WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Антипина Любовь Юрьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

Са2+-РЕГУЛИРУЕМОГО ФОТОПРОТЕИНА ОБЕЛИНА

Специальность 01.04.07 физика конденсированного состояния

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Красноярск 2010

Работа выполнена в Институте физики им. Л.В. Киренского СО РАН

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор, Овчинников Сергей Геннадьевич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук Белобров Петр Иванович кандидат физико-математических наук Краснов Павел Олегович

Ведущая организация: Институт биохимической физики им. н.м. Эмануэля РАН, г. Москва

Защита состоится «_» _ 2010 г. в _:_ часов на заседании диссертационного совета Д 003.055.02 в Институте физики им. Л.В. Киренского СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 38.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физики им. Л.В.

Киренского СО РАН.

Автореферат разослан «_» _ 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. наук Втюрин Александр Николаевич Общее содержание работы Актуальность: Биолюминесценция – явление, широко представленное в природе. В настоящее время биолюминесцентные белки являются основой многих широко используемых методов анализа. Биолюминесцентные методы широко используются в клеточной биологии и экологии, а также в медицинской диагностике и исследовании онкологических заболеваний.

Значительный прогресс в понимании механизма биолюминесценции и роли отдельных аминокислот белка в этом процессе был достигнут после определения нескольких пространственных структур Са2+-регулируемых фотопротеинов. Однако, пространственная структура белка обеспечивает информацию только о статическом состоянии белковой молекулы и аминокислот активного центра. Какие изменения происходят непосредственно в ходе реакции, остается неизвестным. Восполнить этот пробел позволяют современные квантово-химические методы расчетов, которые в настоящее время широко применяются для решения задач подобного уровня.

Целью работы являлось исследование строения, электронной структуры и механизмов флуоресценции фотопротеинов методами квантовой химии.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. исследование строения целентерамида (CLM) и целентеразина (CLZ) с учетом эффектов электронных корреляций;

2. изучение влияния ван-дер-ваальсовых взаимодействий на процесс образования 2-гидропероксицелентеразина (НP-CLZ) и моделирование процесса активации CLZ кислородом;

3. построение физической модели флуоресценции фотопротеинов.

При решении поставленных задач получены результаты, которые выносятся на защиту:

1. Учет электронных корреляций дает структуру наиболее близкую к экспериментальной для изомеров молекул CLZ и CLM и позволяет выбрать форму целентеразина CLZ(1H) как наиболее вероятную из возможных изомерных форм.

2. Показано, что ван-дер-ваальсово взаимодействие влияет на процесс формирования НP-CLZ. Рассчитана энергия активации реакции образования НP-CLZ, которая находится в согласии с экспериментом.

3. Построена физическая модель флуоресценции фотопротеина обелина с учетом электронных корреляций. Экспериментально наблюдаемая длина волны излучения 500 нм соответствует «комплексу с переносом протона» между кислородом целентерамида и гистидином His22.

Научная новизна.

В работе обнаружен эффект электронных корреляций на стабилизацию изомерных форм целентеразина.

Были получены объяснения следующим, экспериментально наблюдаемым, явлениям:

1) в белке Obelia Longissima (OL) субстрат находится в форме CLZ(2H), в Renilla Muelleri (RM) — CLZ(1H), поэтому активация CLZ в белке RM не 2) установлен механизм формирования эмиттера; длина волны флуоресценции определяется положением протона между фенольной группой CLM и На основании результатов квантово-химических расчетов было предсказано следующее:

1) существование субстрата целентеразина в белке в изомерной форме 2) учет электронных корреляций дает структуру более близкую к экспериментальной в растворителе и позволяет выбрать форму целентеразина CLZ(1H) как наиболее вероятную из возможных изомерных форм в протонных растворителях.

3) необходимость присутствия гистидина His175 на формирование CLZ(2H) из CLZ(1H) в белке на начальном этапе реакции;

4) влияние полярных групп аминокислотного окружения на процесс образования комплекса CLZ(2H)···O2, из которого впоследствии идт формирование 2-гидропероксицелентеразина (НР-CLZ).

Практическая значимость.

Разработанная модель активного центра фотопротеина позволяет проводить качественные исследования геометрии активного центра и электронной структуры квантово-химическими методами, с учтом электронных корреляций.



Изучено влияние аминокислотного окружения на субстрат в активном центре фотопротеина. Полученная из расчтов информация делает возможным целенаправленный синтез люминесцентных белков с заданными свойствами.

Личный вклад автора.

Моделирование активного центра фотопротеинов. Расчет всех структур с помощью различных квантово-химических методов. Анализ полученных данных.

Настоящая работа является итогом исследований, проводимых в 2007-2010 годах.

Апробация работы. Результаты, включенные в диссертацию, были представлены на различных конференциях, в том числе: VIII Всероссийская научнопрактическая конференция студентов и аспирантов «Химия и Химическая технология в XXI веке» (2007, Томск); ХХ зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2008, Москва); Luminescence (2008, Beijing и 2010, Lyon); 12-ая и 13-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология в XXI веке (2008 и 2009, Пущино); ХХ и XXI симпозиум "Современная химическая физика" (2008 и 2009, Туапсе); IV школа-семинар молодых ученых «Квантово-химические расчеты:

структура и реакционная способность органических и неорганических молекул»

(2009, Иваново). Результаты работы так же обсуждались на научных семинарах в Институте физики им. Л.В. Киренского СО РАН (г. Красноярск).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в реферируемых отечественных журналах. Всего опубликовано 14 работ, включая тезисы и материалы конференций.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (07–04–00930–а и 09-04- офи_м), программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», программы Сибирского отделения РАН (проект № 2), а также в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, глав, заключения и списка литературы. Объем работы составляет 103 страницы, включающих 24 рисунка, 17 таблиц и список литературы из 121 наименования.

