На правах рукописи

БУРМЕНСКАЯ

Ольга Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ИММУННОГО

ОТВЕТА ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ОРГАНОВ

ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ

03.03.03 – иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА - 2014

Работа выполнена в ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России.

Научные консультанты: Сухих Геннадий Тихонович доктор медицинских наук, профессор, академик РАН Трофимов Дмитрий Юрьевич доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Кадагидзе Заира Григорьевна доктор медицинских наук, профессор, заведующая централизованным клинико-лабораторным отделом ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» РАМН Наровлянский Александр Наумович доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией цитокинов ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России Афанасьев Максим Станиславович доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова»

Защита состоится «24 » сентября 2014 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России по адресу:

115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте http://nrcii.ru/dissertacionnyj-sovet/ ФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан «_ » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Гудима Георгий Олегович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Открытие и внедрение в практику в конце 80 годов метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) внесло огромный вклад в развитие современной биологии и медицины. В настоящее время данный метод широко используется для решения целого ряда фундаментальных и прикладных задач, включающих в себя определение генетических заболеваний, вариантов полиморфизма генов, функциональной активности генома, а также изучение воздействия на организм человека биотических факторов окружающей среды (бактерий, грибов, вирусов).

Следует отметить, что каждая из выше перечисленных задач может решаться как самостоятельно, так и в составе комплексного исследования. В данной работе комплексный подход предложен для решения фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии на примере воспалительных процессов, сопровождающих заболевания органов женской репродуктивной системы.

Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей (вульвиты, вагиниты) являются одной из наиболее распространенных причин обращения женщин к врачу акушеру-гинекологу [Hainer B.L., 2011]. От неспецифического вагинита страдает почти каждая пятая пациентка гинекологической практики (19,2%), а среди пациенток с патологическими белями частота его выявления возрастает в 4 раза [Анкирская A. C., 2005]. Известно, что в основе репродуктивных неудач (трубно-перитонеальный фактор бесплодия, самопроизвольные выкидыши), акушерских осложнений родов и послеродового периода, таких как преждевременное излитие околоплодных вод, внутриутробное и интранатальное инфицирование плода и новорожденного, мертворождение, хориоамнионит в родах, послеродовые гнойно-септические осложнения, также лежат те или иные воспалительные заболевания половых органов [Кира Е. Ф., 2008].

Воспаление чаще всего вызвано действием патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, идентификация которых чрезвычайно важна при выборе терапии.

Однако в значительной степени развитие инфекционного процесса определяется состоянием локального (мукозального) иммунитета и зависит от иммунологической реактивности макроорганизма. В патогенезе заболевания микробный фактор играет такую же роль, как и состояние макроорганизма, и те обстоятельства, которые изменяют его иммунобиологические свойства [Серов В.Н., 2006]. В связи с этим изучение мукозального иммунитета представляет чрезвычайный интерес. В то же время, спектр методов исследования мукозального иммунитета остается весьма ограниченным из-за малого количества материала и наличия слизи в образцах. В ходе исследований возникают вопросы, связанные с нормировкой материала, способов его взятия и транспортировки. Вследствие этого существующие знания об изменении различных иммунологических показателей (цитокинов, дефензинов, иммуноглобулинов, рецепторов иммунокомпетентных клеток и др.) при вагинитах не получили должного применения в клинической практике. Основным, и зачастую, единственным методом оценки состояния локального иммунитета в рутинной практике в настоящее время остается микроскопия мазка с подсчетом числа лейкоцитов. Альтернативой подсчету числа лейкоцитов может служить оценка иммунологических показателей (как пример, транскрипционный профиль генов цитокинов).

';

В настоящее время накоплены многочисленные данные о зависимости экспрессии цитокинов не только от влияния внешних патогенных факторов, но и от генетической вариабельности кодирующих их генов. В частности, получены данные об ассоциациях отдельных полиморфизмов генов цитокинов с такими нозологическими формами как вульвовагинальный кандидоз [Johnson M. D., 2012] и бактериальный вагиноз [Cauci S., 2007; Genc M. R., 2004, Gomez L. M., 2010].

Оригинальность настоящего исследования состоит в том, что различные нозологические формы вагинитов были исследованы в совокупности, включая случаи воспаления неустановленной этиологии. Использование такого подхода обосновано тем, что зачастую воспалительная реакция является неспецифической в отношении инициирующего патологического агента.

Кроме того, большое внимание исследователей привлечено к проблеме воспалительных заболеваний органов малого таза, среди которых хронический эндометрит (ХЭ) является наиболее распространенным. ХЭ выявляется примерно у 10% женщин репродуктивного возраста, но у пациенток с нарушениями генеративной функции частота его обнаружения увеличивается до 23–57% [Назаренко Т. А., 2007]. Среди женщин с ХЭ 80–90% составляют женщины детородного возраста. ХЭ обуславливает у них нарушения менструальной и репродуктивной функций, приводя, в конечном итоге, к развитию бесплодия, неудачам в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), невынашиванию беременности и осложненному течению гестационного процесса и родов [Унанян А. Л., 2012].

Все предложенные в данной работе молекулярно-генетические маркеры (транскрипты генов иммунной системы, полиморфизмы генов, а также возбудители воспалительных заболеваний) могут быть идентифицированы в одном и том же образце с использованием одного универсального метода – полимеразной цепной реакцией, что сокращает время для проведения исследований.

Цель и задачи работы Цель работы:

Разработать комплексный подход к характеристике воспалительных процессов органов женской репродуктивной системы на основе молекулярногенетических маркеров, включающих количественную идентификацию инфекционных агентов, определение транскрипционного профиля генов иммунной системы и генетических особенностей организма.

1. Для оценки профиля экспрессии генов иммунного ответа разработать тестсистемы на основе метода количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2. Выявить особенности экспрессии мРНК генов иммунного ответа (цитокины, рецепторы, транскрипционные факторы и др.) при вагинитах и хроническом эндометрите.

3. Установить распределение аллельных вариантов генов иммунного ответа, ассоциированных с предрасположенностью к развитию вагинитов у женщин репродуктивного возраста.

4. Провести характеристику состава микроорганизмов, способствующих развитию воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы (вагиниты, хронический эндометрит).

5. Разработать способы идентификации локальной воспалительной реакции при вагинитах и хроническом эндометрите на основе интегральной оценки транскрипционных профилей генов иммунного ответа.

6. Определить наиболее важные молекулярно-генетические маркеры воспалительного процесса, позволяющие одновременно получать информацию о полиморфизмах и активности генов иммунной системы, а также вирусологическом и бактериологическом фоне.

