На правах рукописи

Елисеев Платон Иванович

Роль молекулярно-генетических методов Genotype в повышении

эффективности диагностики туберкулеза с лекарственной устойчивостью

микобактерий и микобактериозов

14.01.16 - фтизиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2013 2

Работа выполнена на кафедре фтизиопульмонологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северный государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Марьяндышев Андрей Олегович – доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заведующий кафедрой фтизиопульмонологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Официальные оппоненты:

Васильева Ирина Анатольевна – доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела фтизиатрии Федерального Государственного Бюджетного Учреждения «Центральный Научно-исследовательский Институт» Российской Академии Медицинских Наук Журавлев Вячеслав Юрьевич – кандидат медицинских наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории этиологической диагностики отдела лабораторной диагностики Федерального Государственного Бюджетного Учреждения «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации Ведущее учреждение: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «17» декабря 2013 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 208.092.01 при ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (191036, Санкт-Петербург, Лиговский пр., д. 2/4, тел. (812) 579-25-54).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «СанктПетербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии»

Минздрава России (191036, Санкт-Петербург, Лиговский пр., д. 2/4, тел. (812) 579-25-87).

Автореферат разослан «_» ноября 2013 года

Ученый секретарь совета доктор медицинских наук, профессор Виноградова Татьяна Ивановна Актуальность работы и степень ее разработанности. В течение последних лет отмечается неуклонный рост числа ежегодно регистрируемых случаев туберкулеза (ТБ) с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (МЛУ и ШЛУ) (ВОЗ, 2012). В Российской Федерации доля МЛУ ТБ среди впервые выявленных больных составляет 14,4% (Туберкулез в Российской Федерации 2010 г. Аналитический обзор статистических показателей, используемых в Российской федерации, 2011). В Архангельской области данный показатель в 2010 году составил 35,1% (ВОЗ, 2012). На этом фоне все более значимыми становятся вопросы, связанные с уменьшением сроков определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза, ранней госпитализацией больного в специализированное МЛУ/ШЛУ отделение и своевременным началом лечения (ВОЗ, 2010).

Все большую актуальность приобретают вопросы лечения заболеваний, вызываемых микобактериями, не относящимися к туберкулезному комплексу (НТМБ), так называемых «микобактериозов», что в значительной степени связано как с улучшением их диагностики (Макарова М.В., 2011; Дорожкова И.Р., 2012), так и с эпидемией ВИЧ-инфекции (Гунтупова Л.Д., 2011).

Зачастую трудности диагностики микобактериозов обусловлены их клиническим сходством с туберкулезом (Гунтупова Л.Д., 2011), а классические бактериологические тесты определения вида микобактерий занимают много времени и не обладают достаточной специфичностью (Макарова М.В., 2007).

В настоящее время в этиологической диагностике туберкулеза и микобактериозов широко используют молекулярно-генетические методы исследования, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция. Эти методы позволяют значительно сократить время диагностики туберкулеза, определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis (МБТ) (Bwanga F., 2009) и вида микобактерии (O'Donnell N., 2012; Safianowska A., 2010). В работах Ling D.I. (2008) показана высокая специфичность и чувствительность метода Genotype (Hain Lifescience). На основе мета-анализа этих данных Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала включить в национальные противотуберкулезные программы метод Genotype для диагностики МЛУ ТБ. Имеются сведения об информативности этого метода противотуберкулезным препаратам (ПТП) второго ряда и диагностики микобактериозов (Brossier F., 2010). Однако остается неизученным вопрос применения метода Genotype в ежедневной практике противотуберкулезной службы в регионах со значительным распространением лекарственной устойчивости МБТ.

туберкулеза с лекарственной устойчивостью МБТ и микобактериозов на основе применения молекулярно-генетических методов Genotype.

Задачи исследования:

1. Определить достоверность результатов использования метода Genotype MTBDRplus лекарственной устойчивостью МБТ.

';

2. Изучить возможность использования метода Genotype MTBDRsl для определения резистентности МБТ к этамбутолу, офлоксацину, капреомицину и канамицину при диагностике туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью.

Mycobacterium CM для верификации случаев заболевания микобактериозами и оценить результаты лечения данной группы заболеваний.

микобактериозом с использованием молекулярно-генетических методов.

Научная новизна исследования. Впервые доказана эффективность использования метода Genotype MTBDRplus в сравнении с результатами метода Bactec MGIT 960 при диагностике МЛУ ТБ в Архангельской области.

Впервые доказана высокая специфичность метода Genotype MTBDRsl при капреомицину и низкая – при диагностике лекарственной устойчивости к канамицину и этамбутолу. Впервые проведен анализ случаев верификации микобактериозов и результатов их лечения в Архангельской области.