Содержание работы Во введении обоснована актуальность проводимых исследований, сформулирована цель работы, указаны научная новизна, практическая значимость полученных результатов и основные положения, выносимые на защиту.

Первая глава диссертации содержит литературный обзор теоретических и экспериментальных исследований биолюминесцентных белков, их субстратов и различных механизмов реакции. Приводится обзор экспериментальных работ по исследованию обелина.

Схематично схема преобразования субстрата представлена на рис. 1, процесс биолюминесценции - на рис. 2.

Рис. 1 – Преобразование субстрата в ходе биолюминесцентной реакции Рис. 2 – схема процесса биолюминесценции и флуоресценции обелина I - Стадия поглощения апо-белком целентеразина в растворе.

II - Стадия образования гидроперекиси целентеразина внутри полости белка с находящимся там кислородом.

III - Биолюминесцентная реакция декорбаксилирования обелина с ионами кальция с образованием Са2+-разряженного белка обелина, с превращением целентеразина в целентерамид внутри полости белка.

IV - Флуоресцентная реакция Са2+-разряженного обелина.

При добавлении к апо-белку целентеразина (CLZ) происходит образование активного фотопротеина (рис. 1 и 2, процесс I-II). При этом CLZ вступает в реакцию с молекулой кислорода, образуя внутри белка молекулу 2-гидропероксицелентеразина (HP-CLZ). Присоединение ионов кальция (рис. 1 и 2, процесс II-III) запускает реакцию окислительного декарбоксилирования, в результате которой образуется Ca2+разряженный фотопротеин, содержащий субстрат в возбужденном состоянии – целентерамид (CLM). Переход CLM из возбужденного состояния в основное сопровождается биолюминесценцией, которая наблюдается в диапазоне 465–495 нм и зависит от организма, из которого фотопротеин выделен. После реакции образующийся разряженный фотопротеин (рис. 2, состояние III), содержащий целентерамид в основном состоянии, при облучении светом проявляет яркую флуоресценцию.

Немодифицированная форма CLZ отвечает формуле С26H21O3N3.

Целентеразин может быть выкристаллизован из метанола как желто-оранжевые кристаллы. В метаноле CLZ флуоресцирует в желтой области, и его ультрафиолетовый спектр поглощения имеет максимум на 435 нм В разных растворителях CLZ может формировать несколько изомерных форм. Однако экспериментально установить какая же именно форма существует в тех или иных условиях практически невозможно. Структуры изомерных форм CLZ представлены на рис. 3.

В отличие от фотопротеина обелина, выделенного из Obelia Longissima (OL), в Са -связывающем белке (CBP), выделенном из Renilla Muelleri (RM), активация целентеразина кислородом не происходит. Излучающей структурой фотопротеинов является целентерамид (CLM), образующийся в ходе биолюминесцентной реакции.

CLM может формировать четыре вида возбужденных состояний (рис. 4).

Экспериментально установить, какая же форма является излучающей в процессе биолюминесценции или флюоресценции, не удается.

Во второй главе приводиться описание методов расчета электронной и атомной структуры используемых в данной работе. Рассматриваются метод ХартриФока (HF), метод функционала плотности (DFT). Также рассматривается теория возмущений Мллера-Плессета второго порядка (MP2). Для изучения флуоресценции использовался метод конфигурационного взаимодействия (CI), позволяющий рассчитывать геометрию структуры в возбужденном состоянии с учетом электронных корреляций. Для учета ван-дер-ваальсовых взаимодействий использовались полуэмпирические методы РМ3 и РМ6. Все расчеты электронной и атомной структуры проводились с использованием программ GAMESS, MOPAC или HyperChem.

Третья глава посвящена исследованию строения CLZ с учетом аминокислотного окружения и электронных корреляций.

Экспериментально, на данный момент, получена только структура белка обелина содержащая HP-CLZ и структура целентеразин-связывающего белка (CBP) Renilla Muelleri, содержащая CLZ. При оптимизации геометрии структуры целентеразина, взятой из рентгеноструктурного анализа CBP (CLZ(7H) или CLZ(1H)) в аминокислотном окружении обелина происходит разрушение структуры целентеразина потому что одним из своих заместителей целентеразин, протонированный в положении N(7) или N(1), пересекается с аминокислотным окружением – His175 и Trp135 (рис. 5). Если оптимизировать целентеразин в форме CLZ(2H) в тех же условиях, получается стабильная молекула.

В работе [1] проведено исследование немодифицированного CLZ и его аналогов в различных растворителях. Показано, что в растворителях различной полярности наблюдается различный максимум поглощения (в протонных ~ 435 нм, в апротонных – с красным сдвигом ~ 455 нм). Данные максимумы поглощения были приписаны разным изомерным формам – CLZ(7H) и CLZ(2H) соответственно.

Рис. 5 – Положение целентеразина в форме CLZ(7H) в белке обелине.

атомы азота и кислорода с неподеленными электронными парами. Наличие данных атомов приводит к корреляционным эффектам, поэтому было решено проверить атомную структуру целентерамида с помощью одноэлектронных приближений (метод HF) и с учетом корреляционных поправок (CI, B3LYP, МР2).

