На правах рукописи

ГУТНИКОВА

Людмила Валерьевна

Исследование прогностических биохимических

и молекулярно-генетических маркеров

эмбриогенеза человека

03.03.05 – биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ставрополь – 2010

Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

доктор биологических наук, профессор

Научный руководитель:

Шкурат Татьяна Павловна.

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Водолажская Маргарита Геннадьевна;

доктор биологических наук, профессор Асланян Марлен Мкртичович.

ГОУ ВПО «Ростовский государственный

Ведущая организация:

медицинский университет» Росздрава РФ.

Защита диссертации состоится 2010 г.

в _ часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 при Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корп. 2, комн. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Ржепаковский И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важной проблемой понимания процессов эмбрионального развития человека являются вопросы прогностического значения.

Высокая пластичность организма в раннем периоде делает эмбрион более чувствительным к различным факторам среды, с другой стороны, существует возможность воздействия на него в целях коррекции. Существующие биохимические маркеры развития плода, такие как альфа-фетопротеин, хорионический гонадотропин и свободный эстриол, достоверны в прогнозе синдрома Дауна и пороков развития нервной трубки, и малоэффективны в прогнозе врожденных пороков развития других соматических органов и наследственных заболеваний, а также в прогнозе развития гипоксии и гипотрофии плода. История разработки биохимических маркеров развития плода насчитывает более 40 лет, тем не менее, большинство современных исследований направлено на изучение узкого круга патологий – хромосомных анеуплоидий, грубых врожденных пороков развития. В то же время существует необходимость дальнейшего углубленного изучения механизмов развития ранних этапов эмбриогенеза и разработки методов прогноза течения беременности на основе индивидуальных особенностей генотипов родителей.

Успехи молекулярной генетики, достигнутые в последние годы, сделали возможным изучение генной природы и молекулярных механизмов многофакторной патологии. Например, все метаболические процессы инактивации токсичных веществ контролируются генотипом и зависят от его индивидуальных особенностей (Van Lieshout, e.a., 1998; Баранов В.C., 2007; Coto, e.a., 2010). В группу генов предрасположенности к невынашиванию беременности, относят гены системы биотрансформации ксенобиотиков – любых чужеродных токсичных веществ, поступающих в организм. Повреждающее действие ксенобиотиков может реализоваться как в ходе гаметогенеза, так и при оплодотворении, имплантации, синцитилизации, плацентации и последующих стадиях эмбриогенеза.

Дальнейшая оптимизация программы пренатальной диагностики плода может быть направлена как на поиск новых маркеров, так и на повышение чувствительности уже используемых маркеров.

Актуальность проблемы, стремление теоретически и практически обосновать применение новых маркеров для оценки состояния плода с позиций современной эмбриологии, используя новые биохимические и молекулярно – генетические подходы, обусловило выполнение настоящей работы.

Цель работы: проведение исследований по оценке эффективности существующего биохимического пренатального скрининга, разработка способов его оптимизации, поиск новых биохимических и молекулярно-генетических маркеров крови беременных женщин для оценки развития плода.

Задачи исследования.

1. Провести ретроспективный и проспективный анализ биохимического пренатального скрининга у беременных Ростовской области в период с 2006 по 2009 гг. Исследовать региональные медианы понедельного развития плода по сывороточным маркерам, определяемым иммуноферментным и иммунофлуоресцентным методами, с целью оптимизации существующего пренатального скрининга.

2. Исследовать прогностическую значимость биохимических показателей эмбрионспецифических белков и гормонов (АФП, ХГЧ, св. эстриола, ТБГ, прогестерона, тестостерона, кортизола, ДГЭА-С, 17-ОН-прогестерона) в сыворотке матерей, родивших детей с низкой массой тела.

3. Исследовать прогностическую значимость показателей окислительного статуса крови матерей, родивших детей с низкой массой тела.

4. Изучить вклад однонуклеотидных замен генов матери и плода системы гемостаза в процессе эмбриональных потерь.

5. Изучить вклад однонуклеотидных замен генов матери и плода системы детоксикации (первой и второй фазы) в процессе эмбриональных потерь.

';

Научная новизна работы. Впервые, опираясь на большой статистический материал (более 30000 беременностей и их исходов), доказана целесообразность внедрения в существующий пренатальный скрининг региональных медиан для сывороточных маркеров крови независимо от их метода исследования.

Введение региональных медиан сывороточных маркеров для беременных Ростовской области увеличивает чувствительность пренатального скрининга в среднем на 10%. Впервые показано, что увеличение уровня прогестерона, тестостерона, кортизола, хорионического гонадотропина человека и снижение концентрации свободного эстриола в крови матери во втором триместре достоверно ассоциировано с рождением детей с низким весом. Впервые показано, что снижение уровня антиоксидантных ферментов во втором триместре беременности может служить прогностическим маркером рождения ребенка с низкой массой тела. Впервые показано, что сочетание материнского и эмбрионального гетерозиготного носительства полиморфного аллеля A114V гена глутатион-S-трансферазы Р1 ассоциировано с увеличением риска эмбриональной гибели плода. Впервые показано, что суммарное носительство в супружеской паре более трех полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков приводит к достоверному увеличению риска эмбриональных потерь.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Введение региональных норм для медиан альфа-фетопротеина, свободного эстриола и хорионического гормона человека повышает эффективность пренатального скрининга независимо от метода определения – иммуноферментного или иммунофлуоресцентного анализа.

