МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи

Некрасов Евгений Александрович

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ

ДЛЯ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ,

ПРОИСХОДЯЩИХ ПРИ ГЕПАТИТАХ

Специальности 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов (перерабатывающие отрасли АПК)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва

Работа выполнена на кафедре технологии продуктов детского и функционального питания ГОУ ВПО Московского государственного университета прикладной биотехнологии (МГУПБ)

Научный руководитель Доктор технических наук, профессор Токаев Энвер Саидович Официальные Доктор технических наук, профессор оппоненты: Бобренева Ирина Владимировна Кандидат медицинских наук, ст.н.с.

Журавель Сергей Владимирович

Ведущая организация ООО «Нутритек»

Защита диссертации состоится «10» декабря 2008 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 212.149.01. при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета прикладной биотехнологии по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33.

Автореферат разослан «_» 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат технических наук, профессор А.Г. Забашта

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Изучение вопросов, связанных с лечением и профилактикой заболеваний печени, имеет огромную социальную значимость.

По статистике ВОЗ, среди причин нетрудоспособности и смертности существенное место занимают такие заболевания печени, как циррозы, печеночная недостаточность, гепатоциллюлярный рак и др. Приводят к перечисленным серьезным патологическим состояниям в большинстве своем заболевания гепатитом различной этиологии (вирусный, лекарственный, алкогольный, аутоиммунный и др.). Важное значение имеют лечебнопрофилактические мероприятия для коррекции заболеваний на ранних стадиях, чтобы не допустить хронизации патологического состояния и необратимых последствий.

Поддержание на постоянном уровне основных компонентов жизнедеятельности организма и обезвреживающая функция – два главных направления деятельности печени, тесно между собой связанных.

Патологические изменения структуры печени, ее функций вследствие заболевания, вызывает серьезные нарушения метаболизма, иммунного статуса, детоксикации и антимикробной защиты всего организма.

Современные знания о негативных изменениях в организме, происходящих при заболеваниях печени представлены работами, основанными на многочисленных исследованиях отечественных и зарубежных ученых:

Подымовой С.Д., Ивашкина В.И., Блохиной Н.П., Хазанова А.И., L.H.

Blumgart, M. Feldman, С.М. Leevy, S. Sherlock, и др.

В последнее время в медицинской практике интенсивно развивается направление, связанное с применением биологически активных веществ (БАВ), их комплексов, в производстве биологически активных добавок (БАД) к пище или для обогащения пищевых продуктов лечебного и профилактического питания. БАВ способны влиять на определенные функции организма, оказывая выраженное лечебно-профилактическое действие. Выпускаемые в настоящее время пищевой и фармацевтической промышленностью БАД к пище гепатотропного действия не учитывают комплекс нарушений, происходящих в организме при воспалительных заболеваниях печени и в основном направлены на коррекцию отдельных механизмов развития и прогрессирования заболевания.

Теоретическое обоснование и практическая реализация технологии создания БАД к пище, предполагающей синергетическое воздействие входящих в нее компонентов на комплекс основных негативных механизмов протекания гепатитов, является актуальной задачей, как в России, так и во всем мире.

Научные представления и практические основы в применении БАВ для создания функциональных продуктов питания, БАД к пище заложены в трудах Покровского А.А., Б.А. Шендерова, Рогова И.А., Титова Е.И., Токаева Э.С., Пилат Т.Л., Тутельяна В.А., Богатырева А.Н., Волгарева М.Н., Певзнера М.И., Уголева А.М. и др.

Цель диссертационной работы. Цель настоящей работы состоит в разработке БАД к пище для больных с воспалительными заболеваниями печени (гепатитами) и технологии ее производства.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Проанализировать, систематизировать, обобщить данные об основных нарушениях в организме, происходящих при воспалительных заболеваниях печени различного генеза и на их основе сформулировать медикобиологические (МБ) и технологические рекомендации к разрабатываемой БАД к пище.

2. Определить основные классы БАВ, положительно влияющих на функционирование органов и систем организма при воспалительных заболеваниях печени. Провести клиническое исследование аминокислотного спектра плазмы крови с целью определения места аминокислот с разветвленной боковой цепочкой (АРЦ) в проектировании композиции для больных с воспалительными заболеваниями печени. Сформулировать компонентный состав БАД.

3. Обосновать форму выпуска БАД и оценить применение методов гранулирования для получения готовой формы. Провести сравнительный анализ качественных характеристик образцов, полученных различными методами грануляции и с помощью методов математического моделирования определить рациональные технологические параметры производства.

микробиологических показателей БАД в процессе производства и хранения.

Обосновать сроки годности.

5. Разработать технологию производства БАД к пище, рекомендации по применению.

6. Оценить гепатопротекторную эффективность разрабатываемого продукта на лабораторных животных. Исследовать изменение микробиценоза кишечника при воспалительных заболеваниях печени.

7. Разработать проект научно-технической документации на продукт.

Научная новизна. Проанализированы и систематизированы данные об основных нарушениях, происходящих в организме при воспалительных заболеваниях печени (гепатитах), сформулированы МБ и технологические рекомендации к разрабатываемой БАД к пище.

