На правах рукописи

Медведева Анна Александровна

ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ РАННЕГО РАЗВИТИЯ НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ

ПРИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ В ОПТИЧЕСКОМ ДИАПАЗОНЕ

ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

03.00.30 – биология развития, эмбриология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук Бурлаков Александр Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна (РГМУ) доктор биологических наук, профессор Козлов Юрий Павлович (РУДН)

Ведущая организация:

ФЕДЕРАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

БИОФИЗИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

Защита диссертации состоится 22 апреля 2008 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, Биологический факультет, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова Автореферат разослан 21 апреля 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат биологических наук Калистратова Елена Николаевна Актуальность темы Одним из отражений химических энергетических процессов, происходящих в клетках, является сверхслабое излучение (ССИ), присущее всем биологическим системам. Еще в 1923 году А.Г. Гурвич сообщил об обнаруженном им очень слабом «ультрафиолетовом излучении, сопровождающем экзотермические химические реакции, идущие как в различных живых тканях, так и in vitro». По концепции А.Г. Гурвича и его последователей, излучение представляет собой специфический фактор, стимулирующий митозы, поэтому оно получило название митогенетического (Гурвич, Гурвич, 1945). В работах А.Г. Гурвича и сотрудников впервые было показано дистантное, бесконтактное нехимическое влияние живых организмов друг на друга. Затем Ж. и М. Магру (Magrou et al, 1931; Magrou, 1932) показали, что дистантные воздействия бактериальных культур (стафилококк, Bact. tumefaciens) и молочнокислых ферментов на половые продукты и на оплодотворенные яйцеклетки морских ежей угнетали их последующее развитие и способствовали появлению аномалий, в то время, как при дистантном взаимодействии бактериальных культур с эмбрионами комаров наблюдали, наоборот, эффект положительной биокоррекции – ускорение вылупления личинок комаров (Magrou еt al, 1931).

В настоящее время наличие дистантных взаимодействий убедительно продемонстрировано на клеточных и органных культурах животных (Казначеев и др, 1981; Казначеев, Михайлова,1981; Молчанов, 1985; Moltchanov, Golantzev, 1995), на растительных тканях (семена, почки, листья, древесная кора) (Кузин и др.,1994; Кузин, 1997, 2002; Будоговский, 2004; Бурлаков и др.,2008), на насекомых (Бурлаков и др., 2008), на свежесрезанной шерсти животных, на волосах и крови человека (Voeikov, Novikov, 1997; Xun Shen et al., 1999; Кузин, 2002), у бактерий (Николаев, 1992; Wainwright et al., 1997;

Nikolaev, 2000; Trushin, 2003; Nikolaev et al.,2006), на эмбрионах низших позвоночных (Бурлаков и др.,1999, 2000, 2005; Доронина и др.,2002; Burlakov, 2000; Бурлакова и др., 2000, 2001,2002; Володяев, Белоусов, 2007 и др.).

Исследование дистантных не химических влияний живых организмов друг на друга, основанных на их способности излучать и реагировать на сверхслабые излучения в оптическом диапазоне, в настоящее время вступило в новую фазу, поскольку появляется возможность объективной приборной регистрации биоизлучений. В последнее десятилетие сверхслабые излучения разной длины волны от биологических объектов разного уровня организации были непосредственно зарегистрированы с помощью фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) (Moltchanov et al, 1995; Novikov et al, 1995; Xun Shen et al, 1995; Белоусов и др., 1997,2000,2002,2003; Burlakov, 2000; Орел и Дзятковская, 2000; Beloussov, 2002, 2006; Orel et al., 2004; Белоусов, Володяев,2006;

Загускин, 2007; Володяев, Белоусов, 2007 и др.). Излучение биообъектов биофотонная эмиссия, по ряду признаков, обладает особыми квантовыми свойствами: высокой степенью когерентности, свойствами т.н. “сжатого света” и др. (Popp, Ke-hsuch, 1993; Белоусов и др.,1997; Bajpai, 1999; Popp et al., 2002;

Popp, 2006 и др.).

Выявлена непосредственная связь интенсивности сверхслабых излучений с биологической реакцией взаимодействующих объектов. Показано, что изменение физиологической активности (секреция в культуре молочной железы после гормональной стимуляции) сопровождается увеличением интенсивности сверхслабого свечения, что в свою очередь стимулирует физиологическую активность дистантно взаимодействующей с ней интактной культуры (Moltchanov, Golantzev, 1995). С другой стороны, анализ частотноамплитудных характеристик сверхслабого излучения эмбрионов вьюна показал их изменения при дистантных взаимодействиях (Белоусов и др.,2002,2003).

Большинство исследователей (Молчанов, 1985; Кузин и др., 1987; Popp, Kehsuch, 1993; Кузин, 1997, 2002; Будоговский, 2004; Бурлаков и др., 1999, 2002, 2003; Moltchanov, Golantzev, 1995; Voeikov, Novikov, 1997; Белоусов и др., 1997;

Bajpai, 1999; Popp et al., 2002; Popp, 2006 и др.) предполагают электромагнитную природу эффекта; Ю.А. Николаев (1992) допускает участие акустических волн.

Однако, возможности приборов позволяют вычленять только определенный измеряемый параметр излучения, тогда как биоиндикация охватывает весь информационный спектр. До настоящего времени механизмы дистантного взаимодействия остаются неизвестными. Электромагнитное излучение от большинства биологических объектов имеет очень низкую интенсивность. По оценке Ф.-А. Поппа (Popp, 1992), мощность электромагнитного взаимодействия биологических объектов лежит в диапазоне 10-17—10-15 Вт (эквивалентно ~100—103 квант/сек в диапазоне ближний УФ — ближний ИК).