В таблице 1 представлены энергии трех изомерных структур целентеразина, полученные различными методами.

Hori K., Anderson J.M., Ward W.W., Cormier M.J. // Biochemistry, Vol. 14, No. 11. – 1975. – P. 2371 – При учете корреляции уменьшается энергетическая разница между структурами CLZ(1Н) и CLZ(7Н) (18 кДж/моль без учета корреляции и 6 кДж/моль с учетом). Это происходит из-за того, что структуры CLZ(1Н) и CLZ(7Н) геометрически различаются мало, в отличие от структуры CLZ(2Н), у которой С(2) находится в sp3-гибридизации, и фенольное кольцо отклонено от плоскости пиразинового кольца на 125. Аналогичная ситуация наблюдается и в случае первопринципных методов. В случае метода Хартри-Фока наблюдается достаточно большое различие энергий структур CLZ(1Н) и CLZ(7Н) (59 кДж/моль) и слабое различие между структурами CLZ(7Н) и CLZ(2Н) (30 кДж/моль).

Табл. 1 – Энергия целентеразина, полученная различными методами кДж/моль целентесильнее проявляется разница разина CLZ(1H) CLZ(7H) CLZ(2H) Метод расчета HF -3635586 -3635645 - DFT B3LYP -3656046 -3656071 - MP2 -3647264 -3647270 - При учете электронной корреляции методом МР2 разница между CLZ(7Н) и CLZ(1Н) не большая, можно предположить, что они при определнных условиях могут переходить друг в друга в растворителях достаточно легко. Поэтому определить, какая структура существует в том или ином растворителе только из энергетического фактора нельзя. На основании полученных геометрий был выполнен расчет спектров поглощения изомерных форм целентеразина в вакууме, метаноле и DMSO. Расчет спектров поглощения CLZ в растворителях проводился прямым и косвенным методом. Для прямого метода расчетов молекула целентеразина была помещена в окружение из 10 молекул растворителя. Расчет проводился полуэмпирическим методом РМ3, чтобы учесть электростатическое взаимодействие.

Косвенный метод расчета был выполнен с использованием РСМ-модели методом DFT-B3LYP/6-31*. В РСМ модели (Polarizable Continuum Model) растворитель неявно учитывается введением диэлектрической проницаемости среды, и других свойств растворителя [2,3]. Результаты расчетов приведены в таблице 2.

При расчете спектров поглощения в вакууме метод РМ6, реализованный в программе МОРАС, не показал различия в спектрах для изомерных форм CLZ. Метод TD DFT на основе геометрий, полученных методом МР2 показывает максимумы поглощения для всех форм CLZ в тех же приделах что и на основе геометрий, полученных методом DFT B3LYP. Поэтому при рассмотрении спектров в растворителях данные методы можно исключить.

Табл. 2 – Максимумы поглощения структур CLZ в растворителях, нм.

Форма целенсоответствие с предположением, которое теразина Максимум поглощения структуры CLZ(2H), рассчитанный полуэмпирическим методом РМ3, показывает значение ~ 360 нм. Поэтому структура CLZ(2H) исключена из дальнейшего рассмотрения.

Расчеты с использованием конфигурационного взаимодействия в рамках метода РМ3, который хорошо параметризован для биологических объектов, показывают сильный красный сдвиг для структуры CLZ(7H) при любых условиях. Таким образом, Cossi M., Barone V., Cammi R. Tomasi J. // Chem.Phys.Lett., Vol. 255. – 1996. – P. 327 – Barone V., Cossi M., Tomasi J. // J.Chem.Phys., Vol. 107. – 1997. – P. 3210 – Nakatani N., Hasegawa J., Nakatsuji H. // JACS, Vol. 129. – 2007. – P. 8756- Casida M.E., Salahub D.R. // J. Chem. Phys., Vol. 113. – 2000. – P. 8918 – на основании полуэмпирических расчетов с учетом электронных корреляций методом конфигурационного взаимодействия можно сделать следующее заключение: в апротонном растворителе CLZ существует в форме CLZ(7H), а в протонном – CLZ(1H), в отличие от того, что считалось ранее [1].

Для того, чтобы определить, какая же структура является более предпочтительной в тех или иных условиях, было проведено сравнение длин связей для структур CLZ(1H) и CLZ(7H) (табл. 3). В таблице также приведено — среднеквадратическое отклонение. Структура CLZ(2H) не принималась во внимание при сравнении геометрических параметров, т.к. ее образование в растворителе маловероятно. Следует отметить, что метод Хартри-Фока дает ошибку при расчете длин связей азота и кислорода. Полуэмпирический метод PM6 (также как и РМ3) немного лучше описывает эти связи. Из сравнения геометрий видно, что наиболее близкая к экспериментальным данным структура – CLZ(1H). Все методы расчета показали отклонение для данной структуры меньше, чем для структуры 7Н.

Табл. 3 – Сравнение атомных структур двух таутомерных форм целентеразина, отклонение от экспериментальных данных,. Номера связи соответствуют рис. целентеCLZ(7H) Исходя из сравнения атомной структуры при учете электронных корреляций, можно сделать вывод, что начальной структурой процесса будет являться структура CLZ(1H), а не CLZ(7H), как считалось ранее.

