На правах рукописи

Кузнецов Алексей Витальевич

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ

МЕТОДИКИ ПЕРЕКРЕСТНОЙ СШИВКИ КОЛЛАГЕНА РОГОВИЦЫ

(КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ).

14.01.07 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва – 2014 2 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт глазных болезней» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Бубнова Ирина Алексеевна

Официальные оппоненты:

Слонимский Юрий Борисович, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения РФ, профессор кафедры офтальмологии Рыбакова Елена Геннадьевна, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ, профессор кафедры офтальмологии имени академика А.П.Нестерова лечебного факультета

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение научно-технический комплекс «Межотраслевой "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова» Министерства здравоохранения РФ

Защита состоится «17» ноября 2014 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 001.040.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт глазных болезней»

Российской академии медицинских наук по адресу: 119021, Москва, ул.

Россолимо, д. 11 А, Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.niigb.ru Федерального государственного бюджетного учреждения «Научноисследовательский институт глазных болезней» Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «» 2014 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Иванов М.Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Эктазии роговицы могут быть как проявлением заболевания, так и развиваться как осложнение оперативного вмешательства. Значимость проблемы лечения эктатических заболеваний роговицы в настоящее время возросла, так как наблюдается тенденция к увеличению этого вида глазной патологии. Возможно это связано как с улучшением диагностического оборудования, так и с увеличением количества рефракционных операций, ухудшением экологической обстановки в целом, повышением радиационного фона в отдельных регионах и аллергизацией населения.

На сегодняшний день не существует единой точки зрения в отношении лечения эктатических состояний роговицы. С каждым годом появляются новые подходы к тактике ведения данной группы пациентов, которые предполагают использование контактных линз, применение различных хирургических методик (имплантация интрастромальных роговичных сегментов, послойная или сквозная пересадка роговицы) (Мамиконян В.Р.

2011, Калинников Ю.Ю. 2008, Tan B.U. 2006, Miranda D. 2003).

В последние годы, в процессе инновационных разработок в области биофизики, биохимии и медицины, появился новый метод лечения эктатических заболеваний роговицы, в основе которого лежит фотодинамический эффект, приводящий к «перекрестной сшивке» - кросслинкингу (сross-linking) коллагена и «уплотнению» или увеличению прочности роговицы.

Основоположниками техники для лечения «кросс-линкинг»

кератоконуса были Wollensak G, Spoerl Е и Seiler в 1990 году. В отличие от хирургических подходов, метод не требует дорогостоящих лазерных установок и прост в исполнении.

Для фотодинамического поперечного сшивания коллагена, в качестве фотосенсибилизатора, было предложено использовать рибофлавин (витамин В2), активирование которого происходит с помощью ультрафиолетового излучения в диапазоне длинн волн спектра А. Выбор был обусловлен нетоксичностью рибофлавина для роговичной ткани, доступностью препарата и сохранением прозрачности при нанесении на роговицу. Однако, для формирования «сшивок» необходимо достаточно длительное излучение в УФ диапазоне, которое не безразлично для состояния эндотелия.

Метод «кросс-линкинга» предполагает возникновение продуктов фотодинамической реакции во всем объеме той области роговицы, которая подвергается экспозиции возбуждающим излучением. Инстилляции рибофлавина, в классическом варианте процедуры, служат не только для фотохимического обеспечения реакции перекрестного сшивания коллагена, но и для создания своеобразного барьера, ограничивающего травмирующее воздействие на задний эпителий роговицы. При прохождении УФ излучения через толщину стромы, по мере расходования квантов на фотодинамическую реакцию и на переизлучение рибофлавином, плотность возбуждающего излучения уменьшается. Правильный подбор спектральных характеристик и мощности облучателя и концентрации рибофлавина позволяет избежать фототоксического поражения ЗЭР. При этом некоторыми авторами (Goldich Y., Terai N.) отмечается недостаточная эффективность процедуры. При её теоретической обоснованности (Rabinowitz Y.S.), клинический эффект не всегда достаточно хорошо выражен.

Очевидно, что если бы фотодинамическая реакция проходила не равномерно во всем объеме роговицы, а избирательно, в непосредственном окружении каждой молекулы структурного белка, то удалось бы избежать травмирующего воздействия при более высокой плотности возбуждающего излучения.

Поэтому необходимо детальное изучение структурных изменений роговицы, параметров проведения процедуры, а так же поиск способов уменьшения воздействия УФ излучения и «протекции» эндотелия. Так же интересен и поиск новых фотосенсибилизаторов способных формировать «сшивки» коллагена различной степени выраженности.

Таким образом, остается актуальным вопрос появления новых фотосенсибилизаторов, изучение возможного влияния процедуры «кросслинкинг» на различные структуры глаза и изменения физических свойств роговицы после её проведения.

