WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

СУЛАЦКАЯ

Анна Игоревна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТИОФЛАВИНА Т С АМИЛОИДНЫМИ ФИБРИЛЛАМИ:

МЕХАНИЗМ ВСТРАИВАНИЯ, ПАРАМЕТРЫ СВЯЗЫВАНИЯ, ИЗМЕНЕНИЕ

ФОТОФИЗИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК КРАСИТЕЛЯ

03.01.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2013 2

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук (ИНЦ РАН), Санкт-Петербург доктор биологических наук Научные руководители:

Ирина Михайловна КУЗНЕЦОВА, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург доктор физико-математических наук Константин Константинович ТУРОВЕРОВ, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург доктор физико-математических наук

Официальные оппоненты:

Андрей Леонидович ТИМКОВСКИЙ Федеральное государственное бюджетное учреждение Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова, Санкт-Петербург доктор биологических наук Алексей Николаевич Скворцов Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный политехнический университет»

Федеральное государственное бюджетное

Ведущая организация:

учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.

Баха Российской академии наук

Защита диссертации состоится "28" июня 2013 года в 12 ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе ИНЦ РАН по адресу: 194064, СанктПетербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Электронный адрес: [email protected] Факс: 8(812) 297-35-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНЦ РАН.

Автореферат разослан "27" мая 2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е. В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Вопрос о том, как полипептидная цепь глобулярных белков сворачивается в уникальную, компактную, высокоорганизованную, функциональноактивную структуру, является одним из центральных вопросов физико-химической и клеточной биологии. Уже давно было замечено, что при сворачивании белков могут возникать частично-свернутые состояния, содержащие элементы структуры, которых нет в нативном белке и возникновение которых определяет склонность белка к образованию агрегатов. Кроме того, необходимо учитывать, что жизненный цикл белка проходит в условиях густонаселенной среды клетки, т.е. в условиях молекулярного краудинга, что стимулирует процессы, приводящие к увеличению доступного клеточного объема, в том числе процессы агрегации белков.2, Долгое время процессам агрегации белков при фолдинге не уделялось должного внимания. Ситуация резко изменилась, когда стало очевидным, что возникновение упорядоченных агрегатов – амилоидных фибрилл сопряжено с возникновением многих тяжелых заболеваний, таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, прионные заболевания и др., которые часто называют "конформационными болезнями".4-10 Дальнейшие исследования показали, что образование амилоидных фибрилл – свойство, присущее не только тем белкам, фибриллогенез которых связан с возникновением болезней, но и многим другим (если не всем) белкам.11-15 Оказалось также, что, несмотря на многообразие структур амилоидогенных белков, все амилоидные фибриллы имеют сходную архитектуру: они представляют собой неразветвленные образования, богатые бета-складчатой структурой, в которой антипараллельные бета-листы направлены перпендикулярно оси фибриллы.16,17 В связи с этим долгое время считалось, что структура амилоидных фибрилл, полученных на основе разных белков, идентична. Впоследствии, однако, оказалось, что это не совсем так: были обнаружены различия в структуре амилоидных фибрилл на основе различных амилоидогенных белков18,19 и даже фибрилл, полученных при разных условиях на основе одного и того же белка. Поскольку фибриллярное состояние, обогащенное бета-складчатыми структурами, повидимому, является одним из основных состояний белковой молекулы, исследование амилоидных фибрилл актуально для решения фундаментальной проблемы фолдинга белков.

Для диагностики возникновения амилоидных фибрилл in vivo и in vitro давно и эффективно используется бензтиазольный краситель тиофлавин Т (ThT).20-27 Это обусловлено высокой специфичностью взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами. Краситель не взаимодействует с белками в нативном состоянии (за исключением ацетилхолинэстеразы и сывороточных альбуминов), с белками в развернутом и промежуточных частично-свернутых состояниях, а также с аморфными агрегатами белков. При взаимодействии с белками в состоянии амилоидных фибрилл, его квантовый выход флуоресценции возрастает в несколько тысяч раз, тогда как свободный краситель в водном растворе имеет очень низкий квантовый выход флуоресценции. Несмотря на широкое использование ThT в качестве флуоресцентного зонда до сих пор нет единого мнения о механизме встраивания ThT в амилоидные фибриллы и о фотофизических свойствах этого красителя.28, В последнее время стало очевидно, что ThT можно использовать не только для диагностики образования амилоидных фибрилл, но и для изучения их структуры. В связи с этим актуальной задачей является определение параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами.

';

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследовании взаимодействия флуоресцентного зонда ThT с амилоидными фибриллами, полученными на основе различных белков. В задачи исследования входило:

1. Изучение спектральных свойств свободного и связанного с амилоидными фибриллами ThT и выяснение причин возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы.

2. Определение механизма встраивания ThT в амилоидные фибриллы.

3. Разработка методики определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами (числа центров связывания с различным сродством к ThT (мод связывания), констант связывания и числа мест связывания) и фотофизических свойств красителя, связанного с амилоидными фибриллами (спектров поглощения, коэффициентов молярной экстинкции и квантового выхода флуоресценции).

4. Получение амилоидных фибрилл на основе различных амилоидогенных белков и сравнение их структуры с использованием разработанного подхода.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. «Коротковолновые» полосы флуоресценции (max=440 нм) и возбуждения флуоресценции (max=340 нм) водных растворов ThT обусловлены тем, что часть молекул имеет конформацию с нарушенной системой -сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец красителя.

2. Максимум спектра поглощения ThT, встроенного в амилоидные фибриллы, сдвинут относительно максимума спектра поглощения свободного ThT в водном растворе (max= нм) в длинноволновую область, в то время как максимумы спектров флуоресценции свободного и связанного с фибриллами красителя близки (max=480 нм).

3. Значение квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы определяется не только подвижностью фрагментов молекулы ThT (бензтиазольного и аминобензольного колец) друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и конформацией молекул красителя в основном состоянии.

4. Существующие предположения об образовании димеров или мицелл молекулами ThT в водном растворе и при встраивании в амилоидные фибриллы не обоснованы. ThT встраивается в амилоидные фибриллы в мономерной форме.

5. Метод, основанный на абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с использованием равновесного микродиализа, позволяет определить параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами, а также фотофизические характеристики связанного красителя. Предложенный подход может быть использован для сравнительного изучения структуры амилоидных фибрилл.

Научная новизна работы. Результаты исследования позволили по-новому взглянуть на фотофизические свойства свободного и связанного с амилоидными фибриллами ThT. Дано новое объяснение существованию «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ThT в водных растворах. Сделано заключение о том, что эти аномальные полосы обусловлены наличием в растворе молекул ThT с нарушенной системой сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец. Измерение интенсивности флуоресценции ThT в водно-глицериновых смесях позволило пересмотреть существующие представления о причинах возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при его встраивании в амилоидные фибриллы. Впервые показано, что значение квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы обусловлено не только подвижностью бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы ThT друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и ее конформацией в основном состоянии. Были проанализированы существующие гипотезы о механизме встраивания ThT в амилоидные фибриллы и сделано заключение о том, что краситель встраивается в фибриллы в мономерной форме, а предположения об образовании им димеров и мицелл не обоснованы.