Однако, как было показано выше, в аминокислотном окружении обелина может существовать только структура CLZ(2H). Следовательно, образование 2гидропероксицелентеразина может начинаться только из целентеразина в форме CLZ(2H). На рисунке 6 представлена схема и энергетическая диаграмма данного процесса. Процесс происходит в одну стадию. Для того чтобы запустить активацию, необходимо затратить 68 кДж/моль. Рассчитанная энтальпия реакции составляет порядка 60 кДж/моль. Энергия активации, полученная из квантово-химических расчетов, хорошо согласуется с экспериментальными данными, из которых энергия активации составила 57,4 кДж/моль, энтальпия при 20 градусах – 55 кДж/моль.

Полученные результаты поднимают вопрос о том, каким образом может образовываться структура CLZ(2H) из структур CLZ(7H) или CLZ(1H).

Рис. 6 – Механизм образования 2-гидропероксицелентеразина и энергетическая диаграмма данного процесса Образование CLZ(2H) может проходить по анионному механизму из структуры CLZ(1Н) или CLZ(7Н). Первым шагом данной реакции является депротонирование целентеразина в положении N(7) или N(1) (рис. 7). Из энергетической схемы реакции (рис. 7) видно, что депротонирование CLZ может происходить в присутствии ОН(-) или аниона аминокислоты. Далее происходит переход заряда с положения N(7) или N(1) в положение С(2).

В работе [6] предполагалось, что образование HP-CLZ может происходить через образование аниона CLZ. Согласно данной схеме проводилось моделирование процесса присоединения молекулы кислорода к аниону. В соответствии с квантовохимическими расчетами, если молекулярный кислород находится вблизи атома С(2), на котором находится заряд -1, то при оптимизации геометрии данного кластера происходит циклизация, с последующим образованием структуры соответствующей конечным продуктам реакции — CLM и CO2. Следовательно, образование гидроперекиси HP-CLZ может происходить только из незаряженной формы.

Kondo, H.; Igarashi, T.; Maki, S.; Niwa, H.; Ikeda, H.; Hirano, T. // Tetrahedron Lett., Vol. 46, N. 45. – 2005. – P.

7701 – Соответственно, следующая стадия – присоединение протона в положение C(2). Энергетическая схема данного процесса представлена на рисунке 8. Для образования CLZ(2H) из аниона необходимо присутствие аминокислоты, которая может отдать протон. Тогда реакция идет или с более низким барьером (в случае присутствия воды) или безбарьерно (в случае присутствия His(+)).

Рис. 8 – Энергетические схемы процесса протонирования аниона целентеразина Рис. 9 – Схема анионного механизма образования целентеразина в форме CLZ(2H).

Из структуры белка видно, что рядом с His175 находится аминокислота, содержащая ионизированную –СОО(-) группу, которая она может отобрать у His водород, переводя его в заряженную форму, которая, в свою очередь, забирает водород у целентеразина (рис. 9.1). На депротонирование целентеразина необходимо затратить 11 кДж/моль (рис. 7). Далее происходит перход заряда с атома азота N(7) на атом углерода С(2) (Еакт ~ 1,5 кДж/моль). Затем анион целентеразина CLZ(2-) протонируется аминокислотным окружением (рис. 9.5). Данный процесс происходит без затрат энергии (рис. 8). Данный результат хорошо согласуется с экспериментом, согласно которому замена аминокислоты His175 приводит к резкому падению активности фотопротеина.

В четвертой главе рассматривается влияние ван-дер-ваальсового взаимодействия на процесс активации молекулой кислорода CLZ. Для того чтобы выяснить, что является движущей силой образования НP-CLZ и какая среда является оптимальной для активации целентеразина кислородом, мы провели оптимизацию геометрии кластера, включающего целентеразин, кислород, воду и несколько аминокислот His175, His64, Tyr138 и Tyr190 (код PDB – 1QV0). Ван-дер-ваальсовы силы могут играть ключевую роль в процессе активации целентеразина. Поэтому для расчетов были использованы полуэмпирические квантово-химические методы, включающие ван-дер-ваальсово взаимодействие и водородные связи.

В качестве отправной точки расчетов были взяты молекулы целентеразина и на различном удалении от атома С(2) молекула кислорода в основном триплетном состоянии. Данные расчты (табл. 4) показывают, что целентеразин в присутствии О не формирует стабильного комплекса. Более того, в процессе оптимизации геометрии молекула кислорода всегда удалялась от С(2) атома целентеразина на 3,6 и более (рис. 10).

Табл. 4 – Энергетические характеристики образования кластера CLZ···O2···H2O···Tyr138···His175 -93,82 2,33 3, Далее к данной модели добавлялись различные молекулы: гистидин, тирозин и вода в различных позициях и комбинациях. Аминокислоты были выбраны и расположены в кластере в соответствии с аминокислотными остатками в кристаллической структуре обелина – His175, His64, Tyr138 и Tyr190. Оптимизация геометрии молекул при различных положениях полярных молекул (Tyr или вода) и кислорода относительно молекулы целентеразина приводит к тому, что все структуры попадают в одно положение на поверхности потенциальной энергии, в которой кислород располагается напротив с С(2)-Н, а полярная молекула – напротив N(1) атома. Расстояние между молекулой кислорода и целентеразином равно 2,3, выигрыш энергии при этом достигает 20 кДж/моль.

Рис. 10. Образование комплекса целентеразина с молекулой кислорода при Была проведена оптимизация кластера, содержащего целентеразин, кислород и воду.