Целью настоящей работы было провести клиническую оценку экспериментально апробировать возможность применения другого фотосенсибилизатора.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

Изучить эффективность применения процедуры «кросслинкинг», проводимой согласно стандартному протоколу, у пациентов с прогрессирующим кератоконусом.

применения нового фотосенсибилизатора для проведения процедуры «кросс-линкинг».

изменения роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с различными фотосенсибилизаторами.

Выявить прижизненные изменения роговицы при помощи фотосенсибилизаторов у экспериментальных животных.

экспериментального животного после проведения процедуры «кросслинкинг» с различными фотосенсибилизаторами.

Исследовать изменения биомеханических свойств глаза фотосенсибилизаторами в эксперименте.

Впервые теоретически обоснована и показана в эксперименте возможность использования фотосенсибилизатора фталоцианинового ряда как субстрата для проведения процедуры «кросс-линкинг» роговицы.

конфокальной микроскопии, морфологических и биомеханических исследований изучено состояние роговицы после проведения процедуры «кросс-линкинг» с использованием фотосенсибилизатора фталоцианинового ряда.

возможность проведения процедуры «кросс-линкинга» с препаратом фталоцианинового ряда «Фотосенс» для лечения эктатических заболеваний глаз.

препаратами на основе рибофлавина и фталоцианинов на коллаген роговицы в эксперименте.

Личный вклад автора в проведенное исследование Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в проведении всех экспериментальных и клинических исследований, апробации результатов, подготовке публикаций и докладов по теме диссертации. Вся обработка и интерпретация полученных результатов выполнена лично автором.

Фотосенсибилизатор фталоцианинового ряда «Фотосенс» может эксперименте.

Использование в качестве фотосенсибилизатора препаратов из группы фталоцианинов, приводит к снижению плотности кератоцитов в верхних и средних слоях стромы при исследовании через 1 неделю после процедуры, и как следствие к реактивному повышению пролиферативной активности кератоцитов и более компактному расположению стромальных пластин – через 1 месяц.

Результаты работы доложены и обсуждены на IX съезде офтальмологов России (Москва, 2010); на научно-практических конференциях «Роль и место фармакотерапии в современной офтальмологической практике» (СанктПетербург,2009); «Актуальные проблемы офтальмологии» (МНТК имени Фёдорова, Москва, 2009); «7thInternationalsymposium. Photodynamic therapy and photo diagnosis in clinical practice» (Italy, Brixen, 2008); «13th Congress of the European society for photobiology conjunction with the 2nd Conference of the European Platform for Photodynamic Medicine» (Poland, Wroclaw, 2009); «12th World Congress of the International Photodynamic Association» (USA, Seattle, 2009); «The International Symposium on Ocular Pharmacology and Therapeutics»

(Austria, Vienna, 2011).

Полученные результаты исследования внедрены и применяются в работе ФГБУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»

РАМН.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 3 – в журналах, входящих в перечень рецензируемых журналов и изданий, определённых ВАК. Получен 1 патент РФ на изобретение: «Способ лечения кератоконуса» №2388436 от 10.05.2010.

Диссертация содержит 144 страницы и состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 52 отечественных и 107 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 55 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования исследований, проведенных на базе Научно-исследовательского института глазных болезней Российской академии медицинских наук и кафедры глазных болезней Первого МГМУ им. И. М. Сеченова с 2010 года по годы.

Работа состоит из двух частей: клинической и экспериментальной.

Характеристика клинического материала работы Всего было обследовано 33 пациента (66 глаз)с кератоконусом I – III стадии в возрасте от 23 до 34 лет.

Распределение пациентов по степени развития кератоконуса проводили согласно классификации Amsler:

Критерии включения пациентов:

• отсутствие данных о хирургических вмешательствах на роговице;

• отсутствие сопутствующей глазной патологии.

Рефракция роговицы в центральной зоне у пациентов показатель офтальмометрии в среднем составил 47,67±2,38 дптр, с разбросом значений от 44,9 до 50,2 дптр. Кривизна роговицы на вершине кератоконуса была от 47,1 до 53,6 дптр., толщина роговицы в центре в среднем была 487±35,6 мкм.

На кератотопограмме имел место типичный паттерн усиления рефракции роговицы в нижней части. У всех пациентов на момент проведения процедуры регистрировали прогрессирующее течение заболевания на обоих глазах.

Всем пациентам на худшем глазу была выполнена процедура «кросслинкинг» по стандартному протоколу. Второй глаз являлся контрольным.

Сроки наблюдения составляли 1, 6, 12 и 24 месяца после вмешательства.

Характеристика экспериментального материала работы Работа была выполнена на кроликах породы Шиншилла (самцы, массой 2-3 кг, 144 глаза) В соответствии с поставленными задачами все животные были разделены на 7 групп: 3 экспериментальных и 4 контрольных (Рисунок 1).