Впервые для определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами использован метод, основанный на прямом спектрофотометрическом определении концентрации свободного и связанного с фибриллами красителя в растворах, полученных методом равновесного микродиализа. Этот подход позволяет также определять спектры поглощения, коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции ThT (при измерении интенсивности флуоресценции тех же растворов), взаимодействующего с сайтами каждой из мод связывания.

Показано что, параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида и характеристики встроенного в них красителя существенно различаются. Подход, разработанный в настоящей работе, может быть использован для изучения полиморфизма амилоидных фибрилл и сравнительного изучения структуры амилоидных фибрилл, полученных на основе различных белков.

Теоретическое и практическое значение работы. В связи с эффективным применением ThT в качестве флуоресцентного зонда и перспективами его использования для изучения структуры амилоидных фибрилл, а его аналогов – в качестве терапевтических агентов, выяснение специфических особенностей этого красителя и формирование представлений о его фотофизических свойствах имеет существенное теоретическое и практическое значение.

Разработка специальной методики, позволяющей получать информацию о параметрах связывания ThT с амилоидными фибриллами, а также о спектральных свойствах и квантовом выходе флуоресценции связанного красителя, является важным шагом на пути изучения структуры амилоидных фибрилл, что, в свою очередь, может дать важнейшую информацию для выяснения факторов, способствующих фибриллообразованию, и о механизмах этого процесса. Таким образом, результаты проведенной работы могут быть существенны для понимания фундаментальных основ фолдинга и агрегации (нарушения фолдинга) белков.

Проведенные исследования имеют существенное прикладное значение в виду широкого распространения заболеваний, вызванных или сопровождающихся образованием амилоидных фибрилл. Показано, что образованием амилоидных бляшек сопровождаются все нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона, Пика. Известны также амилоидозы, которые не связаны напрямую с основным заболеванием, а являются осложнениями лечебных мероприятий. К этому виду патологии можно отнести инсулиновый амилоидоз и так называемый гемодиализный амилоидоз, которые приводят к существенному снижению качества жизни больных. Изучение взаимодействия флуоресцентных красителей с амилоидными фибриллами может рассматриваться как перспективный подход для создания биосенсорных систем для ранней диагностики заболеваний, сопровождаемых различного рода амилоидозами.

Поскольку разработанный нами подход к исследованию взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами универсален, он может быть востребован в молекулярной фармакологии при определении параметров связывания белков с активными веществами (лигандами), в том числе с лекарствами. В частности, чрезвычайно важно правильное определение константы связывания красителей, способных преодолевать гематоэнцефалический барьер. Кроме того, результаты работы могут быть использованы для анализа взаимодействия амилоидных фибрилл с химическими веществами (в том числе нефлуоресцирующими), которые способны подавлять процесс образования амилоидных фибрилл.

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.

Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры и обработка результатов выполнены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на 37-й и 38-й Неделе науки СПбГПУ (Санкт-Петербург, 2008, 2009), Политехническом симпозиуме: «Молодые учёные – промышленности Северо-Западного региона», (Санкт-Петербург, 2008, 2010); XIII Европейской конференции спектроскопии биологических молекул (Италия, 2009), II и III Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010, 2012); 6-й и 8-й Санкт-Петербургской конференции молодых ученых (СанктПетербург, 2010, 2012), III Конференции "Современные проблемы молекулярной биофизики" (Санкт-Петербург, 2011), 17-м Международном биофизическом конгрессе (Китай, 2011), VІ Международной научной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы» (Украина, 2011), 37-м Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (Испания, 2012) и семинарах Лаборатории структурной динамики, стабильности и фолдинга белков ИНЦ РАН.

По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ, в том числе 11 статей в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке программы президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Министерства образования и науки (Соглашение № 14.132.21.1311), Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 07-04-01454, 08-04-90052_Бел, 10-04-90038_Бел, 12-04-01651, 12-04-90022_Бел, 13Президента РФ (стипендия № СП – 776.2012.4), фонда «Династия»

(грант № ДП-Б-35/10) и Правительства Санкт-Петербурга (гранты ПСП № 10652, ПСП № 11566, ПСП № 12360).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из Введения, трех Глав, Выводов, Списка публикаций по теме диссертации и Списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. Для проведения исследований были использованы следующие материалы:

ThТ (Sigma-Aldrich and AnaSpec, США), ATTO-425 (ATTO-TEC, Германия), глицерин (Merk, Германия), ацетилхолинэстераза Electrophorus electricus (AChE), инсулин, уксусная кислота и NaCl (Sigma, США), лизоцим (Fluka, США), Абета-пептид (GL Biochem Ltd., China), KH2PO и NaOH (Реахим, Россия), GdnHCl (ICN Biomedicals, США).

Подготовка образцов. Амилоидные фибриллы на основе инсулина получали путем инкубирования инсулина (10 мг/мл) в 20%-ной уксусной кислоте в присутствии 100 мМ NaCl (рН 2.0) при температуре 37° С и интенсивном перемешивании в течение 24 ч.30 Амилоидные фибриллы на основе лизоцима получали путем инкубирования лизоцима (2 мг/мл) в 0.05 М буфере KH2PO4-NaOH в присутствии 3М GdnHCl, рН 6.3 при температуре 50° С и интенсивном перемешивании в течение 24 ч.31 Концентрацию GdnHCl проверяли рефрактометрически с использованием рефрактометра Abbe фирмы Ломо. Амилоидные фибриллы на основе Абета-пептида получали путем инкубирования Абета-пептида (2 мг/мл) в 50%-ном hexafluoro-2propanol (HFIP)/H2O и 0.02%-ном азиде натрия в течение 7 сут.32 Затем HFIP был выпарен в потоке азота, и образцы инкубировались при постоянном перемешивании еще 7 сут. AChE была растворена в 40 мМ фосфатном буфере (pH 7.0) в концентрации 1.5 мг/мл. Измерение спектров поглощения было выполнено с использованием спектрофотометра U-3900H (Hitachi, Япония). Для того чтобы охватить широкий диапазон концентраций красителя измерения проводились в кюветах фирмы Helma (Германия) c разной длиной оптического пути (0.1, 0.2, 0.5, 1, 5 см).

При обработке измеренных спектров поглощения растворов ThT с амилоидными фибриллами исключение из зарегистрированного спектра кажущейся оптической плотности, обусловленной светорассеянием амилоидных фибрилл, проводили с помощью стандартной процедуры. Измерение спектров флуоресценции проводили с использованием спектрофлуориметрической установки собственного изготовления и установки фирмы Cary Eclipse (Varian, Австралия) со стационарным возбуждением. Для определения квантового выхода ThT в качестве эталона был использован раствор флуоресцентного красителя ATTO-425 (ATTO) с известным квантовым выходом флуоресценции (0.9), спектры поглощения и флуоресценции которого по положению совпадают со спектрами ThT. Флуоресценция ThT и ATTO возбуждалась при длине волны 450 нм, а регистрировалась при длине волны 480 нм.