Как столь слабый сигнал может оказывать специфическое действие (стимуляцию клеточных делений или физиологических функций, изменение скорости развития и появление аномалий развития) остается дискуссионным вопросом. Не смотря на это, феномен сверхслабого излучения биологических объектов, с одной стороны, а также его участия в регуляции процессов жизнедеятельности, с другой стороны, в настоящее время все больше привлекает исследователей, переводя изучение самоорганизации биологических систем на новый уровень.

оптического взаимодействия эмбрионов низших позвоночных и его проявление при изменении оптических характеристик среды.

Задачи, связанные с решением поставленной цели:

Анализ параметров эмбрионального развития зародышей низших позвоночных после их взаимодействия в оптическом диапазоне:

а) изменение скорости развития б) процент погибших и аномально развивающихся зародышей Оценить интенсивность свободно-радикальных реакций в эмбрионах вьюна Misgurnus fossilis в процессе оптического взаимовлияния Исследовать эффект дистантного взаимодействия при изменении оптических параметров среды между взаимодействующими объектами с помощью:

а) интерференционных светофильтров б) прецизионных оптических систем (призменные уголковые световозвращатели) Проследить отдаленные последствия 24-х часового оптического контакта зародышей вьюна по:

а) динамике вылупления, темпам роста предличинок и личинок б) темпам становления основных звеньев репродуктивной системы (гипофиз, гонада) Оптический контакт групп эмбрионов низших позвоночных может оказывать влияние на их дальнейшее развитие.

Научная новизна и практическая значимость работы Показано, что оптический контакт групп разновозрастных зародышей низших позвоночных (Misgurnus fossilis и Xenopus laevis) может приводить к изменению темпа развития, процента эмбриональной смертности и появлению аномально развивающихся особей в группе. Наблюдаемые эффекты стадиоспецифичны. Последствия 24-х часовых оптических взаимовлияний сохраняются на протяжении последующего онтогенеза, что прослежено по изменению темпов вылупления, роста и становления основных звеньев репродуктивной системы (гипофиза и гонады). Впервые показано достоверное изменение интенсивности свободно-радикальных реакций в эмбрионах вьюна в процессе оптического контакта. При изменении оптических характеристик среды, через которую взаимодействуют группы эмбрионов, с помощью интерференционных светофильтров с максимумами пропускания в дальнем УФ (372 нм, 379 нм) и сине-зеленой ( 546 нм) областях спектра наблюдается замедление темпов развития зародышей, а ускорение развития - в ближнем УФ (386 нм), фиолетовом (401 нм, 405 нм), красном (628 нм) и ИК (1000 нм) диапазонах. Благодаря биологическому тестированию, основанному на оптическом взаимодействии групп одновозрастных эмбрионов вьюна, удалось выявить наличие пространственной анизотропии призменных уголковых световозвращателей, используемых для оснащения ретрорефлекторных систем космических аппаратов. Установлено, что они оказывают влияние на эффект оптического взаимодействия групп одновозрастных зародышей низших позвоночных в соответствии с их оптическими характеристиками.

Основные положения диссертации были доложены на Международном форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, Россия, 2004);

III Международной конференции «Электромагнитные излучения в биологии»

(Калуга, Россия, 2005); Международной конференции «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных» (Саранск, Россия, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Россия, 2005);

Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, Россия, 2006); XIV, XV научных семинарах МГУ имени М.В. Ломоносова - Система «Планета Земля» (Москва, Россия, 2006, 2007); 8th EMBL International Predoc Symposium «Biology of disease» (Heidelberg, Germany, 2006); The Geilo NATO ASI School «Evolution from Cellular to Social Scales» (Geilo, Norway, 2007), IX Международной конф.

“Оптические методы исследования потоков” (Москва, 2007); 2-ой научн. конф.

с участием стран СНГ “Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов” (Петрозаводск, Россия, 2007).

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ. Из них 2 - в рецензируемых журналах, 8 – в материалах международных конференций, 3 тезисов.

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», «Приложение». В рукописи приведены иллюстраций, 2 таблицы. Список цитированной литературы содержит 154 источника.

В данной главе рассматривается современное представление о феномене оптического взаимовлияния биологических систем разного уровня организации. Данные приведены в 4 разделах: сверхслабое излучение биологических объектов, феномен дистантного взаимодействия объектов разного уровня организации, роль свободно-радикальных процессов в биологических системах, чувствительность зародышей в критические периоды эмбриогенеза.

Глава II Материалы и методы исследования Работа выполнена на вьюне Misgurnus fossilis L. (Cobitidae, Cypriniformes, Teleostei, Pisces), толстолобике Hypophthalmichthys molitrix Val. (Cyprinidae, Cypriniformes, Teleostei, Pisces) и шпорцевой лягушке Хenopus laevis Daudin (Pipidae, Salientia, Amphibia). Икру получали стандартным методом гормональной стимуляции (Костомарова, 1975). Оплодотворение яйцеклеток осуществляли сухим способом. Инкубацию эмбрионов вьюна производили при температуре 17,8 Со, шпорцевой лягушки – при 22-23Со, толстолобика – при 28Со в термостате ТСО 1/80 СПУ.