Кроликам 1-3 групп осуществляли деэпителизацию роговицы, после чего закапывали в течение 15 минут соответствующий фотосенсибилизатор и проводили облучение ультрафиолетовым светом (длина волны 365 нм) на расстоянии 5см и плотностью мощности (3мВт/см2) в течение 30 минут. В первой группе в качестве фотосенсибилизатора применяли 0,1% водный раствор рибофлавина, во 2 группе – 0,1% раствор рибофлавина на декстаране, в 3 - использовали препарат «Фотосенс» (0,2% раствор в общем объеме 2 мл производства ФГУП «ГНЦ НИОПИК»), разрешённый для медицинского применения при проведении ФДТ и ФД злокачественных онкологических заболеваний. Регистрационное удостоверение Р № 000199/02–2001 от 25.07.2001). В контрольных группах 5-7 после деэпитализации проводили закапывание соответствующего ФС без последующего облучения. В 4 группе – все глаза являлись парными (интактными) и были приняты за норму.

Офтальмологические методы обследования.

В ходе проведения клинической работы обследование пациентов проводили с помощью общепринятых (стандартных) офтальмологических методик: визометрии без коррекции и со сфероцилиндрической коррекцией, рефрактометрии, офтальмометрии, статической периметрии, пневмотонометрии, компьютерной кератотопографии, УЗ-пахиметрии, биомикроскопии переднего отрезка глаза и офтальмоскопии.

В рамках экспериментальной части для оценки состояния переднего отдела глаза использовали метод фокального бокового освещения.

Биомикроскопические исследования проводили с помощью щелевой лампы по методике Шульпиной Н.Б.

Специальные методы исследования Помимо этого применяли специальные офтальмологические методы:

1. Конфокальная биомикроскопия;

2. Исследование оптической плотности роговицы;

3. Исследование биомеханических свойств роговицы.

4. Эластотонометрия Конфокальную микроскопию с использованием конфокального микроскопа «Confoscan - 4» (Nidek, Japan) при увеличении х500 проводили до, через 1 неделю и через 1 месяц после проведения облучения.

денситометрии роговицы, полученным с помощью сканирующей системы переднего отрезка глаза Pentacam (Oculus, Германия), который основан на принципе Шаймпфлюг камеры. Исследование проводили in vivo через неделю и через 1 месяц после проведения процедуры «кросс-линкинг», так как необходимым условием для выполнения этих манипуляций являлась полная эпителизация роговицы.

Исследование биомеханических свойств роговицы in vivo проводили с (OcularResponseAnalyzer - ORA), пневмотонометрии с динамической двунаправленной аппланацией роговицы.

При этом анализировали два показателя - корнеальный гистерезис (КГ – corneal hysteresis), который отражает вязко-эластичные свойства роговой оболочки, и фактор резистентности роговицы (ФРР) (corneal resistance factor), который характеризует общую ригидность роговицы. Исследование проводили прижизненно через 1 месяц после процедуры.

методике с помощью тонометров Маклакова массой 5, 10 и 15 г. В качестве критерия оценки результатов использовали величину эластоподъема (разницу между показателями внутриглазного давления, измеренного тонометрами Маклакова массой 5 и 15 г). При значении эластоподъема более 11 мм рт. ст. определяли упругие свойства роговицы как сниженные, при значении от 9 до 11 мм рт ст – как нормальные, при значении менее 9 мм рт.

ст. – как повышенные.

Гистологические методы исследований Энуклеацию глаз проводили через 1 неделю и 1 месяц после эксперимента. Энуклеированные глаза подвергались обязательному патогистологическому исследованию. Полученный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах и заливали в парафин и готовили срезы (толщиной 5-8 мкм). Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван Гизону. Для получения полутонких срезов, интересующие нас образцы тканей глаза, размерами 2x2 мм помещали в холодный фиксирующий 2,5% раствор глутаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,4). Через 2 часа отмытые в буфере образцы дофиксировались в 1% растворе осмиевой кислоты. После обезвоживания в батарее спиртов возрастающей концентрации препараты заключали в смесь эпоксидных смол (эпон- альдегид). Полутонкие срезы (толщиной 0,5- мкм) готовили наУльтратоме Нова (LKB, Швеция) и окрашивали толудиновым синим, а также полихромным методом (метиленовый синий и фуксин). Окрашенные препараты исследовали на световом «ФотомикроскопеIII» (Орton, Германия), совмещенным с аппаратно-программным комплексом автоматической морфоденситометрии «ДиаМорф Объектив», компании «ДиаМорф».

цифровуюфотовидеокамеру «ДиаМорф» в составе комплекта.

Трансмиссионная электронная микроскопия.