В результате клинического эксперимента получены данные об аминокислотном спектре плазмы крови больных хроническим гепатитом.

Установлено влияние количества добавляемой гранулирующей жидкости на качественные характеристики готовой формы БАД. С помощью методов математического моделирования определены рациональные режимы производства БАД к пище для коррекции нарушений, происходящих в организме при воспалительных заболеваниях печени.

Определено влияние процесса производства и хранения на содержание перекисных соединений в БАД.

Выявлены гепатопротекторные свойства разработанной БАД в результате исследований на лабораторных животных.

Обнаружены негативные изменения в составе микрофлоры кишечника при исследовании модели повреждения печени у крыс. Установлено, что применение БАД поддерживало количественное равновесие представителей всех исследуемых групп микроорганизмов.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований создана БАД к пище для больных с воспалительными заболеваниями печени (гепатитами), разработана технология ее производства.

На основании проведенных клинических исследований предложены рекомендации по использованию АРЦ в качестве компонента специализированных продуктов и БАД к пище при гепатитах. Проведенные испытания разработанной БАД на лабораторных животных показали высокую его эффективность при алкогольном повреждении печени.

документации.

Техническая новизна предложенных решений отражена в заявке на патент № 2007145176 (049494) от 06.12.2007 «Биологически активная композиция для лечения и профилактики заболеваний печени».

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены в период 2004 – 2007 г.г. на Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2004), Восьмом Международном Конгрессе «Парентеральное и энтеральное питание» (Москва, 2004), Восьмом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология – 2005» (Пущино, 2005), Всероссийской научной молодежной конференции с международным участием «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов» (Улан-Удэ, 2006), Международном форуме «Фундаментальные и прикладные проблемы питания» (Санкт-Петербург, 2007), Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2007), Одиннадцатом Международном Конгрессе «Парентеральное и энтеральное питание» (Москва, 2007).

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 11 печатных работ и подана одна заявка на патент.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, содержащего источников, приложений.

Основная часть работы изложена на страницах машинописного текста, содержит таблиц, рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы и определены основные направления исследований диссертационной работы.

Глава 1. Обзор литературы. Проанализированы и систематизированы данные об основных механизмах развития и прогрессирования заболеваний вирусным, токсическим, лекарственным, алкогольным, аутоиммунным гепатитами, неалкогольным стеатогепатитом. Рассмотрено действие ряда классов БАВ на функционирование органов и систем организма при воспалительных заболеваниях печени. Исследован рынок БАД к пище, функциональных продуктов, применяемых для лечения и профилактики гепатитов.

Рассмотрены основные формы выпуска БАД к пище. Освещены современные способы гранулирования (принципы, аппаратурное оформление).

На основании анализа и обобщения информации литературного обзора сформулированы цель и задачи диссертационной работы.

Глава 2. Организация эксперимента, объекты и методы исследований.

Исследование проводили на кафедре Технология продуктов детского, функционального и спортивного питания», ПНИЛЭФМОПП, испытательном центре «Биотест» Московского государственного университета прикладной биотехнологии. Исследование аминокислотного спектра плазмы крови больных гепатитом в Гепатологическом центре, базирующемся в Городской клинической инфекционной больнице №1. Количественное определение аминокислот проводили в отделе хроматографического анализа НИИ физикохимической биологии им А.Н. Белозерского МГУ. Исследование на лабораторных животных по изучению эффективности БАД проводили в отделении экспериментальной патологии Московского городского НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. Биохимические исследования проводили в биохимической лаборатории Клиники питания Института питания РАМН.

Исследование морфологии печени в морфологической лаборатории Института питания РАМН.

Схема проведения исследований представлена на рис.1.

В работе использовали аминокислоты: валин, лейцин, изолейцин, аргинин производства компании «Ajinomoto» (Япония), фосфатидилхолин производства компании «Degussa» (Германия) и «Phospholipid» (Германия), гуммиарабик производства компании «CNI» (Франция), двунатриевая соль глицирризиновой кислоты производства компании «Shanghai Healthwell Chemical Co., ltd» (Китай).

Объектами исследований являлись вышеперечисленные вещества, экспериментальные образцы гранулята, полученные на лабораторном миксерегрануляторе Collette MicroGral, оборудованном системой, позволяющей осуществлять контроль за процессом по уровню потребления мощности (2), производства компании «Niro Pharma Systems» (США), а также диапазон вводимой гранулирующей жидкости.

Определяемые качественные характеристики исследуемых образцов гранулята: а) гранулометрический анализ с использованием системы анализа изображений «Leitz Tas Plus» (Германия) (3); б) насыпные характеристики (объемная насыпная плотность (4), насыпная плотность (5), сжимаемость (6) на лабораторной установке, согласно ГОСТ Р 51462-99; в) сыпучесть продукта с помощью специальной воронки, согласно ГОСТ Р 22567.12-82 (7); г) прочность гранул с использованием устройства ИПГ-1М по методике согласно ГОСТ 2156.2-82 (8); д) распадаемость согласно методике, описанной в Государственной фармакопее СССР (9). Определение суммарного количества перекисных соединений с использованием методики, описанной в ГОСТ Р 51487-99 (10), микробиологические показатели (11) – по ГОСТ 10444-94, ГОСТ 30518-97, ГОСТ Р 50480-93, ГОСТ 30726, ГОСТ 28805. Органолептические показатели (12) – по ГОСТ 29245, массовую долю влаги (13) – по ГОСТ 29246L-аминокислот (14) – по ГОСТ 23327-98, фосфолипидов (15), пищевых волокон (16), глицирризина (17) – по Р 4.1.1672-03.