Эксперименты по оптическому взаимодействию зародышей низших позвоночных проводили по разработанной схеме (Бурлаков и др., 1999). В полузакрытые кварцевые кюветы 10х10х40 мм наполовину заполненные водой, помещали по 50 зародышей определенной стадии развития, кюветы для оптического контакта ставили строго одну на другую (рис. 1). Контрольные группы зародышей соответствующих стадий содержали в отдельно стоявших кюветах (рис. 1 а, е). Группы кювет экранировали друг от друга черной фотобумагой. Дополнительными контролями служили группы, оптически совмещенные с кюветами без биологического объекта (рис. 1 б, в, г, д). Для экранирования от возможных внешних электромагнитных воздействий на протяжении всего эксперимента 20-24 часа [предварительно выявленное оптимальное время (Burlakov, 2000)] кюветы помещали в закрытый металлический контейнер.

Рис. 1 Схема эксперимента по оптическому взаимодействию зародышей низших позвоночных.

Контроль: а, е - группы зародышей, развивающиеся в отдельно стоящих кюветах;

б, в, г, д - совмещенные с кюветами без биологического объекта.

Опыт: оптическое взаимодействие зародышей при расположении «старших»

групп над (А) и под (Б) кюветами с «младшими».

«Младшая» возрастная группа «Старшая» возрастная группа По окончании эксперимента каждую группу зародышей из кювет переносили в отдельные чашки Петри и с помощью Рис. 2 Прохождение бинокулярного микроскопа МБС-9 определяли: (1) стадии световых лучей через развития зародышей; (2) число погибших эмбрионов; (3) УСВ при переносе число аномально развивающихся эмбрионов. Для изображения.

определения стадий развития зародышей использовали таблицы нормального развития вьюна (Костомарова, 1975).

Определение интенсивности свободно-радикальных реакций в системе целого организма осуществляли методом привитой сополимеризации (Козлов, 1970), модифицированного для эмбриональных объектов (рыбы, амфибии) (Мелехова, 1976) и сцинтилляционной радиометрии.

Исследование эффектов оптического контакта при помещении в оптические каналы волнового взаимодействия интерференционных светофильтров (ИС) с максимумами пропускания: нм, 379 нм, 386 нм, 401 нм, 405 нм, 455 нм, 482 нм, 546 нм, 628 нм, 1000 нм, светофильтры помещали между кюветами с зародышами.

Исследование эффектов оптического контакта при помещении в оптические каналы волнового взаимодействия призменных уголковых световозвращателей (УСВ). УСВ представляет собой систему из трех взаимноперпендикулярных зеркал, используется в практической космонавтике для оснащения ретрорефлекторных систем космических аппаратов. С его помощью осуществляется параллельный перенос падающего на него излучения (рис. 2), при этом фронты падающих и отраженных световых волн параллельны (в отличие от зеркал, где это условие соблюдается только при нормальном падении). Сечение волнового фронта, падающего на входную грань УСВ, делится его ребрами и их изображениями на шесть секторов.

При падении волны на какой-либо сектор реализуется одна из шести последовательностей отражения ее от каждой из трех граней. При отражении от УСВ S-составляющей в секторах 1 и 4 нарушается баланс фаз относительно отраженной волны в секторах 2, 3, 5, 6, где он одинаковый (рис. 3а). Скачек фазы Р-компоненты отраженной волны для парных секторов 2 и 3, 1 и 4, 5 и показан на рис. 3б.

Экспериментальные группы эмбрионов располагались на расстоянии 1 см от УСВ так, чтобы они могли оптически контактировать между собой только через УСВ, и изображение одной группы строго проецировалось на другую (рис. 4). Контролем служили эмбрионы из тех же кладок, содержавшиеся в аналогичных условиях в кюветах, изолированных друг от друга, дополнительным контролем - соответствующие группы зародышей в кварцевых кюветах, размещенных непосредственно одна на другой (прямой оптический контакт групп зародышей). В дополнительной серии экспериментов группа зародышей оптически совмещалась через УСВ с кюветой без биологического объекта.

Для анализа отсроченного эффекта 24-х часового оптического контакта исследовали динамику выклева, сравнение линейных размеров тела и скорости становления основных звеньев репродуктивной системы (гипофиза и гонады). Объекты фиксировали в жидкости Буэна и после стандартной бутанольной проводки заливали в парафин. Фронтальные и сагиттальные срезы толщиной 5 мкм, изготовленные на микротоме Microm HM 440E, окрашивали реактивом Шиффа (РАS-реакция), паралъдегид-фуксином по Гомори-Габу с докраской азановым методом по Гейденгайну, железным гематоксилином по Гейденгайну. Основные типы тропоцитов гипофиза вьюна идентифицировали на основании топографических, гистохимических и гистофизиологических критериев, полученных нами предварительно на толстолобике. Для этого проанализировано особей вьюна и 130 особей толстолобика. Фотографирование препаратов производили на микроскопе Biosonic Leica DMLS.

Все эксперименты проводили в 5-15 кратной повторности, всего проанализировано 150000 эмбрионов вьюна, 1700 эмбрионов шпорцевой лягушки. Полученные результаты подвергали статистической обработке. Для выявления различий использовали t-критерий Стьюдента, критерий Пирсона Рис. 4 Схема постановки распределений и критерий Пирсона опытов по влиянию УСВ на для сравнения двух альтернативных эффект оптического контакта распределений.

зародышей низших позвоночных 3. 1. 1. Оптическое взаимодействие (ОВ) эмбрионов низших позвоночных. Анализ морфологических эффектов.