При последовательном расположении молекулы воды на различные расстояния от N(1) азота целентеразина (3 – 10 ), при фиксированном расстоянии до кислорода 2,, оптимизация приводит к тому, что молекула воды приближается к N(1) азоту целентеразина на 3 когда она находиться на расстоянии до 5. В результате близкого положения молекулы воды N(1) азот целентеразина поляризуется и формируется стабильный комплекс между целентеразином и кислородом.

Для проверки влияния полярных молекул на стабилизацию кластера «CLZ···O2»

была проведена замена тирозина около N(1) азота на фенилаланин. В ходе оптимизации молекула кислорода отошла от С(2)-Н связи на достаточно большое расстояние (>5 ). Из данных расчтов видно, что для формирования устойчивого комплекса между водородом С(2)-Н и молекулой кислорода необходимо наличие полярной молекулы у атома N(1). Полярная молекула влияет на атом N(1) который в свою очередь, с помощью индукционного эффекта перераспределяет заряд в пиразиновом кольце. Данный эффект вызывает появление мгновенного диполя на молекуле кислорода, что приводит к ее приближению к С(2)-Н связи.

В пятой главе проводится изучение физико-химических процессов, происходящих при флуоресценции фотопротеинов.

Рис. 11 – Строение целентерамида Поэтому, необходимо выяснить насколько сильно в данной структуре проявляются корреляционные эффекты и нужно ли в дальнейшем их учитывать или можно использовать только одноэлектронные приближения. В таблице представлено сравнение длин связей рассчитанных структур относительно эксперимента.

Табл. 5 – Сравнение геометрии, полученной различными методами, для незараженной формы целентерамида,. Номера связи соответствуют рис. В системе связей с N(1) полуэмпирический метод показывает сильное отклонение от экспериментальной структуры. Но при расчете данной связи достаточно сильное отклонение от эксперимента (0,05 и более) показывают все методы. Вероятно, это связано с тем, что атом кислорода О(3) оттягивает на себя электронную плотность, приводя, тем самым, к искажению структуры. Метод Хартри-Фока сильно ошибается при расчете длин связей азота и кислорода.

Полуэмпирический метод немного улучшает результаты, но тоже допускает ошибки в связях с азотом. Но полуэмпирические расчеты учитывают водородные связи и вандер-ваальсово взаимодействие, что дает им преимущество перед ab-initio методами.

При сравнении длин связи структур CLM, рассчитанных в возбужденном (*) и основном (0) состоянии (рис. 12) видно, что значения сильно меняются на фенольном и пиразиновом кольцах. Этими изменениями в геометрии можно объяснить большой Стоксов сдвиг в спектре флуоресценции (~ 140 нм), они показывают участие атомов этих колец в перераспределении полученной энергии возбуждения. Стоит отметить, что при оптимизации геометрии полуэмпирическими методами с учетом электронных корреляций данная область молекулы CLM описывается достаточно хорошо (табл. 5).

Рис. 12. А - Сравнение длин связей структур CLM в основном и возбужденном состояниях, рассчитанных методом КВ РМ3.

Б – Схема процессов, происходящих в процессе флуоресценции В работе [7] при исследовании флуоресценции целентерамида и его аналогов в различных растворителях было установлено, что в зависимости от растворителя возбужденный целентерамид может образовывать несколько ионных форм (рис. 4). В таблице 6 представлены результаты расчетов длин волн флуоресценции для всех возможных форм целентерамида в вакууме и в аминокислотном окружении.

Табл – 6. Длина волны люминесценции целентерамида и его форм Shimomura O., Teranishi K. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine // Luminescence, Vol. 15.

– 2000. – P. 51– Данные расчетов длины волны излучения целентерамида в вакууме без окружения значительно расходится с экспериментально полученными значениями для структур CLM, CLM-pyr и CLM-amid. Поэтому была построена кластерная модель белка (рис. 13).

В модель было включено ближайшее аминокислотное окружение полости, в которой находится целентерамид, в предположении, что оно может сильно влиять на возбужденное состояния CLM. При моделировании системы аминокислотное окружение было зафиксированным и играло роль электростатического поля.

Рассчитывалась молекула целентерамида (около 50 атомов) в ее ближайшем аминокислотном окружении на расстоянии 4-5 от атомов целентерамида, всего около 500 атомов. Из данных таблицы 6 видно, что длины волн для данных форм близки к экспериментальным значениям, полученным для этих форм в различных растворителях, но не подходят под экспериментальное значение флуоресценции обелина (максимум 495–510 нм). Таким образом, эти формы не подходят на роль эмиттера.

При моделировании фенолят-аниона в результате отрыва протона образуется анион с отрицательным зарядом на фенольном кислороде. Кислород образует двойную связь с образованием «хинонной» группы, что приводит к перестройке структуры с образованием пиразин-аниона. В этой связи структуру фенолят-аниона невозможно рассчитать. Поэтому была построена модель, основанная на следующих приближениях: полученная энергия в ходе флуоресценции (3,5 эВ), идет на перемещение протона. Моделирование проводилось следующим образом. Протон помещали в различные положения между двумя крайними позициями, расстояние между которыми составляло 2,8 (рис. 14).

Рис. 14 – Моделирование процесса переноса водорода между эмиттером и His22.

Табл. 7 – Длины волны флуоресценции в зависимости от положения протона Расстояние Епер,, В спектре флуоресценции данные длины волн не наблюдаются, это связанно с тем, что перемещение на расстояние более 1,8 требует дополнительных затрат энергии.