Рис. 1. Схема проведения исследований Аминокислотный анализ проводили хроматографическим методом (1) на аминокислотном анализаторе модели 835 производства компании «Hitachi»

(Япония). При изучении эффективности БАД к пище были проведены эксперименты на белых лабораторных крысах-самцах линии «Вистар».

Биохимический анализ сыворотки крови проводили на установке Konelab 30i производства компании «Thermo electron» (США) с использованием стандартных наборов химических реагентов для определения биохимических показателей (аланиновой аминотрансферазы - АлТ (18), аспарагиновой аминотрансферазы - АсТ (19); щелочной фосфатазы - ЩФ (20), билирубина (21), общего белка (22), альбумина (23)).

Морфологическую оценку тканей печени проводили методом электронной микроскопии (24). Исследование микрофлоры кишечника определяли бактериологическим методом: бифидобактерии (25), лактобактерии (26), энтерококки (27), стафилококки (28), энтеробактерии (29), цитрат ассимилирующие бактерии (30), клостридии (31), гемолитические бактерии (32).

Исследования проводили в трехкратной повторности. Результаты исследований обрабатывали с помощью методов статистического анализа с определением среднего арифметического значения и средней квадратичной ошибки.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Обоснование состава продукта и подбор исходных компонентов.

Изучение литературных данных, описывающих процесс развития и прогрессирования воспалительных заболеваний печени различного генеза (алкогольных, лекарственных, аутоиммунных, вирусных гепатитов, стеатогепатитов) позволило выявить основные негативные изменения, происходящие в организме и сформулировать МБ рекомендации к продукту:

- антивирусное действие;

- стимулирование иммунитета;

- противовоспалительное действие;

- восстановление мембран гепатоцитов;

- купирование «оксидантного стресса»;

- инактивация процессов фиброгенеза и коллагенеза;

- уменьшение риска развития канцерогенеза;

- усиление дезинтоксикационной функции печени;

- устранение неблагоприятных последствий гепатитов – дисбиоза.

Обоснование выбора компонентов. Изучение эффективности применяемых в настоящее время продуктов для лечения и профилактики заболеваний печени, терапевтических свойств БАВ, а также сформулированные медико-биологические рекомендации, позволили определить основные классы БАВ, а также представителей этих классов имеющих лечебнопрофилактический потенциал (рис. 2).

Анализ исследований, проводимых в мире по оценке эффективности перечисленных БАВ, позволил определить оптимальный компонентный гепатотропного действия содержания АРЦ и ароматических пациентов с вирусными гепатитами B и С с целью включения АРЦ в композиционный состав БАД. По имеющимся данным при некоторых заболеваниях печени, прежде всего циррозе, происходит снижение активности окисления основных субстратов – источников энергии, и организм на 30-40% может удовлетворить потребности в энергии за счет окисления АРЦ в скелетных мышцах и в гладкомышечных клетках внутренних органов, что приводит к снижению их уровня в плазме крови. С другой стороны, на фоне заболевания печени, которая является основным местом метаболизма АА, в плазме крови увеличивается концентрация последних. Увеличение потока ААК в мозг приводит к угнетению центральной нервной системы и развитию печеночной энцефалопатии. Устранение дисбаланса АРЦ и ААК, способствует улучшению состояния больных с симптомами печеночной энцефалопатии, а также предотвращает ее развитие. АРЦ способны увеличить синтез белка в мышцах и печени, сократить его катаболизм, тем самым уменьшить отрицательный азотистый баланс. Для оценки соотношения АРЦ и ААК используют индекс Фишера (Иф) – отношение суммы АРЦ к сумме ААК. В норме Иф обычно составляет 2,8 – 3,5. При циррозах, после обширных резекций и трансплантации печени, по данным проведенных исследованияй, Иф может падать до 1, а применение комплекса АРЦ поднимает Иф до нормального уровня.

Исследование показало, что Иф практически всех пациентов находится в пределах границ нормы и при хронических гепатитах, не приведших к серьезным патологическим изменениям структуры печени, как фиброз, цирроз, включение комплекса АРЦ в состав продукта не является обязательным.

Рис. 3. Схема действия компонентов продукта при воспалительных заболеваниях печени 1 - включение в цикл образования мочевины, усиление детоксикационной функции печени; 2 - встраивание в структуру мембран поврежденных гепатоцитов, антиоксидантное действие, нормализация обмена липидов, белков и детоксикационной функции печени;

замедление разрастания соединительной ткани в печени при развитии ее цирроза; 3 - блокирование первых фаз репликации вируса, усиление выработки интерферона, увеличение активности Т-лимфоцитов и интерлейкина, противовоспалительный эффект, антиоксидантный эффект и антитоксическое действие, снижение риска развития фиброза и цирроза; 4 – пребиотическое действие, нормализация липидного обмена Определение суточной дозировки компонентов. Основываясь на исследованиях, связанных с изучением эффективности применения компонентов, входящих в состав разрабатываемой БАД, а также опираясь на уровни суточного потребления БАВ, рекомендуемые Институтом питания РАМН, позволили определить границы суточной дозировки для каждого компонента (табл.1).