Темп развития 1.) при небольшой разнице в возрасте в результате оптического контакта эмбрионов на стадиях 1, 2, 3 (начало дробления) с зародышами на стадии (15 мин после оплодотворения) наблюдали взаимное ускорение/замедление темпов развития (эффект проявляется в смещении максимумов распределения по стадиям эмбрионов в группе к моменту завершения оптического контакта);

синхронизацию/десинхронизацию развития (оценкой служат дисперсии бинормального распределения эмбрионов по стадиям в группе к моменту завершения оптического контакта) в «старших» и «младших» группах.

Проявление того или иного эффекта обусловлено природным «качеством»

подопытного материала. В соответствии с существующими в рыбоводстве стандартами выделяют три категории качества икры: I (>60% оплодотворения), II (60-30% оплодотворения) и III (10 стадия).

Показано, что степень достоверности результатов зависит от природного качества икры, определяемого % оплодотворения и вылупления. Высоко достоверные результаты получали в опытах с икрой I, II категории.

Обратный эффект (коррекцию эмбриональной смертности) (р0,001) с 50% до 30-20% наблюдали при ОВ эмбрионов этих же стадий, полученных из икры III категории (для эксперимента в «старшую» отбирали живых, нормально развивающихся особей). Таким образом, однородность эмбрионов в каждой группе, их синхронизированное развитие важно для проявления эффекта дистантного взаимовлияния.

3. 1. 2. Интенсивность свободно-радикальных реакций в ранних зародышах вьюна в процессе оптического взаимодействия.

Для исследования эффекта ОВ зародышей вьюна на самых ранних сроках, когда морфологические изменения еще не выражены, был проведен анализ интенсивности свободно-радикальных реакций, [метод привитой сополимеризации (Козлов, 1970; Мелехова, 1976) и радиометрии], как показателя общего физиологического состояния (Воейков, 2003; Мелехова, биологических систем к слабым и Рис. Изменение относительных сверхслабым воздействиям (Мелехова и показателей УСР (dpm опыт/dpm др., 1999, 2001, 2004, 2005; Новиков, контроль) (M±m) через 2,5 часа после 2004). Показано достоверное изменение начала оптического взаимодействия уровня свободно-радикальных реакций зародышей 6 и 0 стадий (а); 28 и (УСР) в эмбрионах при оптическом стадий (б).

зависимости от сочетаемых стадий, показателей УСР. Так, через 2,5 часа после оплодотворения) и 6 (ранняя бластула) стадий развития наблюдали сравнению с контролем, в «старшей» «младшей» группе – в 1,5 раза (р0,01).

При совмещении эмбрионов 0 (15 мин.

после оплодотворения) и 28 (появление 13ой пары сомитов) стадий к 2, часам взаимовлияния показатель УСР увеличивается в 2,5 раза - в «старшей»

(р0,001) и в 2,6 раз (р0,001) - в «младшей» группах. Изменение проиллюстрировано на рисунке 7.

Различия эффектов ОВ групп зародышей при сочетании разных стадий могут быть связаны с разницей физиологического состояния детекторов и индукторов ССИ (6 стадия - период начала бластуляции, характеризующийся запуском работы собственного генома организма, и 28 стадия - сомитогенез).

Стадиоспецифичность эффектов ОВ зародышей вьюна, отмеченная по ряду морфологических признаков ранее (Бурлаков и др., 1999, 2000), проявляется, в данном случае, на уровне свободно-радикальных процессов.

Анализируя следующие параметры развития при ОВ: темпы эмбриогенеза, смертность, количество и специфика аномалий, необходимо отметить, что четкой корреляции между увеличением / уменьшением УСР и конкретным проявлением того или иного эффекта не обнаружено. Это связано с тем, что показатель УСР отражает интегральную скорость окислительного метаболизма клеток, изменение которого сопровождает целый ряд процессов как становления, так и дезорганизации биологических систем.

Динамика УСР в процессе оптического контакта эмбрионов 5 и 0 стадий В первые 4 часа ОВ отмечено достоверное снижение показателей УСР в «старшей» (р0,01) и «младшей» (р0,001) группах. Через 9-15 часов взаимодействия показатели УСР в опытных «старших» и «младших»

группах эмбрионов превышают таковые в контроле вплоть до окончания ОВ (табл. 1).

Табл. 1 Показатели УСР (M±m) в зародышах Misgurnus fossilis в процессе 24х часового оптического взаимодействия, находящихся в начале эксперимента на стадиях 5 (морула) -«старшая» группа и 0 (15 мин. после оплодотворения )- «младшая» группа.

ЭкспериментальDPМ в разные интервалы времени оптического контакта, ть различий ные группы зародышей опыт (верх) 371,9±12,9 * 464,1± 14,2** 521,6±15,3 *** 442,5±16,6 ** 447,8±17,7 ** - 0,01; *** опыт (низ) 452,7±18,2 461,2±14,9** 452,6±13 * 562,3±15 *** 476,8±14,9 ** Контроль 418,8±13,3 408,3±17,4 396,6±22,2 379,5±16,7 417,7±14,1Сравнител «Младшие»

опыт (верх) 306,5±12,1 *** 328,8±14,9 339,1±15,6 * 442,5±16,1 ** 411,6±12, опыт (низ) 351,2±14,3 *** 467,2±16,2 *** 433±14,4 *** 441,1±14,2 ** 505,3±16,5 *** показателей УСР (dpmопыт/dpmконтроль) в течение 24х часового ОВ выявил различия проявления данного эффекта в зависимости от пространственного положения групп эмбрионов. Так, было показано что, кривые, описывающие динамику относительных показатей УСР эмбрионов из нижних кювет, располагаются выше таковых для верхних, т. е. более выраженное изменение УСР отмечается в группах «старших» и «младших» эмбрионов, располагающихся в нижнем положении (рис. 8).