При определении квантового выхода флуоресценции ThT в водно-глицериновых смесях была учтена зависимость коэффициента молярной экстинкции красителя и коэффициента преломления раствора от вязкости раствора.35 Вязкость водно-глицериновых смесей была определена на основании данных о концентрации глицерина, полученных рефрактомерически с использованием рефрактометра Abbe фирмы LOMO.

Равновесный микродиализ проводился с использованием приспособления фирмы Harvard Apparatus/Amika (USA), которое состоит из двух камер равного объема (500 мкл), разделенных мембраной. В одну из камер помещались амилоидные фибриллы в буфере, в котором они были получены, в другую – краситель в том же растворителе. При проведении экспериментов использовали мембраны, непроницаемые для частиц c молекулярной массой больше 10000 Da.

Метод электронной микроскопии был использован для визуализации амилоидных фибрилл. Эксперименты были выполнены с использованием электронного микроскопа Carl Zeiss Libra 120. Для негативного контрастирования препаратов использовали 1%-ный водный раствор уранил-ацетата (Миронов и др. 1994). Белок наносили на медные сетки, покрытые коллодиевой пленкой-подложкой, напыленной углем.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на широкое и эффективное использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т (ThT) в качестве флуоресцентного зонда в тот момент, когда мы начинали эту работу, не существовало однозначного представления о причинах возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в фибриллы, о его спектральных свойствах, а также о способах связывания ThT с амилоидными фибриллами.28,29 В связи с этим целью данной работы стало исследование взаимодействия флуоресцентного зонда ThT с амилоидными фибриллами, полученными на основе различных белков.

Спектральные свойства ThT и механизм связывания красителя с амилоидными фибриллами Объяснение существования коротковолновых спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции красителя в водном растворе. В первых работах, посвященных исследованию спектральных свойств ThT, было отмечено, что спектры возбуждения флуоресценции и спектры флуоресценции красителя, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, существенно сдвинуты в длинноволновую сторону по сравнению с аналогичными спектрами для свободного красителя в водном растворе (рис.1, б). В связи с этим рядом авторов были выдвинуты предположения о том, что длинноволновый сдвиг спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции, а также высокое значение квантового выхода флуоресценции ThT, инкорпорированного в амилоидные фибриллы, обусловлены димерами или даже мицеллами молекул красителя.28, Однако коротковолновый спектр возбуждения флуоресценции ThT в воде не совпадает с длинноволновой полосой спектра поглощения красителя, как это должно быть, а сдвинут относительно длинноволновой полосы поглощения в коротковолновую область так, что максимум спектра возбуждения приходится на минимум в спектре поглощения. При этом спектр возбуждения флуоресценции ThT, связанного с амилоидными фибриллами, спектрально совпадает с длинноволновой полосой поглощения свободного красителя в водном растворе (рис. 1, б). Таким образом, специального объяснения требует не длинноволновое положение спектров возбуждения флуоресценции и спектров флуоресценции ThT в фибриллах, а коротковолновые спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции ThT в водном растворе. Для того чтобы понять природу аномальных коротковолновых спектров красителя в водном растворе, необходимо обратить внимание на тот факт, что молекула ThT относится к классу молекулярных роторов, поскольку бензтиазольное и аминобензольное кольца красителя способны поворачиваться друг относительно друга (рис.1, а). Согласно результатам квантово-химических расчетов, наличие метильной группы у атома азота бензтиазольного кольца красителя препятствует существованию строго планарной конформации колец красителя.36 Стерическое взаимодействие этой группы с атомом водорода бензольного кольца определяет существование энергетического барьера при конформации с углом между бензтиазольным и аминобензольным кольцами, равным 0° (180°) (рис.1, в). Существование энергетического барьера при =90° (270°) связано с нарушением сопряжения между бензтиазольным и аминобензольным кольцами ThT. Результаты квантово-химических расчетов свидетельствуют о том, что в основном состоянии минимуму энергии соответствует конформация красителя с углом между кольцами, равным 37° (145°, 217°, 325° и т.д.), а максимуму Рис. 1. (а) Структура молекулы ThT: I – бензтиазольное кольцо, II – аминобензольное кольца, III - диметиламино группа, (б) Спектры поглощения (кривые черного цвета), возбуждения флуоресценции (кривые синего цвета) и флуоресценции (кривые красного цвета) ThТ в водном растворе (верхняя панель) и при инкорпорации в амилоидные фибриллы (нижняя панель), (в) Зависимость энергии молекулы ThT в основном состоянии от угла между бензтиазольной и аминобензольной группами (красным показаны данные для ThT, зеленым – для аналога ThT с заменой метильной группы атомом водорода). энергии – с углом между кольцами, равным =0° и 90° (180°, 270° и т.д.). Наличием метильной группы можно объяснить относительно низкие величины энергетических барьеров при =0° и 90°(180°, 270° и т.д.). Это означает, что часть молекул ThT имеет в основном состоянии конформацию с нарушенной системой -сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец, которые в этом случае выступают в качестве отдельных хромофоров.

Увеличение размера системы -связей, как известно, сопровождается длинноволновым сдвигом спектра, поэтому любой изолированный фрагмент ThT должен иметь более коротковолновое положение спектров поглощения и флуоресценции по сравнению с целой молекулой красителя. Таким образом, появление коротковолновых спектров возбуждения флуоресценции и спектров флуоресценции ThT обусловлено существованием в основном состоянии фракции молекул красителя с, близкими к 90° (270°). Коротковолновую флуоресценцию можно зарегистрировать только в растворах с низкой вязкостью, когда интенсивность длинноволновой флуоресценции ThТ низка. При встраивании в амилоидные фибриллы происходит существенное увеличение квантового выхода длинноволновой флуоресценции (из-за ограничения вращения фрагментов ThT друг относительно друга), на фоне которой коротковолновая флуоресценция становится незаметной.

Флуоресцентные свойства ThT в растворителях с различной вязкостью и температурой. Причины возрастания квантового выхода флуоресценции ThT при его встраивании в амилоидные фибриллы. Были измерены зависимости квантового выхода флуоресценции ThT от вязкости водно-глицериновых смесей (содержание глицерина изменялось от 13 до 99%) и от температуры растворов T (от 3 до 50° C). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что нагревание раствора или уменьшение его вязкости сопровождается существенным уменьшением квантового выхода флуоресценции ThT. Это означает, что существует процесс безызлучательной дезактивации возбужденного состояния молекулы ThT, величина константы которого зависит от температуры и вязкости растворителя.

Согласно данным квантово-химических расчетов минимуму энергии в возбужденном состоянии соответствует конформация молекул красителя с углом = 90 (270)°. Такие молекулы с высокой вероятностью переходят в основное состояние безызлучательно. Мы полагаем, что возможность перехода молекул в такую конформацию (а значит, и величина квантового выхода флуоресценции) обусловлена поворотом фрагментов молекул красителя друг относительно друга в возбужденном состоянии. Линейный характер зависимости квантового выхода флуоресценции от температуры и вязкости растворителя, представленной в координатах (1/q-1) от T/ (рис. 2), подтвердил нашу гипотезу о том, что возрастание квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы обусловлено ограничением подвижности колец красителя друг относительно друга в возбужденном состоянии.