Табл. 1. Суточная дозировка компонентов.

Обоснование формы выпуска БАД. Суточная дозировка предложенной композиции БАД составляет 15 грамм. Форма выпуска в виде таблеток или капсул не является удобной, т.к. суточное их количество для приема, исходя из максимальной массы таблеток или капсул (1 грамм), составляет 15 штук.

Оптимальной является форма выпуска продукта в виде гранул, упакованных в пакетики для разового приема (5г).

Глава 4. Исследование качественных характеристик полученного гранулята, обоснование рациональных методов и режимов производства БАД. Один из компонентов, входящих в состав предлагаемой БАД имеет сложные для гранулирования физические характеристики – полиненасыщенный фосфатидилхолин представляет собой продукт с мазеобразной консистенцией.

В работе, для получения готовой формы БАД, использован метод влажной грануляции, а также отталкиваясь от физических свойств фосфатидилхолина – метод горячей грануляции.

Получение БАД методом влажной грануляции.

Принципиальная схема проведения эксперимента:

измельчение до оптимальных размеров и перемешивание сухих компонентов грануляция на лабораторном грануляторе внесение гранулирующей жидкости (спиртового раствора фосфатидилхолина), грануляция с нагревом на лабораторном отработка оптимального увлажнения сухих грануляторе определение качественных характеристик гранул Исходя из суточных дозировок компонентов БАД сформулирована рецептура (табл. 3).

Табл. 3. Рецептура БАД Наименование компонента Исходный размер частиц смеси влияет на качественные характеристики готового гранулята (прочность, насыпная плотность и др.), поэтому перед процессом грануляции сухие компоненты смеси измельчались и перемешивались на ножевой мельнице. По данным исследований оптимальный размер частиц для грануляции лежит в пределах от 20 до мкм – при размерах частиц менее 10 мкм возникают сложности при увлажнении, процесс трудно контролировать, при размерах частиц более мкм полученные гранулы имеют низкую прочность. Размер частиц исходных компонентов для грануляции после измельчения контролировали с помощью системы анализа изображений Leitz Tass Plus.

Оптимальная степень увлажнения сухих компонентов смеси лежит в широких пределах и определяется экспериментально. Если увлажнителя мало – гранулы после сушки рассыпаются, если много – масса будет вязкой, липкой и трудногранулируемой. Вследствие специфических технологических характеристик фосфатидилхолина, в качестве увлажнителя решено использовать спирт и вводить в смесь в виде спиртового раствора фосфатидилхолина различных концентраций, для определения оптимальной степени увлажнения.

Для определения оптимальной степени увлажнения готовили растворы различных концентраций и объемов. Процентное содержание Табл. 4. Диапазон добавления гранулирующей жидкости.

спирта, Концентрация Грануляцию проводили при скорости гранулирующей жидкости. В этой фазе не наблюдается образование жидких мостиков между частицами и потребление мощности не изменяется. Во второй фазе начинается процесс образования гранул, образуются жидкие мостики между увлажняемыми частицами. Потребление мощности резко возрастает. Третья фаза характеризуется заполнением пустот между сухими частицами гранулирующей жидкостью, большая часть гранул сформирована.

Потребление мощности на этой фазе растет незначительно. В четвертой фазе процесс образования гранул завершен, потребление мощности в дальнейшем не изменяется. Данная закономерность применима для диапазона увлажнителя (спирта) от 10 до 16 % масс. смеси. При большем увлажнении потребление мощности резко падает, т.к. вместо гранул образуется суспензия.

После окончания процесса грануляции влажный гранулят выгружали из установки и сушили слоем в 1 см при температуре 30-35°С 2-3 часа в сушильном шкафу.

Рис. 4. Зависимость потребления мощности гранулятора от времени в ходе процесса влажного гранулирования.

Получение продукта методом горячей грануляции. В данном методе образование гранул происходит за счет включения в состав продукта компонента, изменяющего свои физические характеристики (снижение вязкости) при нагревании. Данный метод позволяет значительно сократить время получения продукта – не требуется сушка влажных гранул.

Связующим компонентом в данном методе выступает входящий в композиционный состав продукта фосфатидилхолин, вязкость которого изменяется с повышением температуры. Оптимальное количество связующего компонента в составе смеси составляет 10 – 30 % масс. смеси. В нашем случае количество его составляет 12% масс. смеси, поэтому процентное соотношение компонентов смеси изменять не представлялось необходимым. Измельчение и смешивание сухих компонентов проводили аналогично методу влажной грануляции. Размер частиц фосфатидилхолина изначально составлял 1 – 10 мм, после внесения в смесь и измельчения сопряженного с распределением по объему, размер составил 80 – 150 мкм.