Явление «эффекта положения» до конца остается неясным. Наличие анимально-вегетативного градиента и ориентация зародышей амфибий и рыб во время дробления анимальным полюсом вверх может быть одной из причин описываемого явления, поскольку процессы, проходящие в верхнем и нижнем полюсах дробящегося зародыша принципиально различаются (работа генетического аппарата, геометрические преобразования поверхностей, связанные с процессами деления клеток – на анимальном полюсе, процессы утилизации и транспорта питательных веществ – на вегетативном полюсе), что может влиять на неоднородность ССИ в разных направлениях.

Однако, «эффект положения» наблюдается и в случаях взаимодействия зародышей более продвинутых стадий. Нами также было отмечено достоверное (р0,01) увеличение УСР в нижних группах при ОВ эмбрионов на стадии гаструляции (12, 14 стадии). Данный эффект уже нельзя объяснить наличием анимально-вегетативного градиента, поскольку зародыши вьюна на этих стадиях обычно располагаются хаотично, строгой ориентации в пространстве нет. Другой вероятной причиной может служить разница смены сред, преодолеваемых ССИ, идущим от верхних групп к нижним (зародыши, вода, кварц, воздух, вода, зародыши) и от нижних групп к верхним (зародыши, вода, воздух, кварц, вода, зародыши).

Рис. 8 Динамика относительных показателей УСР (dpmопыт/dpmконтроль) (M±m) в процессе 24х часового оптического взаимодействия зародышей вьюна при разном положении кювет:

Кювета с эмбрионами «старшей» группы стоит над кюветой с эмбрионами «младшей» группы (А) Кювета с эмбрионами «старшей» группы стоит под кюветой с эмбрионами «младшей» группы (Б) старшая группа _ _ _ _ младшая группа Существование состояний повышенной чувствительности биологических систем послужило основой к использованию развивающихся зародышей, в качестве тест-объектов малых и сверхмалых доз различных излучений и биологически активных веществ (Мелехова и др., 2004, 2005). Все это соотносится с представлениями о «критических периодах» эмбрионального и постэмбрионального развития биологических объектов разного уровня организации (Гольдшмидт, 1927, 1932; Светлов, 1978).

При изучении динамики показателей УСР в процессе ОВ групп эмбрионов вьюна, находящихся в начале взаимодействия на стадиях 5 (морула) и 0 ( мин. после оплодотворения), установлено, что через 4 часа оптического контакта наблюдается общее снижение показателей УСР в «старших» и «младших» группах, тогда как через 9-15 часов взаимодействия показатели УСР в опыте возрастают в 1,5 раза. Принципиальное различие эффектов кратковременных (несколько первых часов) и длительных (12-22 часа) взаимодействий было обнаружено Л. В. Белоусовым при сравнении характеристик ССИ разновозрастных групп зародышей вьюна при наличии или отсутствии ОВ (Белоусов и др., 2003). «В течение 1-го часа ОВ наблюдали постепенное возрастание процента нулевых значений излучения.

Параллельно с этим возрастало количество и высота редких больших импульсов (оцениваемых по величине куртозиса). Кроме того, корреляция между спектрами Фурье оптически взаимодействующих образцов понижалась быстрее, нежели при отсутствии оптических контактов. Измерения спектров Фурье после длительных (12–22-часовых) ОВ показали, что между образцами произошел «обмен» автокорреляционными характеристиками спектров суммы автокорреляционных коэффициентов в подавляющем большинстве случаев инвертировались (часто – с «перехлестом»), или, по крайней мере, сглаживались относительно контрольных образцов» (Белоусов и др., 2003).

Делается вывод, что описанные ранее эффекты ОВ между разновозрастными группами зародышей вьюна могут быть связаны с изменениями частотных характеристик их ССИ. «Если эффекты кратковременных ОВ (понижение средней интенсивности суммарного сигнала) можно, хотя бы отчасти, свести на известную из теории взаимодействующих осцилляторов «субрадиацию»

(Popp and Li, 1993; Popp, 2000), то для длительных ОВ удовлетворительной модели пока не существует. Во всяком случае, наблюдаемые эффекты выходят за рамки представлений о классическом резонансном взаимодействии линейных осцилляторов. Вместе с тем, теоретически показана возможность «обмена» характеристиками при взаимодействии нелинейных осцилляторов солитонного типа. Весьма вероятно, что сверхслабые биологические излучатели обладают сходными свойствами»

(Белоусов, 2002).

3. 2. Взаимодействие групп зародышей низших позвоночных при изменении оптических характеристик среды между ними.

3. 2. 1. Помещение в оптические каналы волнового взаимодействия интерференционных светофильтров (ИС).

Оптическое взаимодействие зародышей (6, 7, 8 стадий - бластуляция) с дробящейся икрой (0, 1, 2 стадии) приводит к увеличению темпов развития (смещение максимумом распределения на 1-2 стадии в большую сторону) эмбрионов в областях: 386 нм, 401 нм, 405 нм, 628 нм и 1000 нм; взаимное отставание (смещение максимумом распределения на 1-2 стадии в меньшую сторону)– в областях 372 нм, 379 нм, 546 нм; замедление младших и 0 эффект у старших – 455 нм, 482 нм (рис. 9).