Научная новизна исследования Впервые разработан и апробирован метод комплексной оценки клинического биоматериала на молекулярно-генетическом уровне при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы, позволяющий одновременно получать информацию о вирусологическом и бактериологическом фоне, а также полиморфизмах и активности генов иммунной системы.

Впервые при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы на основе метода ОТ-ПЦР проведено исследование представленности транскриптов широкого спектра генов иммунного ответа (цитокины IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL15, IL18, IL23, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189), транскрипционные факторы (TBX21, GATA3, RORC, Foxp3), толл-подобные-рецепторы (TLR2, TLR4, TLR9), клеточные маркеры иммунной системы (IL2R, CD45, CD68, СD69), а также гранулизин GNLY).

Выбраны наиболее информативные маркеры воспалительного процесса при вагините (TNF, IL18, TLR4, GATA3) и хроническом эндометрите (IL1B, IL2, IL10, Foxp3, TLR9, IL2Ra).

Впервые применен способ интегральной оценки представленности транскриптов генов иммунного ответа при вагинитах и хроническом эндометрите, позволивший охарактеризовать состояние локального иммунитета и предложить новый молекулярно-генетический метод определения воспалительных процессов слизистой влагалища и эндометрия.

Впервые при исследовании транскрипционных профилей использован метод определения индекса соотношения уровня экспрессии генов, позволяющий осуществлять анализ без нормировки на референсные гены, что существенно упрощает и снижает стоимость исследования, делает его доступным для рутинной диагностики.

Впервые получены данные об ассоциации Lactobacillus iners с состоянием локального иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L.iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, CD45 и снижению уровня экспрессии мРНК IL18 по сравнению с образцами, в которых доминирует L.crispatus.

Определены генетические предикторы предрасположенности к развитию вагинитов. Впервые установлено, что генетическая предрасположенность к пониженной экспрессии TNF- и TGF-1, обусловленная генотипом GG локуса TNF –238 G>A и генотипом СС локуса TGFB1 -509 C>T, является фактором риска развития вагинита.

Научно-практическая значимость Представленная работа является фундаментально-прикладным исследованием, результаты которого имеют важное значение для развития как фундаментальных, так и прикладных аспектов иммунологии, молекулярной биологи и медицины.

Созданный в ходе работы методический подход позволяет получить более полную информацию об активности генов иммунной системы при воздействии на организм женщин биотических факторов (бактерий, грибов, вирусов) при вагинитах и хроническом эндометрите.

Определены перспективы использования комплексного подхода к диагностике воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы в гинекологической практике для объективной оценки локальных воспалительных реакций, индивидуального прогноза развития заболевания, для количественного определения микроорганизмов с целью выбора оптимальных схем терапии. В акушерской практике предлагаемый подход может быть использован для предупреждения и профилактики родовых и послеродовых осложнений.

В работе использована отечественная приборная и технологическая база с целью импортозамещения в области инновационных прикладных молекулярногенетических исследований.

По результатам диссертационной работы поданы 2 заявки на патент и 1 на регистрационное удостоверение:

Патент на изобретение № 201147924 от 25.11.2011 г.: «Способ диагностики неспецифических вагинитов у беременных женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках». Авторы:

Бурменская О.В., Меджидова М.К., Непша О.С., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.

Патент на изобретение № 2013145241 от 9.10.2013 г.: «Способ определения локальной воспалительной реакции у женщин репродуктивного возраста по уровню экспрессии мРНК генов цитокинов во влагалищных мазках».

Авторы: Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Тютюнник В.Л., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.

Регистрационное удостоверение № 3756 от 7.02.2014 г. на Набор реагентов для оценки локальной воспалительной реакции влагалища методом ОТПЦР в режиме реального времени (Экспрессия генов. Воспаление влагалища) по ТУ производства ООО «Научно-производственного объединение ДНК-Технология».

Положения, выносимые на защиту Для исследования функциональной активности генов иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы разработаны 32 тест-системы на основе количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

изменением транскрипционного профиля иммунокомпетентных клеток: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF, снижается экспрессия мРНК генов GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC.

воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей у носителей аллеля С локуса TGFB1 -509 C>T и протективная роль аллеля А локуса TNF –238 G>A в развитии вагинитов.

Профиль экспрессии генов иммунного ответа в эндометрии зависит от фазы менструального цикла и наличия воспаления. При полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы эндометрия повышена экспрессия мРНК генов IL1В, IL6, IL8, IL10, IL12А, TNF, TGFB1, Foxр3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFА, TLR2. Склерозирование сосудов и фиброз стромы эндометрия сопровождаются более выраженным изменением цитокинового каскада:

повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL6, IL8, IL12А, TGFB1, Foxр3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFА, TLR2, IL18, IFNG и TLR4.

Определены ассоциации различных видов лактобактерий с состоянием микробиоты влагалища и местного иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L.iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, СD45 и снижению IL18.

При хроническом эндометрите в полости матки определена ведущая роль бактериального фона, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами (Enterobacteriaceae, Gardnerella vaginalis/ Prevotella spp./ Porphyromonas spp., Ureaplasma spp).

7. Предложены способы оценки функционального состояния местного иммунитета при вагинитах и хроническом эндометрите с фиброзом стромы эндометрия по транскрипционному профилю генов иммунного ответа, основанные на методах многофакторного анализа.

Апробация работы Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях, съездах и симпозиумах: итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007 г.); XI и XII Всероссийские научные форумы «Мать и дитя» (Москва, 2010 г., 2011 г.); VI Региональный научный форум «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012 г.);

Всероссийский конгресс «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы» (Москва, 2011 г.); III и IV междисциплинарные научно-практические конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клиниколабораторная диагностика и терапия» (Санкт-Петербург, 2010 г.; Москва, 2011 г.);

54 научная конференция МФТИ «Проблемы фундаментальных и прикладных естественных и технических наук в современном информационном обществе.

Молекулярная и биологическая физика». (Москва, 2011 г.); XXIV Международный Конгресс c курсом эндоскопии (Москва, 2011 г.); V и VI Международный конгресс по репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи» (Москва, 2011 г., 2012 г.); V Российская конференция "Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты" (Иваново, 2012 г.); 7 и 8 Европейские конгрессы по иммунологии репродукции (Афины, Греция, 2009 г.; Мюнхен, Германия, 2010 г.); Всемирный конгресс по репродукции человека (Aвстрия, 2011 г.); Международный конгресс IVI-клиник (Валенсия, Испания, 2011 г.); I Конференция по биомаркерам в репродуктивной медицине: возникновение нового направления исследования (Валенсия, Испания, 2012 г.); Всемирный конгресс по гинекологии, бесплодию и перинатологии (Барселона, Испания, 2012 г.).