Создан алгоритм бактериологической диагностики микобактериозов и туберкулеза с определением лекарственной чувствительности МБТ на основе использования молекулярно-генетических методов Genotype.

сравнительное исследование эффективности фенотипических и молекулярногенетических методов выявления и характеристики возбудителей микобактериальных поражений органов дыхания. Продемонстрированы преимущества молекулярно-генетических методов выявления лекарственной чувствительности МБТ по сравнению с фенотипическими методами.

Доказана клинико-диагностическая значимость использования методов Genotype у больных ТБ, в том числе с массивным бактериовыделением, представляющих наибольшую эпидемическую опасность. Показана эффективность метода Genotype MTBDRplus для раннего выявления случаев МЛУ ТБ, своевременной госпитализации и начала лечения заболевания.

выявления устойчивости МБТ к этамбутолу и ПТП второго ряда с целью коррекции схемы химиотерапии (ХТ) при выявлении дополнительной устойчивости.

Изучены возможности верификации микобактериозов на основании результатов использования метода Genotype Mycobacterium CM.

Разработан алгоритм этиологической диагностики туберкулеза и микобактериозов на основе комплекса фенотипических и молекулярногенетических технологий.

учреждениях Северо-Западного Федерального округа Российской Федерации: ГБУЗ Архангельской области «Архангельский клинический «Республиканский противотуберкулезный диспансер»; ГОБУЗ «Мурманский областной противотуберкулезный диспансер»; ГБУЗ Республики Коми «Республиканский противотуберкулезный диспансер», а также в учебном процессе на кафедре фтизиопульмонологии ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет» Минздрава России; кафедре лучевой диагностики, терапии, онкологии, урологии и фтизиатрии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет» Минобрнауки России.

Методология и методы исследования. Диссертационная работа основана на обследовании 612 человек, в том числе 595 больных туберкулезом («новым случаем», «рецидивом») и 17 – микобактериозом. В работе использованы методы: молекулярно-генетические (Genotype) и референтные – фенотипические (посев и постановка теста лекарственной чувствительности (ТЛЧ) в автоматизированной системе Bactec MGIT 960 (с Левенштейна-Йенсена). Методы работы одобрены этической комиссией ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет»

Минздрава России.

Положения, выносимые на защиту:

чувствительностью и специфичностью при выявлении туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью МБТ.

устойчивость МБТ к ПТП второго ряда, диагностировать случаи ШЛУ ТБ и проводить коррекцию химиотерапии.

Метод Genotype Mycobacterium CM позволяет верифицировать случаи микобактериозов и назначать этиотропную терапию.

Разработанный алгоритм на основе применения молекулярногенетических методов Genotype обеспечивает повышение эффективности микобактериозов.

определены цель и задачи работы, дизайн исследования, проведен поиск и анализ литературы, бактериологическое и молекулярно-генетическое обследование пациентов. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован автором лично.

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 2 в научных журналах и изданиях, которые включены в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций.

Диссертация апробирована на расширенном заседании проблемной комиссии «Гигиена, физиология труда, экология и безопасность в ЧС» ГБОУ ВПО «Северный государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол №4.2 от 24 сентября 2013 года). Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом» (С.Петербург, Российско-Норвежской конференции «Междисциплинарные подходы к социально значимым заболеваниям»

(Архангельск, 2011); научно-практической конференции «Нанотехнологии в диагностике лекарственно-устойчивого туберкулеза» (Архангельск, 2011);

42-й и 43-й ежегодной конференции Международного союза борьбы с туберкулезом и заболеваниями легких (Лилль, Франция, 2011; КуалаЛумпур, Малайзия, 2012); научно-практической конференции пульмонологической помощи населению» (С.-Петербург, 2011); научнопрактической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей»

(Москва, 2012); 1 конгрессе Национальной ассоциации фтизиатров «Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации» (С.-Петербург, 2012), 6-й Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2013), 34-м ежегодном конгрессе Европейской ассоциации микобактериологии (Флоренция, Италия, 2013).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 97 страницах, состоит из введения, 4 глав, включающих обзор литературы, характеристику материалов и методов исследования, результаты исследования и их обсуждение, а также выводов и практических рекомендаций. Список литературы содержит 142 источника, из которых 64 – отечественные и 78 – иностранные. Текст диссертации включает 36 рисунков и 14 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обследовано 612 пациентов, в том числе 595 больных туберкулезом легких (у 512 заболевание зарегистрировано впервые, у 83 – отмечался «рецидив») и 17 – микобактериозом. Среди 512 больных туберкулезом легких с категорией результатам микроскопии мазка мокроты, 322 (62,9%) - по результатам посева мокроты на питательные среды. Из 83 больных туберкулезом легких с категорией «рецидив» у 45 (54,2%) человек бактериовыделение установлено методом микроскопии, у 61(73,5%) – методом посева. Среди всех пациентов с категориями «новый случай» и «рецидив» зарегистрировано 145 пациентов с МЛУ ТБ. Все пациенты (n = 17) с НТМБ, выявленные с 2010 по 2012 год в Архангельской области, были включены в исследование. Дизайн исследования – проспективное сплошное.