Сразу после окончания ОВ наблюдали изменение темпов развития в «старших» группах зародышей, взаимодействовавших через ИС с максимумами пропускания в более длинноволновой области исследуемого диапазона [546 нм, 628 нм (р0,01); 1000 нм (р0,05)]. Спустя сутки после окончания эксперимента, наблюдали проявление отсроченного эффекта ОВ в более коротковолновой области спектра [372, 379, 386, 405, (р0,05); 401 нм (р0,01)]. Достоверного изменения темпов развития после ОВ через ИС, пропускающих в сине-голубой области (455 нм и 482 нм), не выявлено.

Эффект ОВ в области 546 нм сохраняется на протяжении двух суток (рис. 9А).

Сразу после окончания ОВ в «младших» группах зародышей эффекты ускорения \ замедления темпов развития проявились во всех вариантах взаимодействия через ИС. Через сутки, наблюдаемые изменения темпов развития сохранились лишь в вариантах ИС с максимумами пропускания нм, 455 нм (р0,05); 546 нм, 628 нм (р0,01), тогда как в остальных случаях эффект нивелировался (р0,05) (рис. 9Б). Картина синхронизации темпов развития «старших» и «младших» зародышей вьюна при их ОВ, в присутствии ИС с разными максимумами пропускания, позволяет выделить области, стимулирующие ускорение / замедление темпов эмбрионального развития (рис. 9) по сравнению с эффектами прямого ОВ (замедление темпов развития эмбрионов «старшей» группы и слабое ускорение «младших»).

Рис. 9 Направление скорости развития зародышей вьюна после оптического взаимодействия через интерференционные светофильтры в «старшей» (А) и «младшей» (Б) группах ( – ускорение; – замедление, – изменение не достоверно).

- проявление эффекта сразу после окончания 24-х часового взаимодействия -проявление эффекта через сутки после окончания 24-х часового взаимодействия Сходную картину наблюдали в экспериментах по ОВ через ИС, групп зародышей одного возраста, находящихся на стадиях развития: 3 ( бластомера), 3,5 (64 бластомера); 6 (ранняя бластула); 8 (поздняя высокая бластула), 9 (поздняя эпителиальная бластула). В присутствии ИС (максимумы пропускания: 372 нм, 379 нм, 482 нм, 546 нм) наблюдали снижение темпов развития эмбрионов в верхних и нижних кюветах (р0,05), ускоренное развитие - в присутствии ИС (максимумы пропускания: 401 нм, 405 нм, нм) (р0,05). Следует отметить, что при прямом ОВ зародышей одинаковых возрастных групп достоверных эффектов не обнаружено.

Для зародышей ранних стадий дробления было показано, что изменение оптических характеристик среды при ОВ с помощью ИС увеличивается процент гибели и степень рассинхронизации развития зародышей в группе. В экспериментах по ОВ зародышей одиновозрастных групп ранних стадий дробления, разделенных ИС с полосами пропускания 401нм, 482 нм или нм, отмечали появление (до 8%) (р0,01) зародышей, со значительными нарушениями морфогенеза, приводящим к появлению специфических аномалий развития (рис. 10). Увеличение смертности (на 20%) отмечено при использовании ИС 482 нм и 546 нм (р0,01).

Рис. 10 Типичные аномалии развития в группах одновозрастных вьюнов, помещенных в эксперимент на начальных стадиях развития, разделенных ИС с полосами пропускания 401нм, 482 нм или 546 нм. А - недоразвитие туловищного и хвостового отдела; Б - образование 2-х неравноценных голов и недоразвитие туловищных и хвостовых отделов; В – норма.

Таким образом, наблюдаемые изменения параметров эмбрионального развития вьюна после ОВ в присутствии ИС с различными максимумами пропускания в диапазонах УФ, видимого света и ИК могут свидетельствовать о специфическом влиянии на процесс развития определенных узких спектральных зон ССИ.

3. 2. 2. Помещение в оптические каналы волнового взаимодействия призменных уголковых световозвращателей (УСВ).

В результате ОВ одновозрастных групп эмбрионов вьюна через УСВ отмечено достоверное изменение параметров их дальнейшего развития. Этого никогда не наблюдалось при прямом ОВ одновозрастных зародышей. В процессе работы было выявлено, что воздействие УСВ на характер ОВ определяется не только размещением образцов относительно рабочей поверхности УСВ, но и качеством изготовления последних.

Рис. 11 Распределение энергии светового потока. широкую А - изображение Б –трехмерное вариабельность ответа светящейся «точки», распределение энергии одновозрастных прошедшей через УСВ. световой волны на выходе эмбрионов при их ОВ сектора такого УСВ.

При расположении кювет с зародышами, например, в секторах 1 и (нумерация ведется относительно заводской маркировки), в обеих кюветах наблюдается достоверное (р0,01) ускорение развития по сравнению со всеми контрольными группами. Причем в 1-м секторе ускорение выражено в смещении максимумов распределения (все эмбрионы на 13 и 14 стадиях), в 4-м – ускорение темпов развития наблюдается, главным образом, как определенная рассинхронизация – увеличение дисперсии распределения (зародыши 12, 13 и 14 стадий), как по сравнению с группой из первого сектора, так и со всеми контрольными группами, где встречаются эмбрионы 12, 13 стадий, а также достоверное (р0,001) двукратное увеличение эмбриональной смертности и увеличение (р0,05) количества аномально развивающихся зародышей по сравнению с контрольными. В группе из 1-го сектора, наоборот, выражено снижение (р0,05) числа аномалий по сравнению с контролем и экспериментальными группами 4-го сектора (р0,001).