Диссертация частично выполнена в рамках работ по Государственным контрактам Министерства образования и науки РФ №16.522.12.2009 от 29 сентября 2011 года и №16.512.11.2093 от 22 февраля 2011 года.

Публикации По теме диссертации опубликованы 54 печатные работы, в том числе статей в 11 рецензируемых научных изданиях, 3 патента, 21 публикация в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 249 страницах машинописного текста, содержит таблицы, 46 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Библиография включает 336 источников, из них 60 – на русском, 276 - на иностранных языках.

Личный вклад автора Личный вклад автора состоит во включенном участии на всех этапах процесса, непосредственном участии соискателя в получении исходных данных и научных экспериментах, личном участии в апробации результатов исследования, обработке и интерпретации экспериментальных данных, выполненных лично автором, подготовке основных публикаций по выполненной работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы исследования. В качестве биоматериала для исследований использовали соскобы отделяемого слизистой влагалища, периферическую кровь, биоптаты тканей эндометрия. Взятие биоматериала и обследование пациентов осуществлялось медицинским персоналом ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России при подписании пациенткой информированного согласия на проведение исследования.

Объем исследования. Всего исследовано 1684 образца: из них 1168 образцов соскобов отделяемого слизистой влагалища, 210 образцов крови, 306 образцов тканей эндометрия. Исследовано и проанализировано в общей сложности молекулярно-генетических маркеров (табл.1).

Группы исследования при вагинитах. Проведено клинико-лабораторное исследование 411 пациенток научно-поликлинического отделения в возрасте от до 45 лет и 101 беременной женщины в возрасте от 18 до 40 лет на сроках от 37 до 40 недель беременности без родовой деятельности с целым плодным пузырем.

Таблица 1. Материалы и объем исследования.

слизистой оболочки (Enterobacteriaceae, Streptococcus spp, Staphylococcus spp), облигатно-анаэробные влагалища микроорганизмы (Gardnerella vaginalis, Prevotella spp., Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp., Leptotrihia spp., Fusobacterium spp., Megasphaera spp., Veilonella spp., Dialister spp., Lachnobacterium spp., Clostridium spp., Mobiluncus spp., Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae), а также Candida spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium патогены Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, вирусы ВПГ1,2 типа, ЦМВ, другие УПМ Enterococcus spp, E.coli, Streptococcus agalactiae, Klebsiella spp, Staphylococcus aureus, Candida albicans.

Типирование лактобактерий: L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. jonsonii, L. vaginalis, L. acidophilus, L. casei / L. rhamnosus, L. plantarum, L. fermentum.

LIF), транскрипционных факторов (TBX21, GATA3, RORC, Foxp3), толл-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9) и поверхностных маркеров клеток иммунной системы rs1143634, rs16944), IL1R1или IL1RA (rs2234650), IL1RN (rs315952), IL6 (rs1800795), IL (rs4073), IL10 (rs1800871, rs1800872, rs1800896), IL12B (rs3212227), IL18 (rs187238, rs1946518, rs1946519), INFG (rs2430561), TNF (rs1800629, rs361525) и TGFB1 (rs1800469, rs1982073=rs1800470), TLR2 (rs4986790), TLR4 (rs3804099), CCL2 (rs1024611) эндометрия IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189), транскрипционного фактора Foxр3, -цепи рецептора ИЛ-2 (IL2RА) и толл-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9) На основании результатов клинико-лабораторного исследования были сформированы следующие группы.

Небеременные женщины: 1A - группа сравнения или условно здоровых женщин (n=95); 1B подгруппа - наличие Ureaplasma spp. более 104 ГЭ/мл (n=19);

1С подгруппа - кандидоносительство (n=27); 2-ая группа - пациентки с вагинитом (n=215); 3-я группа – пациентки с бактериальным вагинозом (n=55).

Беременные женщины: 1A - группа сравнения или условно здоровых женщин (n=50); 2B подгруппа - наличие Ureaplasma spp. более 104 ГЭ/мл (n=16);

1С подгруппа - кандидоносительство (n=11); 2-ая группа – пациентки с вагинитом (n=24).

Критерии включения: репродуктивный возраст, для беременных женщин сроки от 37 до 40 недель беременности без признаков родовой деятельности.

Критерии исключения: наличие патогенов (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis), применение антибактериальных препаратов за месяц до обследования. В отношении беременных женщин – наличие у пациенток тяжелой экстрагенитальной и акушерской патологии, исцмико-цервикальная недостаточность с ее хирургической коррекцией, наличие вирусных инфекций.

Группы исследования при хроническом эндометрите. Проведено клиниколабораторное исследование 110 пациенток отделения клинической эндокринологии ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России в возрасте от до 45 лет. Критерии включения: гистологически подтвержденный диагноз хронического эндометрита. Критерии исключения: тяжелая соматическая патология;

миома матки, аденомиоз или образования в яичниках, требующих оперативного лечения; наличие онкологических заболеваний; гормонотерапия в течение последних 3 месяцев. На основании результатов клинико-лабораторного исследования были сформированы следующие группы: 1-ая - группа сравнения или условно здоровых женщин (n=31); 2-ая группа - женщины с хроническим эндометритом (n=79).

Методы исследования. Базовый метод исследования – ПЦР в режиме реального времени, включающий определение состава микрофлоры влагалища, определение транскрипционного профиля генов иммунного ответа, определение полиморфизмов генов иммунного ответа. Все ПЦР-исследования выполнены с использованием реактивов и приборов производства ООО «НПО ДНК-Технология», Россия согласно Инструкциям производителя.

Определение состава микрофлоры влагалища Для выделения ДНК микроорганизмов использовали наборы «Проба ГС».

Метод основан на сорбции ДНК на носителе (сорбенте), отмывке от примесей с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента.

При количественной оценке биоценоза влагалища учитывали: общее количество бактерий, количество Lactobacillus spp. и 14 основных групп микроорганизмов, представляющих условно-патогенную флору, включая факультативно-анаэробные, облигатно-анаэробные микроорганизмы, Candida spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium («Фемофлор 16»).

Результаты ПЦР исследования были интерпретированы на основании рекомендаций “Применение метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для оценки микробиоценоза урогенитального тракта у женщин (тест Фемофлор)”, разработанных НЦАГиП им. В.И.Кулакова и НИИАиГ им. Д.О. Отта (2012 г.) с незначительной модификацией: наличие Candida spp.

рассматривалось, как вульвовагинальный кандидоз (ВВК), и трактовалось либо, как бессимптомное кандидоносительство при отсутствии воспалительной реакции, либо как вагинит при наличии симптомов заболевания и количестве лейкоцитов в мазке более 10 для небеременных женщин и более 20 для беременных.