Таким образом, процесс флуоресценции Са2+-разряженного обелина хорошо моделируется перемещением протона от кислорода фенольной группы CLM до азота аминокислоты His22. Вероятнее всего, что аналогичный процесс имеет место и при биолюминесцентной реакции фотопротеинов. По-видимому, спектр биолюминесценции также определяется положением протона между атомом кислорода фенольной группы CLM в возбужденном состоянии и атомом азота His22.

С помощью квантово-химических методов было проанализировано влияние ближайшего аминокислотного окружения на длину волны излучения нейтральной формы целентерамида. При расчете CLZ без окружения длина волны излучения составляет 375 нм. Присутствие аминокислотного окружения сдвигает длину волны на 6 нм (381 нм). Особенно сильное влияние наблюдается от молекул воды, His22, Trp92. Каждая из этих аминокислот по отдельности сдвигает длину волны на 1-2 нм (376-377 нм), а при совместном присутствии – на 4 нм (379 нм). Можно сделать вывод, что, хотя аминокислотное окружение не связано с центральной молекулой целентерамида, оно электростатически действует на него, сдвигая длину волны.

ВЫВОДЫ

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:

1. Проведены расчеты различных изомерных форм целентеразина методами одноэлектронного приближения и с учетом электронных корреляций. Показано, что учет электронных корреляций дает структуру более близкую к экспериментальной и позволяет выбрать форму целентеразина CLZ(1H) как наиболее вероятную из возможных изомерных форм. Целентеразин в протонных растворителях находится в изомерной форме CLZ(1Н), в апротонных – в форме CLZ(7Н). Образование формы CLZ(2H) в растворителях не происходит. В отличие от растворителей, в белке обелине целентеразин находится в форме CLZ(2H). Активация целентеразина молекулой кислорода с образованием молекулы HP-CLZ возможна только для структуры CLZ(2H). Изомерная форма CLZ(2H) может образовываться только при захвате целентеразина белковым окружением.

2. Показано, что ван-дер-ваальсово взаимодействие влияет на процесс формирования НP-CLZ. Присутствие полярной молекулы, которая благодаря индукционному эффекту перераспределяет заряды в молекуле целентеразина, приводит к стабилизации комплекса «CLZ-O2». Рассчитана энергия активации реакции образования НP-CLZ. Барьер для реакции составляет 68 кДж/моль, Н = кДж/моль, что хорошо согласуется с экспериментальными данными: Еакт = 57, кДж/моль, Н = 55 кДж/моль.

3. Построена физическая модель флуоресценции фотопротеина обелина, в которой рассчитаны электронные структуры молекул CLM в основном и возбужденном состояниях с учетом электронных корреляций методом конфигурационного взаимодействия. Рассмотрено пять возможных вариантов возбужденных состояний CLM в процессе флуоресценции. Показано, что экспериментально наблюдаемая длина волны излучения 500 нм соответствует «комплексу с переносом протона» между кислородом целентерамида и гистидином His22.

1. Tomilin F.N., Antipina L.Yu., Vysotski E.S., Ovchinnikov S.G., Gitelzon I.I.

Fluorescence of Calcium-Discharged Obelin: The Structure and Molecular Mechanism of Emitter Formation. // Doklady Biochemistry and Biophysics, Vol. 422. – 2008. – P. 279– 284.

2. Томилин Ф. Н., Антипина Л.Ю., Высоцкий Е.С., Овчинников С.Г., Гительзон И.И. Механизм формирования эммитера флуоресценции кальцийразряженного обелина. // Биофизика, том 54, вып. 4. – 2009. – С. 630-637.

3. Овчинников C. Г., Антипина Л. Ю., Томилин Ф. Н., Кузубов А. А. Влияние электронных корреляций на структуру субстратов фотопротеинов // Письма в ЖЭТФ, Т. 91, № 9. – 2010. – С. 536 – 540.

4. Tomilin F. N., Antipina L. U., Eremeeva E.V., Ovchinnikov S. G., Vysotski E. S.

Quantum chemical study of mechanism of active photoprotein generation // Luminescence, Vol. 25, No. 2. – 2010. – P. 210- 5. Tomilin F.N., Antipina L.U., Ovchinnikov S.G., Vysotski E.S. The theoretical studies of light emitters in bioluminescence of Ca2+-regulated photoprothin obelin // Luminescence, March-April 2008, V.23, Issue № 2, P. 96.

6. Томилин Ф.Н., Антипина Л.Ю., Высоцкий Е.С., Овчинников С.Г.

Исследование реакции образования гидроперекиси целентеразина Са2+регулируемого фотопротеина Obelia Longissima // Сборник материалов IV школысеминара молодых ученых «Квантово-химические расчеты: структура и реакционная способность органических и неорганических молекул», Иваново, 20- мая 2009, стр. 166-169.

7. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г. Теоретическое изучение люминесценции Са2+-регулируемого фотопротеина обелина // НКСФ-XXXVI (2007), тезисы докладов научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых физиков. Красноярск, 13-14 апреля 2007 г. КГУ. Стр. 77.

8. Антипина Л.Ю., Качин С.В., Томилин Ф.Н. Квантово-химическое изучение биолюминесценции Са2+-регулируемого фотопротеина обелина // Тезисы VIII Всероссийской научно-практической конференции студентов и аспирантов «Химия и Химическая технология в XXI веке», 14-15 мая 2007г., Томск, ТПУ. С. 251-252.

9. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г. Теоретическое изучение флуоресценции в Са2+-регулируемом фотопротеине обелине // Тезисы ХХ зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии», Москва, 11-15 февраля 2008г. C. 10. Томилин Ф., Антипина Л., Высоцкий Е., Овчинников С. Квантовохимическое моделирование процесса флуоресценции кальций-разряженного обелина // Тезисы V съезда Российского фотобиологического общества, международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Пущино, 8-13 июня 2008г. C. 11. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г., Высоцкий Е.С.

Изменение структуры субстратов белков, выделенных из Obelia Longissima и Renilla Muelleri // Тезисы 12-ой международной пущенской школы-конференции молодых ученых «Биология в XXI веке, Пущино, 10 – 14 ноября 2008, стр. 12. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г., Высоцкий Е.С.

Исследование механизма получения субстрата белков Obelia Longissima и Renilla Muelleri // Тезисы ХХ Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, 15сентября 2008, стр. 13. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г., Высоцкий Е.С.

Теоретическое изучение процесса активации кислородом субстрата фотопротеина обелина // Тезисы XXI Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, сентября – 06 октября 2009, стр. 313.

14. Антипина Л.Ю., Томилин Ф.Н., Овчинников С.Г., Высоцкий Е.С. Влияние аминокислотного окружения на длину волны целентеразина, выделенного из Obelia Longissima // Тезисы 13-ой международной пущенской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 28 сентября – 02 октября 2009, стр. Формат 60х84х16. Усл.печ.л. 1. Тираж 60 экз. Заказ № Отпечатано в типографии Института физики СО РАН 660036, Красноярск, Академгородок 50, стр. 38, ИФ СО РАН



Похожие работы:

«Кабанов Игорь Александрович ПРИМЕНЕНИЕ СВЕРХПРОВОДНИКОВОГО ИНДУКЦИОННОГО НАКОПИТЕЛЯ ЭНЕРГИИ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ СТАТИЧЕСКОЙ И ДИНАМИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЭЛЕКТРОЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ Специальность 05.14.02. – Электростанции и электроэнергетические системы Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Санкт-Петербург – 2001 Работа выполнена на кафедре Электрические системы и сети СанктПетербургского государственного технического университета Научный...»

«УДК 81-139:378 Чичерина Наталья Васильевна КОНЦЕПЦИЯ ФОРМИРОВАНИЯ МЕДИАГРАМОТНОСТИ У СТУДЕНТОВ ЯЗЫКОВЫХ ФАКУЛЬТЕТОВ НА ОСНОВЕ ИНОЯЗЫЧНЫХ МЕДИАТЕКСТОВ Специальность: 13.00.02 – теория и методика обучения и воспитания (иностранный язык, уровень профессионального образования) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора педагогических наук Санкт-Петербург 2008 Работа выполнена на кафедре современных языков и методики преподавания иностранных языков Поморского...»

«Каримова Регина Айратовна ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛИРОВАНИЯ ТРУДА ТВОРЧЕСКИХ РАБОТНИКОВ РЕДАКЦИЙ СРЕДСТВ МАССОВОЙ ИНФОРМАЦИИ Специальность 12.00.05 – трудовое право; право социального обеспечения Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Екатеринбург - 2009 2 Работа выполнена на кафедре трудового права государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Уральская государственная юридическая академия Научный...»

«Нгуен Ле Линь О НЕЛОКАЛЬНЫХ ЗАДАЧАХ СОБОЛЕВА 01.01.02 — дифференциальные уравнения, динамические системы и оптимальное управление АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва - 2012 Работа выполнена на кафедре высшей математики факультета физикоматематических и естественных наук Российского университета дружбы народов. Научные руководители: Стернин Борис Юрьевич, доктор физико-математических наук, профессор, Российский...»

«ХРУНДИН ДМИТРИЙ ВИКТОРОВИЧ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ЖЕЛЕЙНОЙ НАЧИНКИ НА ОСНОВЕ ИЗУЧЕНИЯ И РЕГУЛИРОВАНИЯ СВОЙСТВ ПЕКТИНОВ Специальность 05.18.01 – Технология обработки, хранения и переработки злаковых, бобовых культур, крупяных продуктов, плодоовощной продукции и виноградарства АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2009 Работа выполнена на кафедре технологии пищевых производств Федерального государственного образовательного...»

«АДАМ МБОДУ АДАМ УПРАВЛЕНИЕ ПРИРОДНЫМИ РЕСУРСАМИ РЕСПУБЛИКИ ЧАД: НА ПРИМЕРЕ ПРОЕКТА ЧАД/КАМЕРУН Специальность 08.00.14 - Мировая экономика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Москва – 2011 2 Работа выполнена на кафедре международных экономических отношений экономического факультета Российского университета дружбы народов. Научный руководитель : доктор экономических наук, профессор Волгина Наталья Анатольевна Официальные оппоненты :...»

«Гузанова Елена Владимировна НЕЙРОПСИХОЛОГИЧЕСКИЕ РАССТРОЙСТВА И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ КОРРЕКЦИИ У БОЛЬНЫХ СПАСТИЧЕСКОЙ КРИВОШЕЕЙ 14.00.13. – нервные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики Государственного образовательного учреждения Высшего профессионального образования Нижегородская Государственная медицинская академия НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:...»

