На правах рукописи

Наумов Денис Евгеньевич

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У БОЛЬНЫХ С ХОЛОДОВОЙ

ГИПЕРРЕАКТИВНОСТЬЮ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

14.01.04 – внутренние болезни

Автореферат диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Владивосток – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Колосов Виктор Павлович

Официальные оппоненты:

Гельцер Борис Израилевич – доктор медицинских наук, профессор, членкорреспондент РАМН, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра пропедевтики внутренних болезней, заведующий кафедрой.

Шакирова Ольга Викторовна – доктор медицинских наук, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет», Школа искусства, культуры и спорта, кафедра теории и методики адаптивной физической культуры, заведующая кафедрой.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «26» декабря 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.04 при ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (690002, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (690002, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2).

Автореферат разослан «19» ноября 2013 года.

Учёный секретарь диссертационного совета Кондрашова Надежда Михайловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время в мире отмечается практически повсеместный рост заболеваемости бронхиальной астмой (БА), вместе с тем, проблема терапии заболевания решена далеко не полностью. Это подтверждается сообщениями о недостаточном уровне контроля более чем у 50% больных (А.С. Белевский и соавт., 2007; Н.М. Ненашева, 2007; В.В. Архипов и соавт., 2011; Е.А. Собко и соавт., 2011; J.L. Desfougeres et al., 2007). Плохой контроль, в свою очередь, не только отягощает текущее состояние здоровья больного и существенно снижает качество жизни, но и является неблагоприятным прогностическим фактором в отношении будущих обострений БА (H. Chen et al., 2007;

E.D. Bateman et al., 2010). Контролируемое течение заболевания означает не только внешнее благополучие пациента, связанное с отсутствием симптомов, но также контроль воспаления и реактивности дыхательных путей.

Феномен гиперреактивности рассматривается как фактор риска развития и прогрессирования БА, поскольку является одним из основных патогенетических механизмов формирования флюктуирующей бронхиальной обструкции. Холодный воздух, как один из естественных триггеров, способен провоцировать появление симптомов у значительной части больных БА (А.Г. Приходько, А.В. Колосов, 2008). Учитывая неблагоприятный климатический фон, характерный для регионов Сибири, Крайнего Севера и Дальнего Востока, проблему холодовой гиперреактивности дыхательных путей (ХГДП) необходимо признать актуальной и клинически значимой. Несмотря на то, что этиология и патогенез ХГДП во многом остаются еще не изученными, достигнутые успехи в этом направлении указывают на гетерогенность причинных факторов и механизмов ее формирования (А.Г. Приходько, Ю.М. Перельман, В.П. Колосов, 2011). Известно, что наследственная предрасположенность может играть достаточно важную роль в формировании гиперреактивности дыхательных путей (ГДП). По данным близнецовых исследований и исследований среди семей больных БА, наследуемость ГДП как признака составляет от 30 до 66% (R.J. Hopp et al., 1984; L.J. Palmer et al., 2000). В связи с этим, представляется вероятным, что в качестве причинного фактора ХГДП может выступать ряд врожденных генетических детерминант.

Среди них можно особо выделить ген ADRB2, кодирующий белок 2адренорецепторов, и ген TRPM8, несущий информацию о структуре восьмого представителя меластатинового семейства катионных каналов с транзиторным рецепторным потенциалом.

Дефекты структуры или экспрессии белка 2-адренорецептора, как правило, приводят к изменению нормального контроля бронхиального тонуса, что сопровождается изменением ответа на терапевтические и бронхоконстрикторные воздействия. Нарушения в гене TRPM8, вероятно, могут способствовать модуляции холодовой чувствительности, повышая или снижая её. В литературе отсутствуют данные о связи генов ADRB2 и TRPM8 с клинико-функциональными особенностями БА у больных, проживающих в условиях холодного климата.

Остаются также нераскрытыми генетические предпосылки к формированию ХГДП.

Таким образом, выяснение взаимоотношений молекулярно-генетических, клинических и функциональных параметров у больных БА с ХГДП является важной задачей, решение которой позволит лучше понимать механизмы патологического процесса, а также разработать новые диагностические методы и оптимизировать фармакотерапию у этой категории пациентов.

Цель исследования состояла в изучении клинико-функциональных, молекулярных и генетических особенностей у больных БА с ХГДП, и определении их роли в прогнозировании формирования ХГДП и клинического течения заболевания.

Задачи исследования 1. Изучить особенности клинического течения и показателей вентиляционной функции легких у больных БА во взаимосвязи с характером и выраженностью ХГДП.

2. Исследовать изменения функциональной активности 2-адренорецепции у больных БА с ХГДП.

3. Изучить вклад однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) генов ADRB и TRPM8 в формирование особенностей клинического течения заболевания и развитие ХГДП у больных БА.

4. Установить роль полиморфизма Arg16Gly гена ADRB2 в развитии функциональной недостаточности 2-адренорецепции у больных БА с ХГДП.

5. Разработать способы прогнозирования формирования ХГДП и течения БА с использованием клинических, молекулярно-генетических и функциональных предикторов.