Под абсолютным нормоценозом понимали вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры (Lactobacillus spp.) в его составе была более 80% по отношению к общему количеству бактерий, количество Ureaplasma spp., M. hominis – менее 104 ГЭ/мл. Условный нормоценоз расценивали как вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры в составе общей бактериальной массы была более 80%, но количество Ureaplasma spp., M. hominis – могло быть более 104 ГЭ/мл. Под анаэробным и аэробным дисбиозом понимали дисбаланс биоты, обусловленный одним или несколькими УПМ соответственно в количестве более 20% по отношению к общему количеству бактерий, и долей нормофлоры менее 80%. Смешанный дисбиоз - дисбаланс, вызванный сочетанием бактериальной биоты и Candida spp. на фоне снижения количества нормофлоры.

У всех пациенток исследуемых групп методом ПЦР в режиме реального времени также определяли наличие патогенов, вирусов, выполнено типирование лактобактерий (табл.1).

При исследовании бактериального фона в эндометрии определяли те же самые микроорганизмы за исключением типирования лактобактерий.

Определение транскрипционного профиля генов иммунного ответа Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК». Метод основан на лизисе клеток в 4 М растворе гуанидинтиоцианата и осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя с последующими отмывками этанолом и ацетоном. При наличии в образце большого количества материала (ткани эндометрия) использовали метод фенол-хлороформной экстракции [Sambrook, 1989]. Реакцию обратной транскрипции (синтез кДНК из полученной РНК) проводили в объеме 40 мкл. В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали оригинальные специфичные олигонуклеотиды и обратную транскриптазу M-MuLV. Реакцию проводили при температуре 40С в течение 30 минут, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95С в течение 5 минут. Амплификацию осуществляли в режиме реального времени с измерением уровня флуоресценции по каналу FAM на каждом цикле при температуре отжига праймеров. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки.

Нормировка осуществлялась методом сравнения пороговых циклов (метод Cq) по 4 референсным генам (B2M, GUSB, TBP и HPRT1) и значению медианы уровня экспрессии в группе сравнения, которую принимали равной 1.

Определение замен одиночных нуклеотидов (SNP) Для определения SNP ДНК выделяли из ядер лимфоцитов. Метод основан на разрушении лимфоцитов с помощью лизирующего буфера, не влияющего на целостность мембран ядер лимфоцитов. ДНК из ядер выделяли с использованием наборов «Проба ГС». Для типирования однонуклеотидных полиморфизмов генов иммунного ответа использована ПЦР с плавлением продуктов реакции в присутствии «примыкающих» олигонуклеотидов (вариант метода adjacent probes, kissing probes).

Высокая достоверность полученных результатов обеспечивалась получением кривых плавления по двум каналам флуоресценции (FAM и HEX).

Дополнительные клинико-лабораторные методы исследования при вагинитах: сбор анамнестических данных, жалоб пациентки; осмотр вульвы, слизистых влагалища и шейки матки в зеркалах, бимануальное гинекологическое исследование; микроскопия мазков, окрашенных по Граму; культуральное исследование.

хроническом эндометрите: клинические (анализ жалоб, анамнеза, определение гинекологического статуса); гистероскопия, диагностическое выскабливание эндометрия; гистологическое исследование; ультразвуковое исследование органов малого таза.

Дополнительные клинико-лабораторные исследования были выполнены врачами и сотрудниками ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России.

Статистика. Статистическую обработку результатов исследования уровней экспрессии генов проводили с использованием методов непараметрического анализа.

Исследованные количественные показатели представлены в виде Ме (L-H), где Ме – медиана, L – нижний квартиль, Н – верхний квартиль. Значения Ме в группе сравнения были приняты за 1, а значения Ме в исследуемых группах показывала во сколько раз уровень экспрессии гена выше или ниже по отношению к группе условно здоровых пациенток. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использован U-критерий Манна-Уитни. Различие между группами полагали статистически значимым при p4lg/мл Рисунок 3. Типы дисбиозов при вагинитах у небеременных женщин Третья группа - пациентки с бактериальным вагинозом (n=55) (согласно критериям Амсела, при количестве лейкоцитов в мазке менее 10 в поле зрения).

Пациентки этой группы предъявляли жалобы на обильные выделения из половых путей (58,2%), наличие неприятного запаха (25,5%), зуд (10,9%), жжение (7,3%) во влагалище. Диспареуния отмечена в 3,6% случаев. В 32,7% случаев БВ протекал бессимптомно без жалоб со стороны пациенток.

Характеристика состава микробиоценоза влагалища беременных женщин Первая группа - условно здоровых беременных женщин с отсутствием жалоб и признаков воспаления на момент обследования (n=77). По результатам микроскопии число лейкоцитов в мазке не превышало 20 в поле зрения. В составе микробиоценоза влагалища у всех женщин доминировали лактобактерии. У 50 женщин выявлен абсолютный нормоценоз (группа сравнения, подгруппа 1А), у 16 – выявлена Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл (условный нормоценоз, подгруппа 1В), а у 11 – Candida spp. в количестве более 103 ГЭ/мл (кандидоносительство, подгруппа 1С).

Вторая группа – пациентки с признаками вагинита (n=24). Во 2-ой группе пациенток выявлено наличие воспалительной реакции со стороны слизистой влагалища и шейки матки, количество лейкоцитов в мазке более 20 в поле зрения. По структуре биоценоза в группе женщин с вагинитами различали несколько вариантов состояния биоценоза: абсолютный нормоценоз (n=9), ВВК (n=9), облигатноанаэробный дисбиоз (n=6).

Таким образом, этиологическими агентами воспалительных заболеваний наиболее часто являются грибы рода Candida и анаэробные микроорганизмы, ассоциированные с БВ, что согласуется с данными IUSTI. Согласно данным IUSTI 2011 года основными причинами инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища являются бактериальный вагиноз (22-50%), вульвовагинальный кандидоз (17-39%) и трихомониаз (4-35%), а также аэробный вагинит [Sherrard J., 2011].

Типирование и количественная оценка лактобактерий преобладающими видами в составе лактофлоры (более 50 % по отношению к суммарному количеству лактобактерий) были только 4 вида лактобактерий из 11 исследованных: L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri (рис.4). Доля других видов в составе лактофлоры в подавляющем большинстве случаев была незначительной. Только в нескольких случаях при вагините и БВ в составе лактофлоры доминировали L. vaginalis, L.jonsonii и L. acidophilus.

родоспецифичными праймерами для Lactobacillus spp.

Рисунок 4. Основной вид Lactobacillus в составе лактофлоры в зависимости от состояния микробиоценоза влагалища.