Обследование пациентов включало 4 этапа.

микроскопии мокроты, посева на питательную среду Левенштейна-Йенсена и на жидкую питательную среду с применением автоматического анализатора Bactec MGIT 960 с использованием трех образцов.

противотуберкулезным препаратам первого ряда. При положительных результатах микроскопии нативного материала проводили его исследование методом Genotype MTBDRplus, а также осуществляли посев на питательную среду Bactec MGIT 960.

этамбутолу и противотуберкулезным препаратам второго ряда. При обнаружении МБТ с МЛУ выполнялось определение устойчивости к ПТП второго ряда методом Genotype MTBDRsl и абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена (МАК).

IV. Идентификация нетуберкулезных микобактерий проводилась с отрицательного результата при исследовании культуры методом Genotype MTBDRplus.

Исследования с помощью методов Genotype выполнялись в соответствии с рекомендациями производителя (Hain Lifescience, 2009).

Тесты основаны на DNA•STRIP-технологии и позволяют проводить молекулярно-генетическую идентификацию МБТ. Для выявления мутаций и определения лекарственной чувствительности на DNA-стрипы нанесены зонды, соответствующие пробам «дикого типа» (wild types) и «мутантным»

пробам. Пробы «дикого типа» охватывают важнейшие участки устойчивости каждого гена (rpoB, katG, и inhA, gyrA, 16S rРНК (rrs) и embB). Отсутствие сигнала хотя бы в одной пробе «дикого типа» указывает на устойчивость тестируемого штамма к соответствующему антибиотику. Genotype Mycobacterium CM позволяет определить специфичные нуклеотидные последовательности гена 23S rРНК и идентифицировать микобактерии, в том числе НТМБ. Оценка полученных результатов проводилась с помощью стандартного шаблона.

Статистический анализ. Подготовка баз данных и математические вычисления проводились в табличном редакторе MS Excel. Расчет показателей чувствительности и специфичности методов Genotype, а также 95% доверительных интервалов осуществлен на персональном компьютере с использованием статистических программ EpiInfo и Epitable.

Результаты определения множественной лекарственной устойчивости МБТ методами Bactec MGIT 960 и Genotype MTBDRplus У 211 больных с положительным результатом микроскопии мокроты (183 – с категорией «новый случай» и 28 – с категорией «рецидив») мы устойчивости МБТ к рифампицину и изониазиду в сравнении с Bactec MGIT 960. Не удалось интерпретировать результаты Genotype MTBDRplus у (3,3%) больных, у 27 (12,8%) не определены результаты метода Bactec MGIT 960 в связи с отсутствием роста или контаминации, у 4 (1,9%) – выявлены штаммы НТМБ (у двух пациентов – M. avium, и у двух – M. intracellulare).

Поэтому дальнейшему анализу были подвергнуты 173 больных, в том числе 153 - впервые выявленным туберкулезом легких и 20 – рецидивом.

У пациентов с впервые выявленным заболеванием при использовании метода Genotype MTBDRplus устойчивость к изониазиду выявлена в 70 (45,8%) случаев, к рифампицину – в 57 (37,3%), к обоим препаратам (МЛУ) – в (37,3%), при использовании метода Bactec MGIT 960 соответственно – (47,7%); 55 (35,9%); 55 (35,9%).

Среди больных рецидивом туберкулеза легких устойчивость, определенная методом Genotype MTBDRplus, составила: к изониазиду – 80,0% (16), к рифампицину – 70,0% (14), к обоим препаратам – 70,0% (14), методом Bactec MGIT 960 соответственно - 80,0% (16); 70,0% (14);

70,0% (14).

лекарственной чувствительности МБТ изученными методами показал их сопоставимость к изониазиду – у 170 человек (98,3 %), к рифампицину, а также двум препаратам одновременно (МЛУ) – у 171 (98,8 %).

Чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDRplus для изониазида, рифампицина и МЛУ представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Чувствительность, специфичность и доля совпадений результатов, полученных при использовании методов Genotype MTBDRplus и Bactec MGIT Исследуемый Рифампицин Проведенное исследование показало, что у микобактерий, устойчивых к изониазиду, наиболее часто встречались мутации, локализованные в кодоне 315 гена katG (99,0%), включая 7 штаммов, у которых выявлены изменения одновременно в генах katG и inhA. У микобактерий, устойчивых к рифампицину, преобладали мутации в кодоне 531 гена rpoB (88,8%) (таблица 2).