Научная новизна. Получены данные о характерных клинических особенностях БА у больных с ХГДП, свидетельствующих о её негативном влиянии на клиническую картину заболевания. Впервые проведен ассоциативный анализ и описано влияние изменчивости генов ADRB2 и TRPM8 на фенотипические проявления ХГДП при БА: выявлена ассоциация Arg16Arg гомозиготного генотипа и гетерозиготного носительства по ОНП c.750G>C с выраженным снижением бронхиальной проходимости в ответ на бронхопровокацию с изокапнической гипервентиляцией холодным воздухом (ИГХВ). Установлен вклад генетической детерминации в формирование нарушений функциональной активности 2адренорецепторного комплекса у больных БА с ХГДП. Описана взаимосвязь Arg16Arg полиморфного варианта гена ADRB2 с более тяжелым клиническим течением БА, что использовано в разработке способов прогнозирования ХГДП и течения БА в условиях низких сезонных температур с учётом клиникофункциональных предикторов.

Практическая значимость. Генотипирование ОНП ADRB2:p.Arg16Gly и TRPM8:c.750G>C представляет метод, доступный любой генетической лаборатории и может использоваться для определения групп риска по развитию ХГДП и неконтролируемому течению БА. Разработанные комплексные математические модели, включающие дополнительные клинико-функциональные предикторы, позволяют осуществлять прогнозирование ХГДП и клинического течения БА с высокой эффективностью. Получен патент РФ на изобретение № «Способ прогнозирования риска формирования холодовой гиперреактивности дыхательных путей у больных бронхиальной астмой».

Положения, выносимые на защиту 1. ХГДП у больных БА является фактором, отягощающим течение заболевания в неблагоприятных условиях холодного климата, что находит отражение в большей частоте неконтролируемого течения, большей частоте и выраженности респираторных симптомов, а также снижении показателей функции внешнего дыхания.

2. Генотип Arg16Arg и аллель Arg16 гена ADRB2 значимо ассоциированы с ХГДП вне зависимости от пола и возраста.

3. Особенности функциональных нарушений 2-адренорецепторного комплекса при ХГДП имеют генетическую детерминацию. Генотип Arg16Arg предрасполагает к снижению активности 2-адренорецепторов (по динамике стимулированной концентрации циклического аденозинмонофосфата (цАМФ)), что сопровождается выраженными вентиляционными нарушениями в ответ на ИГХВ.

4. ОНП c.750G>C гена TRPM8 – генетический фактор, предрасполагающий к формированию ХГДП у больных БА. Носительство GC гетерозиготного генотипа связано с ХГДП и сопровождается значительным снижением функции внешнего дыхания при ИГХВ.

5. Разработанная математическая модель, использующая информацию о молекулярно-генетических особенностях, влиянии ингаляционных глюкокортикостероидов (ИГКС) и обратимости бронхиальной обструкции позволяет прогнозировать вероятность формирования ХГДП у больных БА.

6. Данные о генотипе по ОНП ADRB2:p.Arg16Gly в сочетании с клиническими предикторами дают возможность прогнозировать динамику контроля БА на протяжении 6 месяцев.

Личный вклад соискателя. Автором диссертационного исследования были разработаны протокол исследования и тематическая карта пациента, проведено собеседование с больными и осмотр обследованного контингента; выполнены клинические, функциональные и молекулярно-генетические исследования, включая генотипирование ОНП генов ADRB2 и TRPM8. Единолично проведена статистическая обработка материала. Доля участия автора в сборе материала – 90%, в анализе и систематизации полученных данных – 100%.

Апробация работы. Материалы, основные положения и выводы диссертации были представлены и обсуждены на заседании Ученого совета ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН (2011), научной конференции «Молодые ученые – науке» (Благовещенск, 2011), IV Съезде врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока (Благовещенск, 2011), XXI Ежегодном Конгрессе Европейского респираторного общества (Амстердам, 2011), XXI Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Уфа, 2011), научной конференции «Молодые ученые – науке» (Благовещенск, 2012), молодежной научно-практической конференции «Молодежь XXI века: шаг в будущее» (Благовещенск, 2012), XXII Ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества (Вена, 2012), XXII Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2012).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 – в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 56 таблиц и 8 рисунков. Состоит из введения, 4 глав, включая обзор литературы, материалы и методы исследования, главы собственных результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка, содержащего 31 работу отечественных и 248 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследование больных проводилось на базе пульмонологического отделения клиники ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН. Все исследования были проведены в соответствии с «Правилами клинической практики в Российской Федерации», с учетом требований Хельсинской декларации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов», и одобрены комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН.

Диагноз БА выставлялся согласно Международной классификации болезней 10го пересмотра (МКБ-10) в соответствии с критериями Глобальной инициативы по бронхиальной астме (GINA, 2010).

При поступлении в стационар всем больным производился сбор жалоб, анамнеза заболевания и жизни, а также объективный осмотр. Информация о жалобах и анамнезе заносилась в специально подготовленную анкету. Для оценки контроля над заболеванием больным предлагалось заполнить валидизированный тест по контролю над астмой - Asthma Control Test (Quality Metric Inc., 2002).