Кроме того, полученные данные (рис. 2 (вставка)) свидетельствуют о том, что квантовый выход флуоресценции ThT в жестких изотропных растворах (Т 0, ), ограничивающих подвижность фрагментов красителя друг относительно друга в возбужденном состоянии, существенно меньше 1.0 (составляет 0.28). Мы полагаем, что это обусловлено безызлучательной дезактивацией возбужденного состояния молекул ThT, имеющих в основном состоянии (при поглощении света) непланарную конформацию. Вероятность безызлучательного перехода таких молекул в основное состояние будет тем выше, чем ближе значение угла к 90°. В связи с этим было сделано предположение (получившее затем экспериментальное подтверждение37) о том, что поскольку конформация красителя, встроенного в амилоидные фибриллы, может существенно отличаться от его конформации в жестких изотропных средах, величина квантового выхода флуоресценции связанного ThT может быть как больше, так и меньше 0.28.

Модель встраивания ThT в амилоидные фибриллы. В ряде работ, посвященных изучению спектральных свойств ThT, существуют противоречивые гипотезы о том, что длинноволновое положение спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции и высокое значение квантового выхода флуоресценции ThT, инкорпорированного в амилоидные фибрилq- Рис 2. Зависимость квантового выхода флуоресценции ThT от температуры и вязкости растворителя; на вставке показан участок зависимости, соответствующий низким температурам и высокой вязкости растворителя.

лы, обусловлены димерами или даже мицеллами молекул красителя. Однако мы уже показали, что спектральные свойства и значение квантового выхода флуоресценции ThT, определяются другими причинами.

Нами был проведен ряд дополнительных экспериментов для того, чтобы подтвердить необоснованность гипотезы об образовании ThT димеров и мицелл. Были измерены спектры поглощения растворов ThT в широком диапазоне концентраций красителя (рис. 3, а). Полученные результаты свидетельствуют о том, что положение и форма спектров поглощения, а также величина коэффициента молярной экстинкции ThT в диапазоне концентраций от 7.5·10-6 до 3.7·10-4 М не зависит от концентрации красителя, а значит, образования агрегатов ThT не происходит.

В работе29 на основании того, что зависимость интенсивности флуоресценции ThT от его концентрации, построенная в полулогарифмическом масштабе, имеет точку перегиба (вставка на рис. 3, б), была выдвинута гипотеза об образовании молекулами ThT мицелл.

Нами показано, что зависимость интенсивности флуоресценции ThT от его концентрации, построенная в обычных координатах (рис. 3, б), ничем не отличается от зависимостей для любого другого флуоресцирующего вещества, которые в полулогарифмическом масштабе аналогично будут состоять из двух участков, имеющих существенно различный наклон (вставка на рис. 3, б). Нами сделано заключение, что характер зависимости, представленной в работе29, связан не с агрегацией молекул красителя, а с особенностями представления экспериментальных данных. Это означает, что представления об образовании красителем мицелл в водном растворе и при связывании с амилоидными фибриллами не обоснованы. Наши экспериментальные данные хорошо согласуются с моделью Кребса38, согласно которой ThT Оптическая плотность Рис. 3.(a) спектры поглощения ThT в воде для разных концентраций красителя: от 10- до 10-4 М (кривые 1—5); (б) зависимость интенсивности флуоресценции ThT от концентрации красителя, на вставке эта зависимость представлена в полулогарифмическом масштабе.

в мономерной форме встраивается в бороздки, образованные боковыми цепями аминокислот и ориентированные вдоль оси волокна амилоидных фибрилл перпендикулярно -листам.39- Структурные параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами Выбор подхода для определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами. В последние годы в литературе появилось около десятка работ, в которых предпринимались попытки определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами (см., например, обзор Groenning M.42). Поскольку раствор ThT с амилоидными фибриллами представляет собой равновесную систему свободного и связанного с фибриллами красителя, а флуоресцирует только связанный краситель, казалось бы, при определении параметров связывания можно основываться исключительно на измерении зависимости интенсивности флуоресценции ThT от его концентрации в растворах, содержащих амилоидные фибриллы, как это и делалось ранее. Авторы работ, результаты которых обобщены в обзоре40, основывались на предположении, что измеренная интенсивность флуоресценции всегда пропорциональна концентрации связанного с фибриллами красителя и что эта зависимость выходит на плато, когда все сайты связывания заняты. На самом деле даже теоретическая зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации для любого флуоресцирующего вещества (независимо от присутствия амилоидных фибрилл) не является линейной и представляет собой кривую с насыщением. Более того экспериментально регистрируемая интенсивность флуоресценции может даже уменьшаться с увеличением оптической плотности раствора.

Это происходит за счет того, что при увеличении суммарной оптической плотности все большую часть возбуждающего света поглощают слои раствора, прилегающие к передней стенке кюветы, в то время как приемная система спектрофлуориметра "видит" центральную часть кюветы, до которой доходит все меньшая доля возбуждающего света. Таким образом, зарегистрированные значения интенсивности флуоресценции могут быть использованы для определения параметров связывания только при введении коэффициентов, корректирующих описанные эффекты.

Кроме того, концентрация свободного красителя не равна суммарной концентрации ThT в растворе, как это предполагалось практически во всех работах. Нами было показано, что зависимость интенсивности флуоресценции ThT от общей концентрации красителя в растворе может быть использована только для случая существования одного набора центров с различным сродством к ThT (одной моды связывания). При этом данный подход сам по себе не позволяет оценить число мод связывания красителя. В связи с этим появилась необходимость разработать универсальный подход для определения параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами.43,44 Для решения этой задачи нами впервые был использован прямой метод изучения связывания ThT с амилоидными фибриллами, – метод абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных методом равновесного микродиализа, позволивший впервые определить концентрацию свободного и концентрацию связанного с фибриллами красителя. Применимость предложенного подхода была продемонстрирована при изучении взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами, полученными на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида. Исследуемые амилоидные фибриллы были визуализированы с использованием электронной микроскопии (рис.4).

Определение спектров поглощения ThT, связанного с амилоидными фибриллами.

Равновесный микродиализ был выполнен с использованием приспособления, состоящего из двух камер равного объема, разделенных мембраной, проницаемой для красителя и непроницаемой для фибрилл (рис.5). В одну из камер (#2) помещался раствор красителя с концентрацией (С0), в другую (#1) – амилоидные фибриллы в том же растворителе. Содержание амилоидных фибрилл в камере #1 можно охарактеризовать концентрацией раствора белка, используемого для получения фибрилл с учетом последующего разведения (Сp). Спектр поглощения раствора в камере #2 после достижения равновесия представлял собой спектр пглощения свободного ThT (Df ()), а спектр поглощения раствора в камере #1 – суммарный Рис. 4. Амилоидные фибриллы на основе инсулина (данные электронной микроскопии) через 1.5 (а) и 3 (б) ч. после начала эксперимента (после растворения инсулина в буфере).