2. Определение повышенного уровня хорионического гонадотропина человека во втором триместре беременности в сочетании с увеличением уровня кортизола, прогестерона, тестостерона и снижением уровня свободно эстриола является прогностическим алгоритмом для оценки риска развития гипотрофии плода.

3. Снижение уровня супероксиддисмутазы в сыворотке крови женщин во втором триместре беременности более чем на 35% ассоциировано с низкой массой тела новорожденного.

4. Риск ранних эмбриональных потерь увеличивается при гетерозиготном носительстве как матерью, так и эмбрионом полиморфного аллеля A114V гена глутатион-S-трансферазы Р1.

5. Риск гибели эмбриона увеличивается при наличии у него более трех полиморфных аллелей генов системы детоксикации ксенобиотиков.

Теоретическое и практическое значение работы. В общетеоретическом плане, полученные результаты расширяют представления о патобиохимических процессах эмбрионального развития человека и открывают новые перспективы их практического применения в пренатальной диагностике плода. Выполненная работа расширяет существующие представления о прогностических биохимических и молекулярно-генетических маркерах эмбриогенеза человека.

В результате проведения комплексных исследований по поиску биохимических и молекулярно-генетических прогностических маркеров эмбриогенеза человека получены новые данные, позволяющие существенно оптимизировать существующий пренатальный скрининг, расширить спектр выявляемых нарушений развития плода и прогнозировать раннюю летальность эмбриона по генотипам родителей. Разработан алгоритм прогноза рождения детей с низким весом по уровню гормонов (хорионический гонадотропин, кортизол, прогестерон, тестостерон, свободный эстриол) и уровню антиоксидантов в крови матери во втором триместре беременности. Доказана целесообразность определения носительства аллеля глутатионтрасферазы GSTP1 Ala114Val у обоих супругов с целью прогноза эмбриональной гибели плода. Предложен и внедрен способ оптимизации существующего биохимического пренатального скрининга в Ростовской области на основе расчета региональных медиан. Полученные в работе новые экспериментальные данные используются при чтении лекций в спецкурсах «Эмбриология человека», «Медико-генетическое консультирование», «Свободные радикалы в живых системах», «Предиктивная медицина».

Работа выполнена в рамках научной тематики НИИ биологии ЮФУ «Изучение механизмов окислительного стресса», и в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2012» по теме «Разработка технологии мониторинга репродуктивной функции человека и развития плода с использованием новых геномных и постгеномных маркеров», государственный контракт № 02.740.11.0501, в рамках АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2020 гг)» проект № 2.2.3.3/2370, а также в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2012» по теме «Создание и апробация нового способа FIAV для быстрой идентификации аллельных вариантов генов» № 02.740.11.5015 и ФЦП МОН РФ ЦКП научным оборудованием «Высокие технологии» № 02552.11.7072.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных сессиях биолого-почвенного факультета ЮФУ (2005, 2008, 2009); на междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегральной медицине» (Судак-2006); на II международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008); на заседании Ростовского отделения общества ВОГиС (2009); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 11 работ, в том числе одна из них в периодическом издании из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 59 отечественных и 101 зарубежных источника, приложения. Работа содержит 23 таблицы, иллюстрирована рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования сывороточных маркеров АФП, ХГЧ и св. эстриола послужили образцы крови 33792 беременных, обратившихся в клиникодиагностические лаборатории города Ростова-на-Дону и Ростовской области (КДЛ «Наука» и КДЛ Ростовской областной больницы) с целью проведения пренатального скрининга, в период с 2006-2009 гг. (табл. 1).

Таблица 1 – Количество обследованных беременных (n) на разных сроках гестации в зависимости от метода определения сывороточных маркеров (недели, дни) Для оценки эмбрионспецифических белков и гормонов и показателей окислительного статуса было обследовано 86 беременных на сроке 15-18 недель ( женщин составили контрольную группу и 29 женщин родивших детей с низкой массой тела).

Методом иммуноферментного анализа определяли уровень альфафетопротеина, хорионического гормона человека, прогестерона, тестостерона, кортизола с использованием тест-систем «Алкор Био» (СПб), свободного эстриола, 17-ОН-прогестерона с использованием тест-систем «DRG» (Германия) на автоматическом иммуноферментном анализаторе «ALISEI QS» (Италия).

Уровень трофобластический бета-гликопротеин определяли с использованием тест систем «Вектор Бест» (Новосибирск), супероксиддисмутазу – «BenderMedSystems» (Австрия). Иммунофлуоресцентным методом определяли АФП, -free-ХГЧ, свободного эстриола с использованием тест-систем «Delfia» (Финляндия) на многофункциональном анализаторе «Victor». Колориметрическим методом определяли МДА (Стальная И.Д., 1977), общую концентрацию перекисей с использованием тест-системы OxyStat «Biomedica» (Вена).

Материалом для исследования полиморфизма генов детоксикации и генов коагуляции служила ДНК, выделенная из тканей плода (хорион) и матери (эндометрий) стандартными методами. Было проанализировано 56 образцов полученных от женщин с неразвивающийся беременностью и самопроизвольным абортом. Полиморфизм генов определяли с использованием реагентов фирмы «Литех» методом ПЦР, детекцию продуктов амплификации проводили в агарозном геле методом горизонтального электрофореза. Анализ электрофореграмм проводили под УФ на трансиллюминаторе GelDoc «BioRad» (США).

Статистический анализ результатов проводили с использованием программного пакета Excel 2007 и Statistica v.6.0. Сравнение различных данных проведено с использованием критерия Стъюдента и Пирсона (2). Различия признаков