Производился сбор данных о получаемой фармакотерапии: тип, длительность приема и суточные дозы препаратов базисной терапии (в том числе, ИГКС и длительнодействующих 2-агонистов (ДДБА)) и частота использования бронхолитиков (2-адреномиметиков) короткого действия. Объективный осмотр включал оценку общего состояния, осмотр кожных покровов и слизистых оболочек рта и носа, визуальную оценку формы грудной клетки, оценку участия вспомогательной мускулатуры в акте дыхания. Методами пальпации, перкуссии и аускультации проводилась диагностика состояния органов дыхания и сердечнососудистой системы: подсчитывалась частота дыхания и сердечных сокращений, определялись границы легких и сердца, выслушивались дыхательные шумы и сердечные тоны. Оценка функции внешнего дыхания проводилась методом спирографии на аппарате «FlowScreen» (Erich-Jaeger, Германия) исходно, а также в динамике, после проведения бронходилатационной пробы с фенотеролом и бронхопровокационной пробы с 3-минутной ИГХВ (5% СО2, 20°С). Проба считалась положительной, если сразу после ингаляции холодного воздуха объём форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1) уменьшался на 10% и более от исходной величины.

С целью изучения функциональной активности 2-адренорецепторов была использована модель лимфоцитов периферической крови. Оценка функциональной активности 2-адренорецепторов осуществлялась по уровню прироста концентрации цАМФ в лимфоцитах после их стимуляции адреналином. Количество стимулированного цАМФ определяли радиоиммунологическим методом с использованием наборов Cyclic AMP Assay kit («Amersham», Великобритания).

Генотипирование полиморфизма Arg16Gly (c.46A>G, rs1042713) гена ADRB2 осуществлялось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с анализом полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов. Генотипирование гена TRPM8 проводилось по четырем полиморфным сайтам. Анализ ОНП c.750G>C (rs11562975), c.1256G>A (rs7593557) и c.3174C>G (rs11563071) проводили с помощью аллель-специфической ПЦР. Детекцию ОНП c.3048C>T (rs11563208) осуществляли с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с рестриктазой TaqI («Сибэнзим», г. Новосибирск).

Статистическая обработка производилась с использованием параметрических и непараметрических статистических методов в программных пакетах Statistica 6.1 (StatSoft, Inc. 2003), NCSS (Hintze. J. 2007), SPSS for Windows версия 17.0.0 (SPSS Inc. 2008). Данные представлены в виде M±m для нормально распределенных величин (где М – среднее арифметическое, m – стандартная ошибка среднего), либо Me (q1; q3) для величин, распределение которых не подчинялось нормальному закону (где Me – медиана, q1 и q3 – нижний и верхний квартили соответственно).

Было обследовано 136 больных персистирующей БА легкой и средней степени тяжести, из них 42 мужчин (31%) и 94 женщин (69%) европеоидной расы от 19 до 63 лет (средний возраст 37,8±0,89 лет). Преобладали больные смешанной формой БА (51,5% 70 человек), больных аллергической и неаллергической БА было соответственно 44 (32,3%) и 22 (16,2%). 48 человек (35% обследованных) имели легкую персистирующую БА, 88 (65%) – среднюю степень тяжести заболевания. Большинство больных исследуемой выборки имели неконтролируемое течение БА – 106 (77,9%), гораздо меньшее число пациентов демонстрировали частичный (24 человека 17,6%) или полный контроль (6 человек 4,5%). Средний уровень контроля среди больных неконтролируемой БА составил, по данным АСТ, 13,9±0,34 баллов. Для больных с частичным контролем соответствующий показатель достигал 22,0±0,29 баллов. 60 пациентам проводилась динамическая оценка клинико-функциональных показателей на фоне шестимесячного курса стандартной комбинированной базисной терапии. Первичное обследование проводилось в осенне-зимний период. В качестве базисной терапии использовались ИГКС (бекламетазона дипропионат, будесонид) и ДДБА (формотерол), в рекомендуемых дозах, соответствующих тяжести заболевания. Средние дозы для пациентов с легкой персистирующей БА составили мкг (в пересчете на бекламетазон), а при средней степени БА – 500-750 мкг. Суточная доза формотерола составляла 18 мкг. Среди других 60 больных, выделенных в отдельную подгруппу, проводилась оценка функционального состояния 2-адренорецепторов на модели лимфоцитов периферической крови.

По результатам пробы с ИГХВ формировались основные группы: в группу I были включены больные с положительной, а в группу II – с отрицательной реакцией на холодовую бронхопровокацию. В результате в I группу вошли больных БА (37%) с ХГДП, а во II группу – 86 больных (63%) без объективных признаков ХГДП. Анализ уровня контроля заболевания, оцененный согласно критериям вопросника ACT, показал существенные различия в соотношении контролируемого, частично-контролируемого и неконтролируемого течения БА у пациентов двух групп. Больные группы I были представлены неконтролируемой БА в 92% случаев, в то время как в группе II их было около 70%. Кроме того, во второй группе также присутствовали пациенты с контролируемым течением заболевания (6 человек), полностью отсутствовавшие в группе I. Средний балл ACT также отличался более низким значением для первой группы больных,