Рис. 5. Приспособление для проведения равновесного микродиализа. Показаны две камеры, разделенные мембраной, проницаемой для красителя и непроницаемой для амилоидных фибрилл. Условия проведения эксперимента см. в разделе «Материалы и методы исследования».

Оптическая плотность Оптическая плотность Рис. 6. Определение спектра поглощения ThТ, инкорпорированного в фибриллы на основе инсулина (а), лизоцима (б) и Абета-пептида (в). Кривые 1 и 2 – спектры поглощения раствора ThТ в камере #2 (свободный ThТ в водном растворе) и в камере #1 (наложение спектров свободного и связанного с фибриллами ThT, а также светорассеяния амилоиднных фибрилл). Кривая 3 представляет собой оптическую плотность, которая определяется светорассеянием фибрилл, Кривая 4 – суммарный спектр поглощения свободного и связанного с фибриллами красителя после исключения вклада светорассеяния фибрилл. Кривая 5 - спектр поглощения связанного с фибриллами красителя. Кривая 6 - спектр поглощения свободного красителя в концентрации, равной концентрации связанного красителя.

спектр поглощения свободного ThT (Df ()) и связанного с фибриллами красителя (Db ()) на фоне "кажущегося поглощения", обусловленного светорассеянием фибрилл (Dscat()) (рис.6).

Предлагаемый нами подход позволил впервые определить спектры поглощения ThT, инкорпорированного в фибриллы на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида (рис. 6).

Полученные данные свидетельствуют о том, что спектр поглощения красителя, встроенного в амилоидные фибриллы, является существенно более длинноволновым по сравнению со спектром свободного красителя в водном растворе. Положение спектров поглощения ThT в водном растворе определяется существенным ориентационным диполь-дипольным взаимодействием молекул красителя с молекулами полярного растворителя.

Определение параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами. Для каждого эксперимента по микродиализу были определены концентрация свободного (Сf) и концентрация связанного с фибриллами (Cb) красителя. Для того чтобы получить наглядное представление о количестве мод связывания красителя с фибриллами экспериментальные результаты были представлены в координатах Скетчарда (рис. 7). Нелинейный характер экспериментальных зависимостей однозначно свидетельствует о том, что в фибриллах на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида существуют как минимум две моды связывания (i), с различными значениями константы связывания (Kbi). Концентрация связанного с амилоидными фибриллами красителя определяется соотношением:

где K d i – константа диссоциации, ni – число мест связывания в пересчете на молекулу белка. Величины констант связывания и числа мест связывания, наилучшим образом описывающие экспериментальные данные, были определены в предположении существования двух мод связывания методом множественной нелинейной регрессии. Полученные значения Kb1, Kb2, n1 и n2 приведены на рис. 7. Оказалось, что константы связывания красителя с фибриллами на основе различных белков существенно различаются. Можно отметить, что число мест связывания в пересчете на молекулу белка для всех исследуемых фибрилл меньше единицы. Это означает, что для образования одного места связывания молекулы ThT необходимо взаимодействие нескольких молекул белка, что согласуется с литературными данными.

Нужно отметить, что с использованием предложенного нами подхода было также исследовано взаимодействие ThT с ацетилхолинэстеразой (рис. 7, в). Активный центр этого фермента располагается в углублении, или так называемом «ущелье», в которое, согласно существующим представлениям, встраивается ThT. Полученные нами результаты, свидетельствующие о стехиометрии связывания 1:1, соответствуют этому представлению.45, (Cb/Cp)/Сf.10-5, M- (Cb/Cp)/Cf 10, M Рис. 7. Зависимости Скетчарда, характеризующие связывание ThT с амилоидными фибриллами на основе инсулина (а), лизоцима (б), Абета-пептида (в) и с глобулярным белком ацетилхолинэстеразой (г). На рисунке показаны экспериментальные значения (точки) и расчетные кривые (линии), построенные с использованием констант n1, n2, Kb1 и Kb2, определенных с использованием GraphPad Prizm5.

Определение коэффициентов молярной экстинкции ThT, связанного с амилоидными фибриллами. С использованием полученных значений параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида была определена концентрация красителя, связанного с каждой из мод связывания:

где l – это длина оптического пути, а b1 () и b 2 () – коэффициенты молярной экстинкции красителя, связанного с сайтами каждой из мод связывания, значения b1 () и b 2 () были определены методом множественной линейной регрессии (SigmaPlot) с использованием известных величин Db, C b1 и Cb 2. На рис. 8 показаны спектры поглощения красителя, взаимодействующего с сайтами каждой из мод связывания, представленные в единицах коэффициента молярной экстинкции. Полученные данные свидетельствуют о том, что величина коэффициента молярной экстинкции красителя, связавшегося с сайтами, отличающимися высокой константой связывания, имеют коэффициент молярной экстинкции, суще ственно b.b10 -4,, М -1 cm - Рис. 8. Спектры поглощения ThT, связанного с сайтами каждой из мод связывания амилоидных фибрилл основе инсулина (а), лизоцима (б) и Абета-пептида (в), представленные в единицах коэффициента молярной экстинкции (b1 и b2). На рисунке также представлен спектр поглощения свободного красителя в водном растворе (f).

превышающий коэффициент молярной экстинкции красителя в водном растворе. Это, повидимому, обусловлено различием конформации молекул красителя (углом между бензтиазольным и аминобензольным кольцами), которая определяется его микроокружением.

фибриллами. Как уже упоминалось выше, зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации красителя может быть использована для определения параметров связывания лишь в случае существования одной моды связывания. Однако измерение интенсивности флуоресценции растворов, полученных методом равновесного микродиализа, в сочетании с данными, полученными с использованием абсорбционной спектрофотометрии тех же растворов, позволяют определить квантовый выход флуоресценции ThT, связанного с сайтами, принадлежащими каждой из мод связывания (qb1, qb2):

коэффициента молярной экстинкции красителя, связавшегося с сайтами, отличающимися высокой константой связывания, имеют коэффициент молярной экстинкции, существенно превышающий коэффициент молярной экстинкции красителя в водном растворе. Это, повидимому, обусловлено различием конформации молекул красителя (углом между бензтиазольным и аминобензольным кольцами), которая определяется его микроокружением.

фибриллами. Как уже упоминалось выше, зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации красителя может быть использована для определения параметров связывания лишь в случае существования одной моды связывания. Однако измерение интенсивности флуоресценции растворов, полученных методом равновесного микродиализа, в сочетании с данными, полученными с использованием абсорбционной спектрофотометрии тех же растворов, позволяют определить квантовый выход флуоресценции ThT, связанного с сайтами, принадлежащими каждой из мод связывания (qb1, qb2):

где I – это зарегистрированное значение интенсивности флуоресценции, скорректированное на эффект внутреннего фильтра. Значения qb1 и qb2, рассчитанные методом множественной линейной регрессии, свидетельствуют о том, что квантовый выход флуоресценции ThT, инкорпорированного в амилоидные фибриллы на основе разных белков, а также квантовый выход красителя, связанного с сайтами, принадлежащими разным модам, различен. Это может быть обусловлено разной конформацией связанного красителя. В частности, молекулы красителя, имеющие более высокое значение квантового выхода флуоресценции, скорее всего, являются более плоскими по сравнению с молекулами с более низким значением квантового выхода флуоресценции.

