИНА АЛЬФОСЦЕРАТА И МЕЛЬДОНИЯ

В РАСТВОРЕ ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ

14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия Формат бумаги 6084 1/ Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0.

Тираж 50 экз. Заказ № Отпечатано в Пятигорском медико-фармацевтическом институте – филиале ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации 357532, г. Пятигорск, пр. Калинина,