Через сутки после окончания ОВ наблюдалось четырехкратное увеличение (р0,001) числа погибших эмбрионов, в то время как в опытных группах отмечено увеличение погибших в 1,8 (р0,01) в группах эмбрионов из первого, и в 1,5 (р0,01) в группах из четвертого, секторов. В обеих группах, взаимодействовавших через УСВ, наблюдали ряд аномалий развития.

Когда угловое распределение энергии светового потока на выходе УСВ имеет несложный характер дифракционной картины (двупятновая система), наблюдается меньшая вариабельность ответа зародышей Misgurnus fossilis после их ОВ через противоположные сектора такого УСВ, и значительная коррекция процессов развития, приводящая к снижению эмбриональной смертности при исходно низком качестве икры вьюна (рис. 12). В результате ОВ через «двупятновый» УСВ, при размещении кювет с эмбрионами в 1 и секторах УСВ №482 наблюдали снижение смертности до 40% (р0,001) в группе эмбрионов, расположенной на 1-м секторе, куда излучение попадало, проходя из 4 в 1 сектор, тогда как при обратном прохождении оптического пути (от 1 сектора к 4), реакция эмбрионов не отличалась от контроля (100% гибель) (рис 12А). При угловом смещении световых максимумов на 90 (УСВ №485), эффект положительной (рис. 12Б).

Выживаемость (%) при размещении кювет на 1 и секторах УСВ №482 (А) и УСВ №485 (Б).

Показано наличие симметрично анизотропных участков УСВ. Такого рода анизотропия при передаче дистантных взаимовлияний через многозеркальную систему может быть объяснена с позиций неидентичности передачи вектора поляризации ССИ в зависимости от направления движения исходно поляризованного излучения через УСВ. Предложена модель, основанная на ОВ групп одновозрастных эмбрионов вьюна, для тестирования качества (индивидуальных свойств) УСВ.

3. 3. Отсроченный эффект оптического взаимодействия зародышей вьюна.

Оптическое взаимодействие разновозрастных зародышей вьюна стадий 10-19 (гаструляция) и 0-1 (начало дробления) приводит к ускоренному развитию «младших» и задержке развития эмбрионов «старших» групп. Этот эффект сохраняется и после прекращения дистантных взаимодействий. На рис.

13 представлена динамика вылупления зародышей «старшей» группы после 24х часового оптического контакта. Момент начала вылупления в группе опытных животных отсрочен, в среднем, на 6 часов (р0,01).

Дальнейшие наблюдения за предличинками и личинками выявили достоверные различия в темпах пигментации и закладки элементов кровеносной системы (рис. 14) только у особей «старшей» возрастной группы. На 6 день развития линейные размеры тела контрольных особей превышают таковые в опыте на 10-15% (р0,05) (рис. 14).

Объем и форма желточного мешка, характеризуют общее отставание в контакта (а) и в контроле (б), Pc-перикард; азановый метод Гейденгайна, сагиттальный срез. Об.5. ок.10х.

Ключевым маркером динамики постэмбрионального развития является становление основных звеньев репродуктивной системы (гипофиз и гонада).

Схема расположения разных типов тропоцитов в гипофизе была получена нами, предварительно, на другом представителе карпообразных рыб – белом толстолобике (Hypophthalmichthys molitrix, Cyprinidae). У вьюна в результате сравнительного гистохимического анализа, выявлено замедление темпов морфологической и цитологической дифференцировки гипофиза после оптического контакта. Появление первых ацидофильных клеток (соматотропоциты) в гипофизах особей опытной группы отмечено на 16- день, в контроле – 12-14 день (рис. 15); первые базофильные клетки (тиреотропоциты) у особей из опытной группы появляются на 23-25 день, в контроле - на 19-20 день.

Показано, что задержка темпов развития затрагивает и скорость дифференцировки клеток полового ряда. Анализ состояния первичнополовых клеток (ППК) у особей из опытных и контрольных групп выявил следующее: у зародышей в возрасте 10 суток доля полиморфноядерных ППК (рис. 16А) в опытной группе составляет 30-40% от общего количества ППК (рис. 16Б), в контроле – 10-20% (р 0,05), достоверных различий по количеству ППК в опыте и контроле не обнаружено. К моменту 20-22 суток у животных из опытной группы отмечается снижение количества гоноцитов по сравнению с контролем на 15-20% (р 0,05).

полиморфноядерные, Б - с округлым ядром. Об.100. ок.20х.

постэмбриональном развитии.

1. Оптический контакт изолированных групп зародышей низших позвоночных приводит к изменению темпа развития, процента эмбриональной смертности и появлению аномально развивающихся особей. Наблюдаемые эффекты стадиоспецифичны.

2. В процессе оптического взаимодействия разновозрастных групп эмбрионов вьюна наблюдается достоверное изменение показателей интенсивности свободно-радикальных реакций. Корреляции относительной величины данного показателя и проявления конкретного морфологического эффекта дистантного взаимодействия не обнаружено.