Для проведения трансмиссионной электронной микроскопии, глаза энуклеировали через 1 неделю и 1 месяц после эксперимента. Из зоны фиксировали в течение суток в 1,5% растворе глютаральдегида на какодилатнатриевом буфере (pH=7.4) при t = 4С с последующей дофиксацией в 1% растворе осмиевой кислоты (OsO4). Далее образцы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и пропиленоксиде, заливали в полимерную смолу Эпон 812 (SPIsupplier, США). Из полимеризованных блоков изготавливали полутонкие срезы (толщиной 1-1,5 мкм) на ультратомеNova (LKB, Швеция), которые окрашивали полихромным красителем (метиленовый синий, азур II «Фотомикроскопе III» (Opton, цифровуюфотовидеокамеру и морфометрический анализ изображений проводили с помощью программного обеспечения фирмы «Мекос». Под контролем оптического микроскопа затачивали пирамиду в интересующей области для получения ультратонких срезов (серебристо-серого цвета). Далее осуществляли ручное контрастирование спиртовым раствором уранилацетата и солями свинца (по методике Рейнольдца). Ультраструктурное исследование проводили на трансмиссионном электронном микроскопе EMГермания) при ускоряющем напряжении фотопластиныKodakelectron, США. Для перевода изображения в цифровой формат использовали сканер.

коллагена роговицы.

Для проведения процедуры формирования «сшивок» коллагена роговицы использовали прибор «UV-X версия 1000» (авторские права принадлежат компании IROCAG, Швейцария, август 2006г.). Прибор UV-X, представляет собой персональный медицинский оптикоэлектронный прибор, систему источника УФ излучения для медицинской терапии (фотодинамической терапии) класса IIа, и соответствует существующим требованиям положений 93/42/ЕЕС приложение IV. Излучающие УФ диоды («LED») прибора создают UV-A излучение с длиной волны 365 нм. Прибор используется для воздействия УФ-излучения на роговицу глаза во время процедур крослинкинга. UV-X прибор обеспечивает постоянную дозу UV-A излучения для целевой области воздействия.

Апертура пучка УФ-излучения имеет диаметр примерно 25мм.

Плоскость воздействия расположена на расстоянии примерно 50мм от апертуры пучка. Диаметр в плоскости воздействия можно выбирать с помощью колёсика апертуры. Доступны три размера диаметра: S – малый, диаметр приблизительно 7,5 мм; M – средний, диаметр приблизительно 9, мм; L – большой, диаметр приблизительно 11,5 мм.

Схема проведения ФДТ.

Условия облучения: сеанс проводится сразу после насыщения роговицы соответствующим фотосенсебилизатором. Облучение происходит ультрафиолетовым светом (длина волны 376-375 нм) на расстоянии 5см и плотностью мощности (3мВт/см2). Длительность облучения составляет минут.

инстилляционной анестезией в центральной зоне диаметром 8-11 мм.

Контроль: Измерение УФ – излучения проводится перед каждым сеансом облучения по средствам специально адаптированного датчика идущего в комплекте с прибором «UV-X версия 1000».

В качестве фотосенсибилизаторов использовали:

1. Водный раствор рибофлавина 0,1%.

Активное вещество препарата РИБОФЛАВИН-МОНОНУКЛЕОТИД – в офтальмологии применяется при чашеобразных катарактах, применяют 1 % раствор рибофлавин-мононуклеотида для инстилляций в конъюнктивальный мешок. Регистрационные данные о лекарственном препарате: Р №003933/01, р-р. для внутримышечного введения 1% (10 мг/1 мл): амп. 10 шт.

Производитель: «НОВОСИБХИМФАРМ, ОАО».

2. Раствор рибофлавина 0,1% в растворе декстрана 20,0% Протектор роговицы «Декстралинк» – предназначен для использования в офтальмологии при проведении процедуры УФ-кросслинкинга в условиях лечебных, лечебно-профилактических и научно-исследовательских удостоверение № ФСР 2010/09071.

Теоретическое обоснование применения препарата фталоцианинового ряда «Фотосенс» в качестве фотосенсибилизтора при проведении процедуры «кросс-линкинг».

В основе предлагаемого метода — способность структурных белков к каскадной люминесценции. Если возбуждать белковую молекулу излучением с фиксированной длиной волны, то при переизлучении, молекула белка будет испускать непрерывный спектр в более длинноволновом диапазоне, по отношению к возбуждающему излучению. Таким образом, при насыщении основного вещества роговицы фотосенсибилизирующим веществом с собственной люминесценцией (3), для которого эффективным было бы возбуждение длиной волны (2), можно добиться того, чтоб источником этого излучения стали сами молекулы структурных белков. Для этого всю роговицу необходимо экспонировать более коротковолновым излучением