Грануляцию проводили в емкости, снабженной тепловой рубашкой при температуре 80С при скорости импеллера 800 об/мин и скорости чоппера 1500 об/мин. Контролировали процесс аналогично методу влажной грануляции (обобщенная схема представлена на рис. 5).

Фаза 1 характеризуется нагревом смеси, потребление мощности постоянно или немного падает. При достижении определенной температуры вязкость связующего компонента начинает снижаться, потребление мощности резко возрастает. Данная фаза характеризуется ростом диаметра гранул, прочности. В начале фазы 2 потребление мощности падает, образование гранул завершено.

После окончания процесса гранулят охлаждали до комнатной температуры.

Образцы, полученные методом влажной и горячей грануляции, в дальнейшем исследовали по ряду качественных показателей.

Рис. 5. Зависимость потребления мощности гранулятора от времени в ходе процесса горячего гранулирования.

Полученные образцы гранулята сравнивали по ряду технологических характеристик: гранулометрический анализ, насыпная плотность, сыпучесть, прочность гранул, распадаемость гранул.

Сравнительный гранулометрический анализ образцов. Размер гранул и процентное распределение их по объему исследовали с помощью системы анализа изображения (рис. 6). Для образцов, полученных методом влажной грануляции, установлена закономерность с увеличением степени увлажнения смеси, увеличивается средний диаметр частиц. Однако эта закономерность лежит в определенных пределах. При увлажнении более % начинается формирование суспензии – гранул не образуется. Также отмечено, что увлажнение до 12 % масс.смеси характеризуется полидисперсностью размеров гранул, при увлажнении от 13 – 14 % замечен небольшой разброс диаметров гранул.

Образец, полученный методом горячей грануляции, характеризовался небольшим разбросом диаметров гранул по объему, средний размер диаметра частиц составлял примерно 1,4 мм.

Определение насыпных характеристик гранулята. Исследование проводили по методике, основанной на измерении объема вещества определенной массы, и изменении объема в результате уплотнения.

d частиц, мк м Рис. 6. Сравнительный гранулометрический анализ образцов, полученных методом горячей и влажной грануляции.

Исследование показало (табл. 5), что с увеличением количества добавляемой гранулирующей жидкости в результате использования метода влажной грануляции происходит увеличение компактности гранулята. Также полученные данные свидетельствуют о снижении сжимаемости (индекса Кара). Индекс Кара также используют для прогноза сыпучести– чем меньше сжимаемость, тем лучше сыпучесть.

Табл. 5. Изменение объемной насыпной плотности, насыпной плотности и сжимаемости экспериментальных образцов гранулята грануляция Влажная Горячая грануляция Определение сыпучести гранулята. Сыпучесть гранулированной формы БАД проводили по методике, основанной на сравнении времени истечения определенного объема экспериментального образца через специально изготовленную воронку со временем истечения такого же объема стандартного песка.

С увеличением увлажнения в результате использования метода влажной грануляции замечено уменьшение времени истечения образцов гранулята, что говорит об улучшении сыпучести. Полученные данные подтвердили прогноз индекса Кара.

Табл. 6. Изменение сыпучести, прочностных характеристик, распадаемости экспериментальных образцов гранулята.

грануляция грануляция Определение прочности гранул. Исследование проводили с помощью устройства ИПГ-1М. Исследование показало прямую зависимость статической прочности гранул от степени увлажнения – с ее увеличением повышалась прочность гранул (табл. 6).

Распадаемость гранул. Одной из важных характеристик готовой формы БАД в форме гранулята является распадаемость. Данная характеристика является одним из показателей дальнейшей усвояемости БАД. Определение распадаемости образцов проводили на лабораторном идентификаторе распадаемости. Лимит времени, установленный Государственной Фармакопеей для гранул составляет 15 мин.

В ходе исследования установлено, что время распадаемости гранул зависит от степени исходного увлажнения при их производстве чем выше степень увлажнения, тем больше время распадаемости. При степени увлажнения более 15% распадаемость гранулята не удовлетворяет лимиту времени. Время распадаемости образца, полученного методом горячей грануляции удовлетворяло лимиту времени и составляло 8,3 мин. (табл. 6).

Определение оптимальных режимов гранулирования методом математического моделирования. С целью отработки технологии и оптимизации режимов производства БАД проведен тщательный анализ различных математических моделей описывающих процесс грануляции:

линейной, логарифмическая, степенная, полиномиальной 2-го,3-го и 4-ого порядка. Проведенный анализ показал, что наилучшие модели, наиболее полно описывающие процесс смешивания являются полиномиальные модели 2-го и 3-го порядка, построенные с помощью метода наименьших квадратов:

- уравнение регрессии диаметра частиц гранулята:

- уравнение регрессии объемной насыпной плотности:

- уравнение регрессии насыпной плотности:

- уравнение регрессии сжимаемости:

- уравнение регрессии статической прочности:

- уравнение регрессии распадаемости:

где у – количество гранулирующей жидкости, R – достоверность аппроксимации.

Для определения рационального количества гранулирующей жидкости была решена многокритериальная задача с использованием метода нахождения Парето-оптимального решения с помощью наилучшей точки: по каждому из факторов выбиралось наилучшее значение, их совокупность составляла вектор т.н. наилучшую точку.