Величины параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида, а также характеристики связанного с фибриллами красителя, представленные в Таблице, существенно различаются. Этот факт подтверждает данные о том, что фибриллы, полученные на основе разных белков, различны и что предлагаемый нами подход может использоваться для изучения их структуры. Таблица. Параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами и ацетлхолинэстеразой, характеристики свободного и связанного красителя Свободный ThT в водном растворе

ВЫВОДЫ

1. На основании измерения спектров поглощения и спектров возбуждения флуоресценции свободного и связанного с амилоидными фибриллами ThT, с учетом результатов квантово-химических расчетов молекулы красителя, сделан вывод о том, что существование «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ThT в водных растворах обусловлено наличием в растворе молекул ThT с нарушенной системой -сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец.

2. На основании измерения зависимости квантового выхода флуоресценции ThT от температуры и вязкости растворителя сделано заключение о том, что квантовый выход флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы определяется не только подвижностью фрагментов молекулы ThT друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и конформацией молекул красителя в основном состоянии.

3. Показано, что существующие предположения об образовании димеров или мицелл молекулами ThT в водном растворе и при встраивании в амилоидные фибриллы не обоснованы. ThT встраивается в амилоидные фибриллы в мономерной форме.

4. Метод, основанный на абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с использованием равновесного микродиализа, позволяет определять параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами, а также фотофизические характеристики связанного красителя. Предложенный подход может быть использован для изучения структуры амилоидных фибрилл.

5. Параметры связывания ThT с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида, а также фотофизические характеристики связанного с фибриллами красителя, существенно различаются, что свидетельствует о различии их структуры.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Sulatskaya A.I., Turoverov K.K., Kuznetsova I.M. 2010. Spectral properties and factors determining high quantum yield of thioflavin T incorporated in amyloid fibrils. Spectroscopy. 24: 169Sulatskaya A.I., Maskevich A.A., Kuznetsova I.M., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2010. Fluorescence quantum yield of thioflavin T in rigid isotropic solution and incorporated into the amyloid fibrils. PLoS ONE. 5(10): e15385 1- 3. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М. 2010. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами как инструмент для изучения их структуры. Цитология 52 (11): 955-959.

4. Сулацкая А.И. 2011. Взаимодействие флуоресцентного красителя тиофлавина Т с амилоидными фибриллами. Научно-технические ведомости СПбГПУ. 3 (129): 123-127.

5. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2011. Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изучения структуры амилоидных фибрилл. Вестник СанктПетербургского университета. 4 (4): 152- 6. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M. and Turoverov K.K. 2011. Interaction of Thioflavin T with amyloid fibrils: stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. Journal of Physical Chemistry B. 115: 11519- 7. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2012. Interaction of thioflavin T with amyloid fibrils: fluorescence quantum yield of bound dye. Journal of Physical Chemistry B. 116(8):

2538- 8. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A.I., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2012. Analyzing Thioflavin T binding to amyloid fibrils by an equilibrium microdialysis-based technique. PLoS ONE. 7(2):

e 9. Sulatskaya A. I., Povarova O.I., Kuznetsova I.M., Uversky V.N., Turoverov K.K. 2012. Binding stoichiometry and affinity of fluorescent dyes to proteins in different structural states. In Intrinsically Disordered Proteins: Volume I. Experimental Techniques. In the series "Methods in Molecular Biology" (Humana Press, series editor John Walker). 1: 441-460.

10. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A. I., Uversky V.N., Turoverov K.K.. 2012. A new trend in the experimental methodology for the analysis of the Thioflavin T binding to amyloid fibrils. Molecular Neurobiology. 45: 488-498.

11. Kuznetsova I.M., Sulatskaya A.I, Povarova O.I., Turoverov K.K. 2012. Reevaluation of ANS binding to human and bovine serum albumins. Key role of equilibrium microdialysis in ligand - receptor binding characterization. PLoS ONE. 7(7): e Тезисы:

1. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М. 2008. Связывание тиофлавина T с амилоидными фибриллами. 37-я Неделя науки СПбГПУ. Материалы Всероссийской межвузовской научной конференции студентов и аспирантов. (Санкт-Петербург). Стр. 9- 2. Сулацкая А.И. 2008. Причины возрастания квантового выхода флуоресценции бензтиазольного красителя тиофлавина T при его встраивании в амилоидные фибриллы. Политехнический симпозиум: Молодые ученые – промышленности Северо-Западного региона. Материалы конференций политехнического симпозиума. (Санкт-Петербург). Стр. 130- 3. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М. 2009. Изучение взаимодействия тиофлавина Т с амилоидными фибриллами с помощью метода равновесного микродиализа. 38-я Неделя науки СПбГПУ. Материалы международной научно-практической конференции. (СанктПетербург). Стр. 11- 4. Sulatskaya A.I., Turoverov K.K., Kuznetsova I.M. 2009. Spectral properties and factors determining high quantum yield of thioflavin T incorporated in amyloid fibrils. XIII European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules. Book abstracts (Palermo, Italy). P. 5. Сулацкая А.И., Туроверов К.К., Кузнецова И.М. 2010. Стехиометрия взаимодействия флуоресцентного красителя тиофлавина Т с амилоидными фибриллами. Спектральные свойства связанного красителя. Сборник тезисов Политехнического симпозиума «Молодые ученые - промышленности северо-западного региона». Стр. 194- 6. Сулацкая А.И. 2010. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами как инструмент для изучения их структуры. Тезисы докладов и сообщений, представленных на II конференцию молодых ученых Института цитологии РАН. Стр. 508- 7. Sulatskaya A.I., Turoverov K.K., Kuznetsova I.M. 2010. Thioflavin T as an instrument for studying amyloid fibrils structure.

Abstract

book of 6th Saint-Petersburg Young Scientists Conference.

P. 8. Сулацкая А.И. 2011. Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изучения структуры амилоидных фибрилл. Тезисы докладов III Конференции "Современные проблемы молекулярной биофизики". Стр. 58.

9. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2011. Thioflavin T – a tool for amyloid fibrils studies: mechanism of specific interaction and binding parameters. The 17th International Biophysics Congress (IUPAB) and the 12th Chinese Biophysics Congress abstracts.(Beijing, China). P.

10. Sulatskaya A.I. 2011. Characteristics of the interaction of fluorescent dye thioflavin T with amyloid fibrils. Сборник тезисов VІ Международной научной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы». Стр. 11. Сулацкая А.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2012. Встраивание флуоресцентного красителя тиофлавина Т в амилоидные фибриллы: стехиометрия взаимодействия и константы связывания. Цитология. Тезисы докладов и сообщений, представленных на III конференцию молодых ученых Института цитологии РАН. Стр. 357- 12. Фонин А.В., Сулацкая А.И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. 2012. Интенсивность флуоресценции как мера произведения оптической плотности флуорофора и квантового выхода его флуоресценции. Материалы докладов IV Съезда биофизиков России и IV Симпозиума «Новые тенденции и методы в биофизике». Стр. 95.