ассоциировано с нормальным состоянием микробиоты влагалища. Преобладание L. crispatus составило 50% и было статистически более значимым в группе сравнения, чем в группе женщин с вагинитами – 17% (OR=0,2 (0,12-0,34), p=2,5x10-9) и бактериальным вагинозом – 17% (OR=0,21 (0,09-0,5), p=1,3x10-4).

Напротив, доля образцов с преобладанием L. iners в составе лактофлоры была выше при дисбиотических процессах и составила 48% - при вагините (OR=4,4 (1,9p=2,2x10-4), 38% - при кандидоносительстве (OR=2,9 (1-8,5), p=0,046), 48% - при условном нормоценозе (OR=5 (1,5-13,1), p=6,2x10-3) и 27% - в группе сравнения.

Аналогичная тенденция была получена и для группы женщин с бактериальным вагинозом (р=0,09).

ассоциировано и преобладание в составе лактофлоры L. gasseri. В группе женщин с БВ достоверно чаще отмечено наличие L. gasseri, как основного вида в составе нормофлоры – 30% (OR=5,4 (2,1-13,6), p=1,3x10-4), чем в группе сравнения (8%).

Аналогичная тенденция получена и для группы с вагинитом (р=0,08). При вагините и БВ выявлены образцы без лактобактерий. Их доля составила 4% - при вагините и 9% при БВ.

Полученные результаты о преимущественном распространении 4 видов лактобактерий: L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri согласуются с данными литературы [Donati L. 2010; Yan D.H., 2009]. Частоты распространения и преимущественного количественного доминирования в составе нормофлоры различных видов лактобактерий в группе сравнения (рис.4) приблизительно соответствуют данным Дж. Равель [Ravel J., 2011] для белой популяции женщин.

Полагают, что лучшая защитная функция L. crispatus обеспечивается поддержанием наиболее кислой среды рН= 4,0±0,3 [Ravel J., 2011] и выработкой H2O2 [Antonio M.A., 2005]. При доминировании других типов лактобактерий среда менее кислая:

рН=4,4±0,6 – L.iners, рН=5,0±0,7 – L. gasseri [Ravel J., 2011]. Большинство штаммов L. iners не cинтезируют H2O2 [Antonio MA, 2005]. Кроме того, Rampersaud R. выделил интермедилизину Streptococcus intermedius и вагинолизину Gardnerella vaginalis, роль которых в патогенезе дисбиотических процессов доказана [Rampersaud R., 2011].

Разработка способа диагностики локальной воспалительной реакции С целью наиболее оптимальных маркеров был исследован широкий спектр генов (30 маркеров).

иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища. По количеству копий мРНК в биологическом материале все гены можно было условно разделить на 3 группы (рис.5): гены с высоким уровнем экспрессии и концентрацией транскрипта от 107 до 105 копий мРНК/мл (IL8, IL1B, IL18, TGFB1, CD68, GATA3); гены со средним уровнем экспрессии и концентрацией транскрипта от 105 до 103 копий мРНК/мл (TNF, CD45, IL12A, IL23, TLR2, TLR4, CD69, IL10, RORC) и гены с низким уровнем экспрессии - менее 103 копий мРНК/мл (IL15, Foxp3, LIF, TLR9, GNLY, TBX21, IFNG, IL6, IL2Ra). Следует отметить, что экспрессия последней группы генов не всегда детектировалась в клетках соскобов слизистой влагалища. В качестве потенциальных маркеров воспаления было целесообразно использование генов с высоким и средним уровнем экспрессии. Маркеры с низким уровнем экспрессии были исключены из дальнейшего рассмотрения.

Концентрация мРНК, Рисунок 5. Уровень представленности транскриптов генов иммунного ответа в клетках вагинальных соскобов.

Отмечены медианы и межквартильный размах.

Особенности экспрессии мРНК генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов в норме, при вагините и БВ Уровень мРНК генов IL8, TLR2, TLR4, IL1B, IL10, CD69, CD45, TNFA при вагинитах был существенно выше, а IL18, GATA3, CD68, IL12A, TGFB1 - снижен по сравнению со своими группами сравнения (табл.3). Изменений в уровне экспрессии мРНК гена IL23 не выявлено.

Таблица 3. Изменения уровней экспрессии генов при вагинитах и БВ Полученные данные для беременных женщин и небеременных женщин были аналогичными. Похожие изменения в профиле экспрессии генов, но менее выраженные, были и в группе женщин с БВ (за исключением TNF и RORC), что свидетельствует об участии одних механизмов реализации воспалительного процесса вне зависимости от типа возбудителя, в первую очередь, механизмов врожденного иммунитета.

Корреляция Lactobacillus iners с уровнем экспрессии генов. Учитывая ассоциацию L. iners c воспалительными заболеваниями слизистой влагалища, была проанализирована зависимость транскрипционного профиля от типа лактобактерий.

При анализе данных было установлено, что в образцах группы сравнения с доминированием L. iners достоверно повышены уровни экспрессии мРНК генов IL8 в 1,7 (p=0,026), TLR4 в 2 (p=0,033), IL10 в 3,8 (p=0,01), CD69 в 2,5 (p=0,005), CD45 в 1, (p=0,049) раза и снижен IL18 в 1,7 (p=0,005) раза, чем в образцах с доминированием L. crispatus (рис.6).

Относительный уровень экспрессии мРНК Рисунок 6. Транскрипционный профиль генов иммунной системы в зависимости от типа лактобактерий. Представлены медианы значений в группах. Значение Ме в группе сравнения с доминирование L. crispatus принято за 1.

Изменения в транскрипционном профиле генов, ассоциированные с L.iners, аналогичны изменениям, характерным для вагинитов и БВ, хотя и существенно менее выраженные. Полученные данные согласуются с лучшей протективной функцией L. crispatus.

Разработка способа оценки локальной воспалительной реакции. При разработке способа оценки воспалительной реакции во влагалище был выполнен регрессионный анализ (метод бинарной логистической регрессии).

отобраны две группы пациенток (обучающая выборка): 43 небеременных и 50 беременных женщин из группы сравнения (n=93) и 115 небеременных и 24 беременных пациенток из группы с вагинитами (n=139). На втором этапе была исследована проверочная выборка: 52 пациентки из группы сравнения и 100 женщин из группы с вагинитами.

Для статистического анализа вместо значений уровней экспрессии мРНК генов чувствительность и специфичность метода (рис.7, табл.4).

Уровень экспрессии Рисунок 7. Индивидуальные показатели уровней экспрессии и индексов в обучающей выборке образцов небеременных женщин.