3. Помещение в оптические каналы волнового взаимодействия интерференционных светофильтров влияет на эффект дистантного взаимовлияния как разновозрастных, так и одновозрастных групп эмбрионов вьюна. Использование интерференционных светофильтров с максимумами пропускания в дальнем УФ (372 нм, 379 нм) и зеленой (546 нм) областях спектра приводит к замедлению темпов развития зародышей; в ближнем УФ (386 нм), фиолетовом (401нм, 405 нм), красном (628 нм) и ИК (1000 нм) диапазонах – к ускорению темпов 4. Помещение в оптические каналы волнового взаимодействия призменных уголковых световозвращателей оказывают влияние на эффект дистантного взаимодействия одновозрастных групп индивидуальными характеристиками.

Эффекты 24-х часового оптического взаимодействия могут сохраняться на протяжении последующего онтогенеза, проявляясь в изменении темпов вылупления, роста предличинок и личинок, становления основных звеньев репродуктивной системы (гипофиза, 1. Бурлаков А.Б., Бурлакова О.В., Капранов Ю.С., Короткина М.Р., Перминов С.В., Куфаль Г.Э., Медведева А.А., Голиченков В.А. Эффекты дистантного взаимовлияния эмбрионов, возникающие при прохождении биоизлучения через лазерные уголковые световозвращатели // Труды Международного Форума по проблемам науки, техники и образования (под ред. В.П. Савиных, В.В.Вишневского). М., Академия наук о Земле, 2004, т.3, с.26-27.

2. Бурлаков А.Б., Бурлакова О.В., Капранов Ю.С., Короткина М.Р., Голиченков В.А., Перминов С.В., Куфаль Г.Э., Медведева А.А. Управление волновыми информационными потоками при дистантных взаимодействиях на ранних стадиях развития вьюна при помощи лазерных уголковых световозвращателей. // Труды VIII Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков». Москва, 2005, с.48- 3. Бурлаков А.Б., Бурлакова О.В., Капранов Ю.С., Короткина М.Р., Голиченков В.А., Перминов С.В., Куфаль Г.Э., Медведева А.А. Управление дистантным взаимодействием биологичеких объектов при помощи оптических приборов.

Анализ механизмов воздействия. // Электромагнитные волны и электронные системы, 2005, т.10, с.57-66.

4. Бурлаков А.Б., Медведева А.А., Полуэктова О.Г. Становление гонадотропной функции гипофиза у представителей разных по способу размножения экологических групп рыб из отряда карпообразных // Материалы Междунар.

Конф. «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных». Саранск. Из-во Мордов. ун-та, 2005, с.38-39.

5. Бурлаков А.Б., Бурлакова О.В., Капранов Ю.С., Перминов С.В., Голиченков В.А., Куфаль Г.Э., Медведева А.А. Трансформация биоизлучения лазерными уголковыми световозвращателями как способ анализа степени их анизотропии // Труды III международной конференции «Электромагнитные излучения в биологии». Калуга, КГПУ, с.51-55.

6. Бурлаков А.Б., Бурлакова О.В., Капранов Ю.С., Перминов С.В., Голиченков В.А., Куфаль Г.Э., Медведева А.А. Коррекция развития низших позвоночных при помощи лазерных уголковых отражателей // Научные труды I Съезда физиологов СНГ. Сочи, 2005, т.2, №699, с.245.

7. Бурлаков А.Б., Добрынина М.Т., Медведева А.А., Полуэктова О.Г. Развитие гипофиза и дифференцировка его секреторных клеток в раннем постэмбриональном развитии толстолобика Hypophthalmichthys molitrix (Cyprinidae) // Вопросы ихтиологии, 2006, т.46, №1, с.101-112.

8. Бурлаков А.Б., Бурлакова О.В., Капранов Ю.С., Перминов С.В., Куфаль Г.Э., Медведева А.А., Голиченков В.А. Использование лазерных уголковых световозвращателей для исследования свойств сверхслабого биоизлучения // Тез.

IV международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», 2006, с.86.

9. Бурлаков А.Б., Бурлакова О.В., Медведева А.А., Голиченков В.А. Анализ биологического действия спектральных составляющих сверхслабых излучений ранних зародышей вьюна // Тез. IV международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». Санкт-Петербург, 2006, 10. Бурлаков А.Б., Медведева А.А., Бурлакова О.В., Малахов Ю.И., Голиченков В.А.

Особенности биологического действия спектральных составляющих сверхслабых излучений вьюна в раннем онтогенезе // Сборник избранных трудов IV международного Конгресса "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине”. Санкт-Петербург, 2006, с.34-40.

11. Бурлаков А.Б., Малахов Ю.И., Медведева А.А., Бурлакова О.В., Голиченков В.А.

Анализ спектрального состава сверхслабых излучений ранних зародышей вьюна // Труды IX Международной конф. «Оптические методы исследования потоков».

М., Издательский дом МЭИ, 2007, с.328-331.

12. Бурлаков А.Б., Медведева А.А., Падалка С.М., Бурлакова О.В., Доронина Н.Ю., Косова Г.В., Мелехова О.П. Голиченков В.А. Изменение уровня свободных радикалов как показатель биокоррекции раннего развития рыб // Материалы и доклады Международного симпозиума «Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водоемов аридного климата». Астрахань, Изд-во АГТУ, 2007, с.437-439.

13. Падалка С.М., Бурлакова О.В., Медведева А.А., Косова Г.В., Мелехова О.П.

Бурлаков А.Б., Голиченков В.А. // Материалы II научн. конф. с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов».

Петрозаводск, Карельский научный центр РАН, 2007, с.111-112.

Курсивом выделены названия статей, опубликованные в реферируемых журналах.