13. Sulatskaya A.I., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2012. A new trend in the experimental methodology of amyloid fibril structural investigation with the use of thioflavin T. FEBS Journal (Suppl. 1). 279: 415.

14. A. Fonin, A. Sulatskaya, O. Povarova, I. Kuznetsova, K. Turoverov. 2012. Pitfalls in the use of fluorescence for determination ligand-receptor binding stoichiometry and binding constants. Weak Protein-Ligand Interaction: New Horizons in Biophysics and Cell Biology. Abstract book. P. 54.

15. Sulatskaya A.I. Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2012. Investigation of the interaction of amyloid fibrils on the basis of different amyloidogenic proteins with fluorescent probe thioflavin T. 8th Saint-Petersburg young scientists conference. Abstract book. (Saint-Petersburg). p. 60.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Jahn T.R.; Radford S.E. FEBS J 2005, 272, 5962-5970. 2. Чеботарева Н.А. и др., Биохимия 2004, 69, 1522-1536. 3. Чеботарева Н.А., Автореферат диссертации 2006, 50 стр. 4. Harper J.

D. et.al, Chem Biol 1997, 4, 951-959. 5. Kelly J.W. Structure 1997, 5, 595-600. 6. Carrell R.W.;

Gooptu B. Curr Opin Struct Biol 1998, 8, 799-809. 7. Hashimoto M.; Masliah, E. Brain Pathol 1999, 9, 707-720. 8. Koo E.H et.al, Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 9989-9990. 9. Uversky V.N.

et.al, Med Sci Monitor 1999, 5, 1238-1254. 10. Uversky V.N. et.al,. Med Sci Monitor 1999, 5, 1001-1012. 11. Dobson C. M. Trends Biochem Sci 1999, 24, 329-332. 12. Uversky V.N., Fink A.

L. Biochim Biophys Acta 2004, 1698, 131-153. 13. Chiti F., Dobson C.M. Annu Rev Biochem 2006, 75, 333-366. 14. Fandrich M. et.al, Nature 2001, 410, 165-166. 15. Pertinhez T. A. et.al, FEBS Lett 2001, 495, 184-186. 16. Dobson C.M. Nature 2003, 426, 884-890. 17. Dobson C.M.

Methods 2004, 34, 4-14. 18. Makin O.S., Serpell L.C. FEBS J 2005, 272, 5950-5961. 19. Nielsen L.

et.al, Biochemistry 2001, 40, 6036-6046. 20. Naiki H. et.al, Lab Invest 1990, 62, 768-773. 21. Naiki H. et.al, Amyloid 2005, 12, 15-25. 22. LeVine H., 3rd. Protein Sci 1993, 2, 404-410. 23. Levine H., 3rd. Neurobiol Aging 1995, 16, 755-764. 24. LeVine H., 3rd. Arch Biochem Biophys 1997, 342, 306-316. 25. LeVine H., 3rd. Methods Enzymol 1999, 309, 274-284. 26. Yoshiike Y. et.al, J Biol Chem 2003, 278, 23648-23655. 27. Allsop D. et.al, Biochem Biophys Res Commun 2001, 285, 58Schirra R. Chem Phys Letters 1985, 119, 229-238. 29. Khurana R. et.al, J Struct Biol 2005, 151, 229-238. 30. Goers J. et.al, Biochemistry 2002, 41, 12546-12551. 31. Vernaglia B. A. et.al, Biomacromolecules 2004, 5, 1362-1370. 32. Kayed R. et.al, Molecular neurodegeneration 2007, 2, 18. 33. De Ferrari G. V. et.al, Rosenberry T. L. J Biol Chem 2001, 276, 23282-23287. 34.

Владимиров Ю. А.; Литвин Ф. Ф. Фотобиология и спектральные методы исследования;

Издательство "Высшая школа": Москва, 1964. 35. Lakowicz J. R. Springer, New York 2006. 36.

Turoverov K. K. et.al, Proc of SPIE 2007, 6733. 37. Sulatskaya A. I. et.al, PLoS One 2010, 5, e15385. 38. Krebs M. R. et.al, J Struct Biol 2005, 149, 30-37. 39. Сулацкая А. И.; Кузнецова И.

М. Цитология 2010, 52, 65-69. 40. Сулацкая А. И. Научно-технические ведомости СПбГПУ 2011, 3, 123-127. 41. Сулацкая А.И. и др., Вестник Санкт-Петербургского университета 2011, 4, 152-160. 42. Groenning M. J Chem Biol 2009, DOI 10.1007/s12154-12009-10027-12155. 43.

Kuznetsova I. M. et.al, PLoS One 2012, 7, e40845. 44. Kuznetsova I. M. et.al, Molecular neurobiology 2012, 45, 488-498. 45. Kuznetsova I.M. et.al, PLoS One 2012, 7, e30724. 46.

Sulatskaya A.I. et.al, J Phys Chem B 2011, 115, 11519-11524. 47. Sulatskaya, A. I. et.al, J Phys Chem B 2012, 116, 2538-2544.





Похожие работы:

«КОРОТКОВ Дмитрий Борисович ПРЕДСТАВИТЕЛЬСТВО КАК ГРАЖДАНСКОЕ ПРАВООТНОШЕНИЕ Специальность 12.00.03 – гражданское право; предпринимательское право; семейное право; международное частное право АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Екатеринбург - 2012 Работа выполнена на кафедре гражданского права и процесса Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Пермский государственный...»

«Шмачилин Павел Александрович ХАРАКТЕРИСТИКИ БОРТОВЫХ ЦИФРОВЫХ АФАР СВЧ Специальность 05.12.07 – Антенны, СВЧ – устройства и их технологии Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре радиофизики, антенн и микроволновой техники Московского авиационного института (государственного технического университета). Научный руководитель - доктор технических наук, профессор Воскресенский Дмитрий Иванович...»

«Цыганкова Юлия Сергеевна ОЦЕНКА ТРАНСПОРТНЫХ ПОТЕРЬ ТЕПЛОВОЙ ЭНЕРГИИ ЧЕРЕЗ ТЕПЛОИЗОЛЯЦИОННЫЕ КОНСТРУКЦИИ ТРУБОПРОВОДОВ ТЕПЛОВЫХ СЕТЕЙ Специальность 05.14.04 – Промышленная теплоэнергетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Красноярск – 2012 Работа выполнена на кафедре Автоматизации теплоэнергетических процессов Энергетического института Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального...»

«РЕВИНА ВАЛЕРИЯ ВАЛЕРЬЕВНА ЭКСТРЕМИЗМ В РОССИЙСКОМ УГОЛОВНОМ ПРАВЕ Специальность 12.00.08 уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва – 2010 2 Работа выполнена на кафедре уголовного права, процесса и криминалистики Московского государственного университета приборостроения и информатики. Научный руководитель : доктор юридических наук, профессор Магомедов Асбег Ахмеднабиевич...»

«Ушакова Александра Сергеевна ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ АМФИФИЛЬНОСТИ МАКРОМОЛЕКУЛ И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЕЩЕСТВ В СТРУКТУРООБРАЗОВАНИИ Специальность 02.00.06 высокомолекулярные соединения АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. кандидат физико-математических наук Научный...»