Таблица 4. Чувствительность и специфичность метода при использовании Уравнение линейной функции, подобранное с помощью метода регрессионного анализа включало два индекса и имело вид:

z=1,4*ln([TLR4]/[GATA3]) + 1,3*ln([TNF]/[IL18]) + 7,8 (формула 2) где [TLR4]/[GATA3] и [TNF]/[IL18] – индексы соотношения уровней экспрессии соответствующих генов.

Для беременных и небеременных женщин было подобрано одно линейное уравнение. Далее вероятность локальной воспалительной реакции определяли по формуле:

P = 1/(1+e-z) * 100% (формула 3), где z – значение функции для каждого конкретного образца, рассчитанное по формуле 2.

Полученные результаты по повышению уровней экспрессии мРНК генов TNF TLR4 согласуются с данными литературы. TNF- является одним из ключевых цитокинов воспалительного процесса. Взаимодействие липополисахаридов клеточных стенок грамотрицательных бактерий с TLR-4, что приводит к активации макрофагов и синтезу целого ряда провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF- и интерферонов I типа (IFN- и ) [Kawai T, 2011]. Ожидалось повышение уровня экспрессии GATA3и IL18, т.к. GATA3 представляет собой фактор транскрипции и широко известен, как позитивный регулятор дифференцировки Th2лимфоцитов [Mjsberg J, 2012], а IL-18 в сочетании с IL-12 участвует в дифференцировке Th1- лимфоцитов. Получены результаты по снижению данных маркеров при вагинитах. Возможно, это связано с тем, что дифференцировка наивных Т-лимфоцитов осуществляется в регионарных лимфатических узлах, а не локально в очагах инфекции. Известно, что GATA3 экспрессируется не только иммунокомпетентными, но и некоторыми другими типами клеток, в частности, он играет важную роль в поддержании структуры эпителия [Ho I.C., 2007]. Показано, что воспалительные процессы в коже при псориазе сопровождаются активной пролиферацией эпидермиса и понижением уровня экспрессии мРНК гена GATA [Racz E., 2011]. По аналогии, снижение уровня экпрессии мРНК GATA3 при вагинитах, вероятно связано с процессами десквамации и физиологической регенерации эпителия влагалища. Таким образом, функции GATA3 и IL-18 в местном иммунитете слизистой влагалища могут отличаться от функций в региональных лимфатических узлах и требуют дальнейшего исследования.

Оптимальное значение величины порога отсечения (точки cut off) определено с помощью ROC-анализа, для беременных и небеременных женщин определены разные пороги отсечек. Для небеременных женщин площадь под ROC-кривой воспаления составило 57% (Р=57%). Значения показателей Р выше 57% классифицировали, как маркер вагинитов для небеременных женщин.

AUC=0,985±0,015 (p=1,9х10-11). Пороговое значение вероятности воспаления - 68,5% (Р=68,5%). Значения показателей Р выше 68,5% классифицировали как маркер вагинитов для беременных женщин.

Чувствительность и специфичность предложенного метода оценки локальной воспалительной реакции в области порогового значения составила 96,4% (134 из 139) и 96,8% (90 из 93) соответственно для обучающей выборки. Прогностическая ценность положительного результата (positive predictive value PPV) и прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value NPV) составили PPV=97,8% и NPV=94,7%.

Чувствительность и специфичность предложенного метода оценки локальной воспалительной реакции в области порогового значения для проверочной выборки составила 94% (94 из 100) и 90,4 (47 из 52) соответственно, PPV=94,9%, NPV=88,7%.

Все исследованные мазки были проанализированы на наличие локальной воспалительной реакции (табл.5).

Таблица 5. Классификация мазков по наличию Обращает на себя внимание, что при кандидоносительстве большая часть образцов (94,7%) определены как норма. В то время как при условном нормоценозе с Ureaplasma spp. в количестве более 104ГЭ/мл в 40% случаев отмечено наличие локальной воспалительной реакции. Вопрос о роли уреаплазм в патогенезе воспалительных заболеваний половых органов до сих пор остается неоднозначным.

В период с 1986 по 1998 года данный микроорганизм рассматривался как инфекция, передающаяся половым путем [Hunjak B., 2014]. Ureaplasma spp. может вызывать уретриты, циститы, с уреаплазмой по-прежнему связывают преждевременные роды.

Данный микроорганизм выявляется и у здоровых женщин. Однако некоторые авторы полагают, что присутствие уреаплазмы в количестве более 104 КОЭ, может свидетельствовать об инфекционном процессе [Hunjak B., 2014].

Согласно полученным данным и в соответствии с предложенной моделью, бактериальный вагиноз в половине случаев (47,3%) сопровождается изменением цитокинового профиля, характерным для воспалительного процесса. Наши данные не подтверждают представление о бактериальном вагинозе, как невоспалительном синдроме, однако соответствуют данным IUSTI, согласно которым бактериальный вагиноз рассматривается, как этиологический фактор вагинита [Sherrard J., 2011].

воспалительной реакции может быть полезным инструментом определения воспаления при БВ и наличии Ureaplasma spp.

Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с микроскопическим методом подсчета числа лейкоцитов По результатам сравнения результатов микроскопии мазков и предлагаемого способа оценки локальной воспалительной реакции коэффициент корреляции составил rS=0,61 (p = 1,6x10-28) (рис.8).

Рисунок 8. Корреляция предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с микроскопическим методом подсчета числа лейкоцитов Сравнение результатов микроскопии мазков и предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции в группе сравнения и при вагинитах представлены в таблице 6.

По положительным результатам совпали 82,3% образцов, по отрицательным – 84,2%. Доля ложноотрицательных результатов ОТ-ПЦР методом составила 5,6%, в то время как по результатам микроскопии с подсчетам числа лейкоцитов она была выше и составила 12,1%. Доля ложноположительных результатов ОТ-ПЦР методом составила 6,3%, в то время как по результатам микроскопии с подсчетам числа лейкоцитов она была выше и составила 9,5%. Таким образом, предлагаемый способ оценки локальной воспалительной реакции на основе метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени по транскрипционному профилю генов иммунного ответа обеспечивает лучшую чувствительность и специфичность метода.

Таблица 6. Результаты микроскопии мазков и ОТ-ПЦР Осложнения родов и послеродового периода у пациенток с вагинитами и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл Использование предлагаемого способа оценки локальной воспалительной реакции представляет интерес для прогнозирования и предупреждения акушерских осложнений. Наличие вагинита и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода. Наиболее значимые осложнения родов и послеродового периода у обследованных беременных представлены в таблице 7.