«Ктиторов Лев Владимирович Динамика безударного сжатия газа в цилиндрических слоистых мишенях для ИТС Специальность 01.02.05 – механика жидкости, газа и плазмы Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2010 Работа выполнена в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова Научные руководители: член-корреспондент РАН, доктор физико-математических наук, профессор Забродин Алексей Валериевич доктор...»

«ХЛЫБОВ СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ ВЛИЯНИЕ ФАЗОВОГО ПЕРЕХОДА В СВЕРХТОНКИХ ПЛЕНКАХ ЖИДКИХ КРИСТАЛЛОВ НА ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКИЕ И ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Специальность 01.04.07 физика конденсированного состояния АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре общей физики и молекулярной электроники физического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова. Научный руководитель :...»

«Козаченко Лев Иванович Уточнение рекомендаций по оптимальному проектированию центробежных компрессорных ступеней на основе экспериментального исследования Специальность 05.04.06 – Вакуумная, компрессорная техника и пневмосистемы Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Санкт-Петербург 2004 Работа выполнена на кафедре Компрессорная вакуумная и холодильная техника в ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет...»

«Акмурзина Валентина Александровна ПОИСК ЛИПИДНЫХ МАРКЕРОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РИСКОМ РАЗВИТИЯ ПОЗДНИХ ОСЛОЖНЕНИЙ САХАРНОГО ДИАБЕТА 1 ТИПА Специальность 02.00.10 – Биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре Биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова и на Биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова...»

«Фесенко Алексей Николаевич НОВЫЕ МЕТОДЫ СЕЛЕКЦИИ ГРЕЧИХИ (Fagopyrum esculentum Moench.) Специальность 06.01.05 – Селекция и семеноводство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург - 2009 Диссертационная работа выполнена в 1995.2008 гг. в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур Россельхозакадемии Официальные оппоненты : доктор биологических наук...»

«Величко Михаил Юрьевич ИНФОРМАЦИОННАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ В ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ОРГАНОВ ВНУТРЕННИХ ДЕЛ: ТЕОРЕТИКО-ПРАВОВОЙ АСПЕКТ Специальность 12.00.01 – теория и история права и государства; история учений о праве и государстве Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Казань - 2007 2 Работа выполнена на кафедре теории и истории государства и права Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский...»

«Нестеров Юрий Евгеньевич Алгоритмическая выпуклая оптимизация Специальность 01.01.07 - вычислительная математика Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук МОСКВА - 2013 Работа выполнена в Лаборатории структурных методов анализа данных в предсказательном моделировании (ПреМоЛаб) Московского физико-технического института (государственного университета) Официальные оппоненты : доктор физико-математических наук, профессор, академик РАН...»

«ГРИДНЕВ Алексей Кузьмич СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА МАСЛИЧНЫХ КУЛЬТУР НА ПРИМЕРЕ СОИ И ПОДСОЛНЕЧНИКА специальность: 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Краснодар – 2012 Работа выполнена в государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте масличных культур имени В.С. Пустовойта Российской академии...»

«АЛЬ-РАДИ ЛЮБОВЬ САТТАРОВНА ВОЛОСАТОКЛЕТОЧНЫЙ ЛЕЙКОЗ: ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ, СОВРЕМЕННАЯ ТАКТИКА ТЕРАПИИ 14.00.29 – гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2007г Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор...»

«ИСАЕВА Ирина Сергеевна ИНДИВИДУАЛЬНО-ТИПОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОБЩИТЕЛЬНОСТИ И АГРЕССИВНОСТИ КУРСАНТОВ ВОЕННОГО ВУЗА Специальность 19.00.01 – общая психология, психология личности, история психологии Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата психологических наук МОСКВА – 2008 Работа выполнена на кафедре психологии личности, специальной психологии и коррекционной педагогики Рязанского государственного университета имени С.А. Есенина Научный руководитель :...»

«Булаева Евгения Александровна РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ПРИМЕНЕНИЯ СПУТНИКОВОГО МЕТОДА ДЛЯ ГЕОДЕЗИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СОСТОЯНИЯ ГЕОЛОГИЧЕСКОЙ СРЕДЫ И ГИДРОТЕХНИЧЕСКИХ СООРУЖЕНИЙ Специальность 25.00.32 – Геодезия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук МОСКВА-2013 2 Работа выполнена на кафедре Астрономии и космической геодезии Московского государственного университета геодезии и картографии (МИИГАиК). Научный руководитель :...»

«Громов Владимир Игоревич ГЕНДЕРНЫЕ И ПРОФЕССИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВОСПРИЯТИЯ ПОЛИТИЧЕСКОЙ ТЕЛЕВИЗИОННОЙ РЕКЛАМЫ СТУДЕНЧЕСКОЙ АУДИТОРИЕЙ Специальность: 19.00.05 – социальная психология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата психологических наук Самара – 2005 Работа выполнена на кафедре социальной психологии Самарского государственного педагогического университета Научный руководитель : доктор психологических наук, профессор Акопов Гарник Владимирович...»

«Илларионов Андрей Анатольевич Статистические свойства полиэдров Клейна и локальных минимумов решеток 01.01.06 — математическая логика, алгебра и теория чисел Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Хабаровск – 2014 Общая характеристика работы Актуальность темы. Алгоритм разложения вещественного числа в непрерывную (цепную) дробь является одним из важнейших инструментов теории чисел, восходящим еще к античному алгоритму Евклида...»








 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.