Вектор наилучших значений: x (1300,0.498,0.562,1.582,71.396,1.667,10.1222 ) Далее была составлена и минимизирована нижеприведенная формула:

[1300 (81.713y 2 - 1654.8y + 8861.4)] 2 [0.498 ( 0.11( y 13.378 ) 2 0.498 )] [0.562 (1.8412 - 0.3209y + 0.0273y 2 - 0.0008y 3 )] 2 [1.582 (1026.6 - 212.63y + 14.799y 2 - 0.3446y 3 )] [71.3996 ( 260.94 - 71.997y + 6.9774y 2 - 0.2014y 3 )] 2 [1.667 (-11.698 + 2.9505y - 0.2442y 2 + 0.007y 3 )] [10.122 (-62.654 + 18.119y - 1.6528y 2 + 0.0522y 3 )] Сравнение гранулята, полученного при добавлении 13 % гранулирующей жидкости, и гранулята, полученного горячим гранулированием производилось методом наименьших квадратов: сумма отклонений от «наилучшей точки» для горячего гранулирования численно равна 32880,14, а при 13 % гранулирующей жидкости всего 5286,73.

Глава 5. Изучение динамики изменения перекисного числа и микробиологических показателей БАД в процессе производства и хранения. Исследование показало, что в процессе производства БАД происходит незначительное увеличение суммарного количества перекисных соединений в результате окисления фосфатидилхолина. Причем в результате горячего гранулирования это увеличение более заметно.

Для выявления сроков и условий безопасного хранения разработанную БАД расфасовывали в пакетики для разового приема массой 5 г. Хранение осуществляли при температуре 18±30С и относительной влажности воздуха не более 75%.

БАД, расфасованную в пакетики, хранили в течение 15 месяцев (рис.

7). Показано, что перекисное число липидов, выделенных из БАД, по истечение 15 месяцев хранения, не превышает 5,8 ммоль О/кг в случае влажного гранулирования и 8,5 ммоль О/кг в случае горячего гранулирования, что соответствует требованиям СанПин 2.3.2.1078-01.

Рис. 7. Изменение перекисного числа липидов, выделенных из разработанного продукта в процессе хранения.

Следует отметить, что в разработанной БАД в процессе хранения бактерии группы кишечной палочки и патогенные микроорганизмы не обнаружены, а содержание мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов значительно ниже допустимой нормы.

Глава 6. Разработка технологии производства и рекомендаций к применению БАД к пище для коррекции нарушений, происходящих при гепатитах. На основании проведенных экспериментальных исследований по изучению влияния количества добавляемой гранулирующей жидкости на технологические и качественные свойства готового формы БАД, отработки рациональных режимов грануляции, определения влияния процесса производства и хранения на суммарное содержание перекисных соединений и микробиологических показателей разработана схема технологического процесса производства БАД к пище для коррекции нарушений, происходящих при воспалительных заболеваниях печени (рис. 8).

Основные показатели качества и безопасности БАД. Определены основные микробиологические, физико-химические показатели, показатели окислительной порчи разработанной БАД непосредственно после производства и по истечение 15 месяцев хранения (табл. 7,8).

На основании сформулированных медико-биологических рекомендаций к БАД к пище для коррекции нарушений, происходящих в организме при гепатитах, определения компонентного состава, а также отработанной технологической схемы производства и проведенных исследований был разработан проект технической документации.

Рекомендации к применению. БАД к пище как источник аминокислот, фосфолипидов, пищевых волокон и гликозидов в комплексе лечебнопрофилактических мер при гепатитах различной этиологии (алкогольный, токсический, лекарственный, вирусный, неалкогольный стеатогепатит, аутоиммунный). Применять по одному пакетику (5 г) три раза в день во время еды с небольшим количеством воды.

Рис. 8. Технологическая схема производства Табл. 7. Показатели микробиологической обсемененности и окислительной порчи.

КМАФАнМ (колиформы) Патогенные, в т.ч. не допускаются в 10, Дрожжи и плесени не более 100 КОЕ/г Табл. 8. Основные физико-химические показатели БАД.

Массовая доля L-аминокислот, % не менее Массовая доля фосфолипидов, % не менее Массовая доля глицирризина, % не менее Массовая доля пищевых волокон, % не менее Глава 7. Исследование терапевтической эффективности разработанной БАД. Этаноловое повреждение печени у крыс вызывали путем интрагастрального зондового введения этанола в дозе 7 мл 40% раствора на кг массы тела 1 раз в сутки в течение 21 дня. Животные были разделены на группы: опытная – на фоне введения алкоголя крысы получали экспериментальный продукт из расчета 215 мг на 1 кг веса в виде 30% раствора через зонд, контрольная получала через зонд физиологический раствор. Сравнительный анализ осуществлялся по отношению к группе здоровых животных на основании изучения биохимических показателей сыворотки крови, морфологического состояния печени, а также анализа микрофлоры слепой кишки. Биологический материал был взят для исследования на 22 день с начала эксперимента в результате забоя животных декапитацией.