Таблица 7. Осложнения родов и послеродового периода околоплодных вод родовых путей Всего раневая инфекция осложнениями * – достоверные различия по сравнению с подгруппой 1А Осложнения родов и послеродового периода достоверно чаще отмечены в группе беременных с признаками воспаления слизистой (OR=3,7 (1,3–10,5), p=0,01) и подгруппе 1В с Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл (OR=4,1 (1,2–13,3), p=0,016) по сравнению с подгруппой 1А. У женщин с бессимптомным носительством грибов не было ни одного случая осложнений родов и послеродового периода. В то время как у женщин с кандидозным вагинитом осложнения родов и послеродового периода отмечались у 7 из 9 (77,8%) пациенток (OR=73,5 (2,9-1882), p=7,6х10-4).

Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что во время беременности более, чем в 40% случаях ВВК, носит характер бессимптомного кандидоносительства и не вызывает осложнений [Jensen J.S., 2011]. Таким образом, Candida spp. может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода только при наличии локальной воспалительной реакции.

Как видно из данных, представленных в таблице 7, наиболее часто встречающимся осложнением родового акта явилось преждевременное излитие околоплодных вод с тенденцией к повышению в подгруппе 1В и группе 2 (р=0,18).

Разрывы мягких тканей родовых путей достоверно чаще наблюдались во 2-ой группе - у 7 (29,2%) по сравнению с 3 (6%) в 1А подгруппе (OR=6,5 (1,5-27,8), p=0,006). При анализе подгрупп наблюдалась тенденция к повышению частоты разрывов мягких тканей родовых путей у женщин подгруппе 1В (р=0,12).

Общее количество осложнений послеродового периода в группе с признаками воспаления слизистой было статистически значимо более высоким и составило 6 (25,0%) случаев по сравнению с беременными подгруппы 1А, где осложнения пуэрперия наблюдались у 3 (6%) (OR=5,2 (1,2-23), р=0,019). Отмечена тенденция к повышению послеродовых осложнений при наличии Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл (р=0,12).

Определение ассоциаций полимофизмов генов иммунного ответа с предрасположенностью к развитию вагинитов Вышеизложенные данные свидетельствуют о влиянии УПМ на экспрессию медиаторов локального иммунитета - цитокинов. Вместе с тем известно, что уровень экспрессии генов зависит не только от влияния персистирующих микроорганизмов, но также определяется генетическими особенностями организма хозяина. В связи с этим были выполнены исследования ассоциации полиморфизмов генов иммунного ответа с предрасположенностью к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей женщин.

соответствовало закону Харди-Вайнберга. При сравнении частот встречаемости аллелей в группе женщин с вагинитами выявлены достоверные различия для аллеля А локуса TNF–238 G>A (OR=0,21 (0,07-0,68), p=0,004) и аллеля С локуса TGFB1-509 C>T (OR=1,8 (1,1-2,9), p=0,015) (рис.9).

Частота аллеля, %

С С Т С Т Т

T A G C T C T C G A

A G A G A C A C C G G T A C

Частота аллеля, %

С Т С Т Т С Т

A G A G A A G

В группе женщин с вагинитами достоверно реже отмечен гетерозиготный генотип GA локуса TNF –238 G>A (OR=0,19 (0,06-0,64, p=0,0035, аутосомнодоминантная модель), чем в группе сравнения (рис.10).

Частота аллеля или генотипа,% Рисунок 10. Частота выявления аллелей генотипов локусов TNF –238 G>A и TGFB1 -509 C>T.

Ген TNF картирован на хромосоме 6p21.3, имеет размер 2762 п.н. и содержит 4 экзона. Известны более 30 полиморфных вариантов гена, но только около половины из них влияют на экспрессию TNF- in vitro. Полиморфизм в промоторной области гена TNF –238 G>A (rs361525) содержит замену гуанина на аденин, что исследовании установлено, что аллельный вариант A локуса TNF –238 G>A является протективным и встречается реже в группе женщин с вагинитами, чем в группе сравнения. По-видимому, высокая экспрессия TNF- приводит к эффективной стимуляции иммунокомпетентных клеток и способствует своевременной элиминации возбудителей на ранних стадиях заболевания.

В группе женщин с вагинитами достоверно чаще отмечен гомозиготный рецессивная модель), чем в группе сравнения (рис.10). Ген TGFB1 картирован на хромосоме 19q13.1, имеет размер 23403 п.н. и содержит 7 экзонов. Продукт этого гена регулирует клеточные процессы пролиферации, дифференцировки, адгезии, апоптоза, миграции, воспаления, фиброза, заживления ран и ангиогенеза [Massague J, 2006]. По отношению к иммунным клеткам ведет себя, как иммуносупрессорный фактор. Полиморфный вариант Т локуса TGFB1 -509 С>T (rs1800469) содержит замену цитозина на тионин и приводит к повышению уровня экспрессии этого цитокина [Grainger D. J., 1999]. По-видимому, высокая экспрессия TGF- способствует своевременной остановке воспалительного процесса и не дает ему перейти в разряд патологических на поздних стадиях заболевания.

Полученные нами данные позволяют рассматривать генетическую предрасположенность к пониженной экспрессии TNF- и TGF-1 как факторы риска развития вагинита. Таким образом, факторы риска развития вагинита ассоциированы с “дикими” и более распространенными в популяции генотипами, что возможно и обуславливает широкое распространение данной гинекологической патологии.

Хронический эндометрит Идентификация микроорганизмов в полости матки Полость матки защищена естественными физиологическими барьерами и остается малодоступной для микроорганизмов, обитающих в окружающей среде.

Вместе с тем, нижние отделы половых путей обильно заселены микроорганизмами.

Суммарная бактериальная масса во влагалище у женщин репродуктивного возраста может составлять до 108 микроорганизмов. При этом полость матки остается защищенной благодаря анатомическому и функциональному строению половых путей: наличию эндоцервикса и слизистой пробки. Вместе с тем, данная защита остается относительно проницаемой, в том числе в случае нарушения строения шейки матки и при прохождении сперматозоидов и семенной жидкости, которая может содержать различные микроорганизмы.

При идентификации микроорганизмов в полости матки возникают некоторые затруднения. Во-первых, необходимо исключить контаминацию микроорганизмами из нижних отделов половых путей, что требует определенной техники взятия биоматериала [Гомболевская Н., 2012]. Во-вторых, концентрация микроорганизмов может быть очень низкой и недостаточной для идентификации, полагают, что в некоторых случаях инфекционный возбудитель остается не выявленным. С другой стороны, инфекционные агенты зачастую запускают воспалительный процесс, который продолжается в отсутствии самого возбудителя.