«Лупанов Илья Викторович МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОЛЕЙ В ЭЛЕКТРОФИЗИЧЕСКИХ УСТАНОВКАХ 05.13.18 – Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Челябинск 2013 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Южно-Уральский государственный университет (национальный исследовательский университет) на кафедре вычислительной механики сплошных сред Научный руководитель :...»

«ВИГДОРЧИК ДМИТРИЙ ГЕОРГИЕВИЧ НАЛОГОВОЕ ПРАВОНАРУШЕНИЕ: ПРАВОВАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Специальность 12.00.14административное право, финансовое право, информационное право АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва - 2009 0 Работа выполнена на кафедре Финансового и административного права ГОУ ВПО Всероссийской государственной налоговой академии Минфина России Научный руководитель : кандидат юридических наук, доцент Кобзарь-Фролова Маргарита...»

«Сафонова Ольга Михайловна МОТИВАЦИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПРЕПОДАВАТЕЛЕЙ ВУЗА В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА ФИНАНСОВЫХ СТИМУЛОВ Специальность 22.00.03 – Экономическая социология и демография АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата социологических наук Санкт-Петербург – 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет экономики и...»

«Кистойчев Александр Владимирович ПРИЧИНЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ, ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ, ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ И УСТРАНЕНИЕ ДЕФЕКТОВ ВАЛОПРОВОДОВ ТУРБОМАШИН Специальность 05.04.12 – Турбомашины и комбинированные турбоустановки АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Екатеринбург 2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Уральский государственный технический университет – УПИ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина на кафедре Турбины и двигатели Научный...»

«Катушкина Анастасия Анатольевна ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕЙКОПЛАКИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ РТА 14.03.02 – патологическая анатомия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2011 1 Работа выполнена на кафедре патологической анатомии медицинского факультета ГОУ ВПО Российского университета дружбы народов. Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор Игорь Иванович Бабиченко Официальные оппоненты : доктор...»

«Кузнецова Наталья Александровна ДИНАМИКА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АНГЛИЦИЗМОВ В СОВРЕМЕННОМ ИСПАНСКОМ ЯЗЫКЕ (НА МАТЕРИАЛЕ ЖЕНСКИХ ЖУРНАЛОВ) Специальность 10.02.05 – романские языки АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Москва – 2012 1 Работа выполнена на кафедре иностранных языков филологического факультета Российского университета дружбы народов Научный руководитель : доктор филологических наук, доцент Чеснокова Ольга Станиславовна...»

«ЖИЛЬНИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ЦЕНТРАЛЬНЫЙ БАНК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАК ОСОБЫЙ СУБЪЕКТ ПРАВА Специальность 12.00.01 - Теория и история права и государства; история учений о праве и государстве АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Казань 2012 Работа выполнена на кафедре теории и истории государства и права Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Самарский...»

«Морозова Юлия Владимировна НЕПРАВОМЕРНЫЕ ДЕЙСТВИЯ ПРИ БАНКРОТСТВЕ, ПРЕДНАМЕРЕННОЕ И ФИКТИВНОЕ БАНКРОТСТВА ПО УГОЛОВНОМУ ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 12.00.08 — Уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва-2010 Диссертация выполнена на кафедре уголовного права, криминологии и уголовно-исполнительного права Санкт-Петербургского юридического ин­ ститута...»

«ХОВАЕВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ РАЗРАБОТКА ИНФОРМАЦИОННОГО И НОРМАТИВНО-МЕТОДИЧЕСКОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ СИСТЕМЫ ГИГИЕНИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЗА ОБОРОТОМ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ, ПОЛУЧЕННОЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 14.02.01 – Гигиена Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научноисследовательском институте эпидемиологии и микробиологии...»

«ЕФИМОВА Надежда Васильевна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ КАРДИОРЕСПИРАТОРНОЙ СИСТЕМЫ В ГОДОВОМ ЦИКЛЕ У МОЛОДЫХ ЛИЦ 18-22 ЛЕТ, УРОЖЕНЦЕВ ЕВРОПЕЙСКОГО СЕВЕРА 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре гигиены и медицинской экологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Северный государственный...»

«Разумов Николай Геннадьевич ПОЛУЧЕНИЕ ПОРОШКОВОЙ ВЫСОКОАЗОТИСТОЙ АУСТЕНИТНОЙ СТАЛИ МЕТОДОМ МЕХАНИЧЕСКОГО ЛЕГИРОВАНИЯ ЖЕЛЕЗА АУСТЕНИТООБРАЗУЮЩИМИ ЭЛЕМЕНТАМИ В АЗОТОСОДЕРЖАЩЕЙ АТМОСФЕРЕ Специальность 05.16.06 – Порошковая металлургия и композиционные материалы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Санкт-Петербург – 2014 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального...»

«БОБРОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА ГЕОЛОГИЯ, ВЕЩЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ И УСЛОВИЯ ОБРАЗОВАНИЯ УЛЬТРАМАФИТ-МАФИТОВЫХ ПОРОД ЛЬГОВСКОРАКИТНЯНСКОГО ЗЕЛЕНОКАМЕННОГО ПОЯСА КМА Специальность 25.00.04 – Петрология, вулканология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена на кафедре минералогии, петрографии и геохимии Воронежского государственного университета Научный руководитель : доктор геолого-минералогических...»

«Барашев Хайсматулла ВНУТРЕННИЙ АУДИТ ФИНАНСОВО-ПРОМЫШЛЕННЫХ ГРУПП В УСЛОВИЯХ КОРПОРАТИВНОГО СТРОИТЕЛЬСТВА Специальность 08.00.12 – Бухгалтерский учет, статистика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Екатеринбург 2008 Диссертационная работа выполнена на кафедре бухгалтерского учета и аудита ГОУ ВПО Уральский государственный экономический университет Научный руководитель Коновалова Ирина Рафаиловна Доктор экономических наук ГОУ ВПО...»

«КОРНОСЕНКОВ Сергей Викторович КОНЦЕПТ ИНТЕЛЛИГЕНЦИЯ В СОВРЕМЕННОМ РОССИЙСКОМ ЯЗЫКОВОМ СОЗНАНИИ Специальность 10.02.01 – Русский язык АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Научный руководитель – доктор филологических наук, профессор А. В. ФЛОРЯ Челябинск 2008 Работа выполнена в ГОУВПО Орский гуманитарно-технологический институт (филиал ГОУВПО Оренбургский государственный университет) Научный руководитель: доктор филологических наук,...»

«ЦЕЛИЩЕВ Антон Владимирович МЕТОДИКА РАСЧЕТА И МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРОЦЕССА ФАЗОРАЗДЕЛЕНИЯ ГАЗОЖИДКОСТНОГО ПОТОКА В ПРОТИВОТОЧНОЙ ВИХРЕВОЙ ТРУБЕ Специальность 05.04.13 - Гидравлические машины и гидропневмоагрегаты АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Уфа – 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Уфимский государственный авиационный технический университет на кафедре сопротивления материалов. заслуженный деятель науки РФ, Научный руководитель :...»






 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.