Биохимический анализ сыворотки крови. Определяемыми индикаторами цитолитического синдрома (ЦС), при котором наблюдается повреждение клеток печени, в первую очередь цитоплазмы, также органоидов клетки с выраженным нарушением проницаемости мембран, явились аланиновая (АЛТ) и аспарагиновая (АсТ) аминотрансферазы.

По данным исследований АлТ, АсТ (рис. 9) у крыс контрольной группы замечено явное повышение концентрации ферментов в сыворотке крови по отношению к здоровым крысам, что свидетельствует о наличии цитолитического синдрома. На фоне приема продукта повышение концентрации ферментов незначительное.

Замечено снижение концентрации общего белка и альбуминов в сыворотке крови контрольной группы, что свидетельствует о нарушении белковосинтетической функции печени. На фоне приема БАД содержание белка оставалось в пределах нормы (рис. 10).

Биохимическое исследование показало, что показатели ЦС, белковосинтетической функции печени у контрольной группы изменились по сравнению с показателями здоровых крыс. Прием БАД на фоне потребления этанола сдерживал колебания концентрации ферментов и содержания белка.

нмоль/(с л) г/л Рис. 10. Содержание общего белка и альбуминов в сыворотке крови.

Морфологическое исследование печени. Прием раствора этанола у крыс вызывал существенные изменения структуры гепатоцитов. В отличие от гепатоцитов здоровых животных, у крыс, получавших алкоголь, отмечали увеличение объема гепатоцитов, изменение их структуры: увеличивалась площадь эндоплазматического ретикулума, в котором локализованы ферментные системы, участвующие в метаболизме алкоголя; увеличивался объем и форма митохондрий, они становились крупнее и часто приобретали округлую форму; увеличивалась степень вакуолизации цитоплазмы гепатоцитов преимущественно в перипортальной зоне печеночной балки, где находились гепатоциты, завершающие свой жизненный цикл (признаки «баллонной дистрофии»); в печени возрастало число «темных клеток», которые можно отнести к атипичным, не до конца дифференцированным гепатоцитам. На фоне приема экспериментального продукта у крыс опытной группы сохранялась высокая функциональная активность печени на фоне уменьшения повреждения гепатоцитов (набухания плазмы и вакуолизации), нормализации микроциркуляции в печени.

Микробиологическое исследование слепой кишки. После периода приема раствора этанола кишечная микрофлора крыс контрольной группы характеризовалась патологическим состоянием. Прежде всего, это проявлялось в снижении количества бифидобактерий, лактобактерий.

Содержание бифидо- и лактобактерий составляло в среднем lg(6,75±0,5) и lg(6,427±0,5984), что на два три порядка ниже, чем у крыс здоровых и опытных групп (рис. 11). Бифидо- и лактофлора слепой кишки крыс опытной Содержание энтерококков (фекальные стрептококки) снизилось у крыс контрольной группы, а у опытной группы их количество соответствовало физиологической норме. Вероятно, снижение энтерококков связано с увеличением других аэробных представителей микробиоценоза, в частности резким увеличением энтеробактерий. Стафилококковая флора не реагировала lg КОЕ/г энтеробактерий, цитрат ассимилирующих, гемолитических бактерий и клостридий (рис. 13). Следует отметить, что качественные изменения микроорганизмов с измененными биологическими свойствами. Дисбаланс качественного и количественного состава энтеробактерий выражался в увеличении доли лактозонегативных или цитрат ассимилирующих вариантов (60-70% от общего числа), т.е. полноценные бактерии группы кишечной палочки замещались бактериями родов Klebsiella, Citrobacter, Proteus и т.д (остаточная флора). У крыс опытной группы количество энтеробактерий не увеличивалось, а остаточная флора обнаруживалась в незначительных Гемолитические бактерии у контрольной группы обнаруживались в количестве lg(7,195±1,698), что в сравнении с опытной группой lg(2,51±2,778) - в несколько десятков раз больше. Также у этой группы крыс наблюдалось повышенное содержание клостридий. Уровень содержания клостридий не изменился в кишечнике крыс опытной группы.

lg КОЕ/г lg КОЕ/г Рис. 13. Количество клеток энтеробактерий, ЦА, гемолитических Таким образом, результаты бактериологических исследований показали, что введение раствора этанола крысам в течение 22 дней привело к явному негативному сдвигу качественных и количественных показателей микрофлоры кишечника у контрольной группы, также отмечено корригирующее действие исследуемой БАД на микробиоценоз слепой кишки животных, что заключается в поддержании количественного равновесия представителей всех исследуемых групп микроорганизмов, а, прежде всего, содержания лакто- и бифидобактерий.

Основываясь на результатах биохимических, морфологических и бактериологических исследованиях можно сделать вывод о высокой эффективности исследуемого продукта на фоне создания модели алкогольного повреждения печени у крыс.

ВЫВОДЫ

1. Проанализированы, систематизированы, обобщены данные об основных патогенетических нарушениях в организме, происходящих при гепатитах технологические рекомендации к БАД к пище для больных гепатитами.

2. На основании теоретических исследований обоснован компонентный состав БАД, включающей аргинин, фосфатидилхолин, гуммиарабик, глицирризин.

3. Установлено состояние аминокислотного спектра плазмы крови больных хроническими вирусными гепатитами.