Согласно полученным данным степень бактериальной обсеменности полости матки составила около 104 ГЭ/мл (табл.8). В основном бактериальная масса была представлена лактобактериями. При ХЭ частота выявления различных микроорганизмов составила: Enterobacteriaceae (E.coli, Klebsiella spp и др.) – 25,3%, Gardnerella vaginalis/Prevotella spp./Porphyromonas spp. – 17,7%, Ureaplasma spp. – 15,2%, идентифицированы также такие возбудители урогенитальных инфекций, как C. trachomatis, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus spp., Enrerococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma spp., Peptostreptococcus spp. и другие.

Таблица 8. Спектр выявленных микроорганизмов в биоптатах эндометрия Peptostrept Atopobium vaginae Mycoplasma spp Ureaplasma spp Локальный транскрипционный профиль при хроническом эндометрите На основе результатов гистологического исследования эндометрия пациентки были разделены на следующие группы: 1. Группа сравнения (n=31) - эндометрий ранней, средней или поздней стадии пролиферации. 2. Женщины с хроническим эндометритом (n=79), из них: 2A- полный симптомокомплекс ХЭ (n=44) с наличием в строме эндометрия очагового фиброза стромы, склеротических изменений стенок спиральных сосудов эндометрия, воспалительных лимфоидных инфильтратов в сочетании с плазматическими клетками; 2B - неполная форма ХЭ с очаговой и рассеянной инфильтрацией стромы лимфоцитами и плазмоцитами (n=20); 2C неполная форма ХЭ с фиброзом стромы эндометрия и склеротическими изменениями стенок спиральных сосудов эндометрия (n=15) (рис. 11 А-Г).

А. Хронический эндометрит с крупным Б. Хронический эндометрит с рассеяной лимфоидным фоликулом (2A подгруппа) лимфоидной инфильтрацией (2B подгруппа) В. Хронический эндометрит с фиброзом Г. Эндометрий стадии пролиферации Рисунок 11. Морфологическая картина ХЭ и эндометрия стадии пролиферации.

Окраска гематоксилином и эозином.

При наличии полного симптомокомплекса ХЭ (подгруппа 2A) и при неполной форме ХЭ с лимфоидной инфильтрации стромы (подгруппа 2B) были отмечены сходные изменения транскрипционного профиля, связанные с повышением уровня экспрессии мРНК генов IL1В, IL6, TNF, LIF, IL10, TLR9, TGFB1, IL12А, IL2Ra, VEGFА (табл. 9, рис.12). Изменения профиля экспрессии биомаркеров в подгруппе женщин с лимфоидной инфильтрацией стромы лимфоцитами и плазмоцитами позволяют рассматривать данную патологию, как ХЭ, что согласуется с данными литературы о наличии полного симптомокомплекса и неполной формы ХЭ [Шуршалина А. В., 2007]. Пациентки, у которых в результате гистологического исследования тканей эндометрия выявлена только лишь лимфоидная инфильтрация, можно рассматривать, как женщин с ХЭ.

Таблица 9. Уровень экспрессии мРНК генов иммунного ответа в тканях эндометрия при хроническом эндометрите Относительный уровень экспрессии мРНК Представлены медианы значений в группах. Значение Ме в группе сравнения принято за 1.

Более выраженные изменения в уровне экспрессии мРНК отмечены при неполной форме ХЭ с фиброзом стромы эндометрия (подгруппа 2C), связанные с повышением экспрессии мРНК генов IL1В, IL6, TNF, IL8, LIF, IL10, TLR9, TGFB1, IL12A, IL18, IFNG, TLR2, Foxp3, IL2Ra, VEGF121, TLR4 (табл.9, рис.12).

Полученные нами данные позволяют расширить представление о патогенезе хронического эндометрита, и связать их не только с влиянием инфекционных агентов, но и с нарушениями иммунологических механизмов нормального функционирования и репарации поврежденных тканей эндометрия.

Фиброз стромы и склероз сосудов эндометрия могут рассматриваться, как более тяжелые формы ХЭ, требующие наибольшего внимания. В связи с этим на дискриминировать группу с фиброзом стромы эндометрия.

Уравнение линейной функции имело следующий вид:

z=3,6*ln([IL1B]/[IL2])+5,5*ln([IL10]/[Foxp3])+3,5*ln([TLR9]/[IL2Ra])- соотношения уровня экспрессии соответствующих маркеров.

В результате ROC- анализа выбрано значение точки cut off= 63%. Площадь под кривой составила AUC=0,995±0,007 (p=6,3х10-7). Чувствительность и специфичность предложенной модели составили 93,3% и 100% соответственно. При значении вероятности более 63% образцы следует рассматривать, как наличие фиброза стромы эндометрия.

Вероятность фиброза, % Рисунок 13. Распределение образцов эндометрия при ХЭ в зависимости от фиброзирования стромы В соответствии с предложенной статистической моделью все образцы группы сравнения были определены, как образцы без фиброза. Как образцы с фиброзом эндометрия, были определены 12 пациенток (27%) подгруппы 2A (полный симптомокомплекс хронического эндометрита), 7 пациенток (35%) - подгруппы 2B (лимфоидная инфильтрация) и 14 пациенток (93%) - подгруппы 2C с фиброзом эндометрия (рис.13).

Данные литературы по фиброзированию стромы эндометрия очень ограничены, однако патогенез фиброза в независимости от места локализации процесса, вероятно, достаточно универсален. Известно, что TGF-1 является одним из основных медиаторов формирования фиброза [Ueha S., 2012]. Другой механизм фиброза может начинаться через активацию TLR-9, что было доказано для пациентов, склонных к быстро прогрессирующему идиопатическому фиброзу легких [Hogaboam CM, 2012]. Согласно полученным нами данным оба этих маркера повышены. Возможно, что женщины, попадающие в группу фиброза эндометрия, составляют группы риска неблагоприятного течения заболевания с прогрессирующим процессом фиброза.

ВЫВОДЫ

1. Для оценки транскрипционных профилей генов иммунного ответа разработаны 32 тест-системы на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени (IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL15, IL18, IL23, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189, TBX21, GATA3, RORC, Foxp3, TLR2, TLR4, TLR9, IL2R, CD45, CD68, B2M, HPRT1, TBP и GUSB).

2. Воспалительные процессы слизистой влагалища сопровождаются изменением транскрипционного профиля иммунокомпетентных клеток: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF от 1,5 до 9 раз (рA в развитии воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей (OR=0,21 (0,07-0,68), p=0,004, аутосомно-доминантная модель).

4. Профиль экспрессии генов иммунного ответа в эндометрии зависит от фазы менструального цикла и наличия воспаления. При полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы эндометрия повышен уровень экспрессии мРНК генов IL1В, IL6, TNF, LIF, IL10, TLR9, TGFB1,