4. Проведен сравнительный анализ технологических и качественных характеристик образцов готового продукта, полученных методом влажной грануляции, определено влияние количества добавляемой гранулирующей жидкости на конечные характеристики гранулята. С помощью методов математического моделирования обоснована и определена оптимальная степень увлажнения при влажном гранулировании, равная 13% масс.смеси.

Проведен анализ качественных характеристик образцов, полученных методом горячей грануляции в сравнении с методом влажного гранулирования.

5. Определено влияние процесса производства и хранения на содержание перекисных соединений в продукте. Установлено, что суммарное количество перекисных соединений в результате хранения в течение 15 мес. для продукта, полученного методом влажной грануляции составляет 5,8 ммоль О/кг и 8,5 ммоль О/кг. Установлено, что в процессе всего срока хранения бактерии группы кишечной палочки и патогенные микроорганизмы не обнаружены, а содержание мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов значительно ниже допустимой нормы.

6. Разработана технология производства БАД к пище для больных с заболеваниями печени методом влажного и горячего гранулирования.

7. Выявлены гепатопротекторные свойства разработанного продукта в результате исследований на лабораторных животных – снижение активности цитолитического синдрома, корригирующее действие на белковосинтетическую функцию печени, защитное действие на ткань печени.

8. В результате исследования модели алкогольного повреждения печени у крыс установлены негативные изменения в составе микрофлоры кишечника.

В результате применения продукта поддерживалось количественное равновесие представителей всех исследуемых групп микроорганизмов, а, прежде всего, содержание лакто- и бифидобактерий.

9. По результатам проведенных исследований разработан проект научнотехнической документации. На композиционный состав и технологию получения разработанного продукта подана заявка на патент № (049494) от 06.12.2007 «Биологическая композиция для лечения и профилактики заболеваний печени».

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Токаев Э.С. Биологически активные вещества, используемые для лечения и профилактики заболеваний печени / Э.С. Токаев, Н.П.

Блохина, Е.А. Некрасов // Вопросы питания. – 2007. – №.4. – С. 4-9.

2. Некрасов Е.А. Роль фосфолипидов в питании людей с заболеваниями печени / Е.А. Некрасов // Материалы Международного форума «Фундаментальные и прикладные проблемы питания», – Санкт-Петербург 2007. – С. 45-46.

3. Некрасов Е.А. Исследование влияния комплекса аминокислот с разветвленной боковой цепочкой и аргинина на спектр свободных аминокислот в плазме крови и функциональное состояние печени при хроническом вирусном гепатите / Е.А. Некрасов // Материалы Всероссийской научной молодежной конференции с международным участием «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов», – Улан-Уде 2006. – С. 6-7.

4. Токаев Э.С. Возможность использования глицирризина в терапии гепатитов различной этиологии / Э.С. Токаев, Е.А. Некрасов // Материалы научно-практической конференции восьмого международного семинарапрезентации «Биотехнология-2005», Пущино 2005. – С. 50-52.

5. Токаев Э.С. Подходы к метаболической терапии гепатитов / Э.С. Токаев, Е.А. Некрасов // Материалы III Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва 2004. – С. 65-66.

6. Токаев Э.С. Краткое обобщение использования «Гепамина» в клинической практике / Э.С. Токаев, Е.А. Некрасов / Тезисы докладов восьмого международного конгресса «Парентеральное и энтеральное питание», – Москва 2004. – С. 61.

7. Токаев Э.С. Определение пищевых волокон и консервантов в продуктах питания / Э.С. Токаев, С.Б. Юдина, Е.А. Некрасов // Методические указания к лабораторным работам. – Москва, МГУПБ. – 2004. – 17 с.

8. Токаев Э.С. Оценка исследования эффективности гепатопротектора, содержащего гуммиарабик, на функциональные нарушения ЖКТ у крыс в результате алкогольного повреждения печени / Э.С. Токаев, Т.С Попова, Е.А.

Некрасов, Ю.А. Лысиков, Г.И. Соловьева, А.С. Багдасарян / Тезисы докладов одиннадцатого международного конгресса «Парентеральное и энтеральное питание», – Москва 2007. – С. 87-88.

9. Токаев Э.С. Оценка эффективности использования гепатопротектора в коррекции алкогольного повреждения печени у крыс / Э.С. Токаев, Т.С Попова, Е.А. Некрасов, Ю.А. Лысиков, Г.И. Соловьева / Тезисы докладов одиннадцатого международного конгресса «Парентеральное и энтеральное питание», – Москва 2007. – С. 88-89.

10. Некрасов Е.А. Применение технологии горячего гранулирования в производстве БАД к пище / Е.А. Некрасов // Материалы VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва 2007. – С. 90-92.

11. Токаев Э.С. Физиологически функциональные ингредиенты гепатопротекторного действия / Э.С. Токаев, Е.А. Некрасов // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. – 2007. – №.2. – С. 58-59.

12. Заявка на патент № 2007145176 (049494) от 06.12.2007 ФИПС РФ.

Биологическая композиция для лечения и профилактики заболеваний печени.

Тираж 100 экз. Заказ ООО «Полисувенир». 109316, Москва, ул. Талалихина, Тел. 677-03-