Расхождение в результатах двух методов определено только у 5 (2,9%) пациентов. Так, в трех случаях возбудитель туберкулеза методом Genotype MTBDRplus рифампицину, методом Bactec MGIT 960 – устойчивый к изониазиду при сохраненной чувствительности к рифампицину. В связи с этим проведено тестирование лекарственной чувствительности на среде ЛевенштейнаЙенсена, которое подтвердило результаты Genotype MTBDRplus. В двух других случаях методом Genotype MTBDRplus установлена устойчивость МБТ к изониазиду и рифампицину. Однако по данным, полученным методом Bactec MGIT 960, устойчивость имелась к изониазиду при сохраненной чувствительности к рифампицину. Во втором случае отмечено совпадение с результатами метода Bactec MGIT 960 (устойчивость к изониазиду и чувствительность к рифампицину), в последующем аналогичные данные определены при выполнении культурального теста на среде Левенштейна – Йенсена.

Таблица 2 – Анализ мутаций, приводящих к устойчивости к изониазиду и рифампицину MTBDRplus и Bactec MGIT 960, можно объяснить наличием редких мутаций, не определяемых в данной версии теста, а также присутствием как чувствительных, так и устойчивых микобактерий в популяции возбудителя.

Согласно данным нашего исследования, присутствие и чувствительных, и устойчивых микобактерий имело место в 5 случаях (2,9%), когда в культуре одновременно выявлены «дикие» и «мутантные» штаммы.

чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDRplus. Результаты методов Genotype MTBDRplus и Bactec MGIT 960 продемонстрировали высокую долю лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду, особенно в группе пациентов с рецидивом заболевания. Подавляющее большинство лекарственно устойчивых штаммов (88,8 %) характеризовалось мутациями, локализованными в кодонах 531 гена rpoB и 315 гена katG, что говорит о широком распространении данных штаммов среди больных с МЛУ ТБ в Архангельской области.

Результаты определения ШЛУ методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена и методом Genotype MTBDRsl Эффективность использования метода Genotype MTBDRsl с целью диагностики устойчивости МБТ к этамбутолу и ПТП второго ряда изучена у 123 (84,8%) больных МЛУ ТБ, из 145 зарегистрированных в Архангельской области в 2010 году. 22 человека не вошли в анализ проведенного исследования в связи с отсутствием роста МБТ на питательной среде ( больной) и смертью одного пациента до начала лечения. Проведено сравнение результатов, полученных с применением метода Genotype MTBDRsl и абсолютных концентраций на среде Левенштейна – Йенсена.

Среди 123 пациентов с МЛУ туберкулезом устойчивость к этамбутолу методом Genotype MTBDRsl выявлена в 71 случае (57,7%), методом абсолютных концентраций – в 99 (80,5%). Причем, у двух пациентов отмечено одновременное присутствие как проб «дикого типа», так и мутаций. В обоих случаях присутствовала мутация М306V гена embB.

Совпадение результатов двух методов зарегистрировано у 81 пациента (65,9%). Чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDRsl для этамбутола составили 64,6% (95% ДИ 54,3 – 73,8) и 70,8% (95% ДИ 48,8 – 86,6) соответственно. Мутации в гене embB, обнаруженные в ходе исследования, представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Мутации в гене embB, обнаруженные в ходе исследования устойчивости к этамбутолу Присутствующие мутации (mutation probe) Устойчивость к канамицину методом Genotype MTBDRsl выявлена у (7,3%) из 123 пациентов, методом абсолютных концентраций - у 18 (14,6%).

Мутации в гене rrs, установленные в ходе исследования, представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Мутации в гене rrs, обнаруженные в ходе исследования устойчивости к канамицину и капреомицину Присутствующие мутации У двух пациентов выявлено одновременное присутствие как «проб дикого типа», так и мутаций. В одном случае присутствовала мутация A1401G гена rrs, в другом – мутация G1484T. Совпадение результатов тестирования двумя методами отмечено у 106 пациентов (86,2%).

канамицина составила 27,8% (95% ДИ 10,7 – 53,6) и 96,2% (95% ДИ 90,0 – 98,8) соответственно.

Из 123 обследованных пациентов устойчивость к капреомицину методом Genotype MTBDRsl определена у 9 (7,3%), методом абсолютных концентраций - у 13 (10,6%) (таблица 4). Полученные результаты использования двух методов были сопоставимы у 115 пациентов (93,5%).

Чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDRsl для капреомицина составила 53,8% (95% ДИ 26,1 – 79,6) и 98,2% (95% ДИ 92,9 – 99,7) соответственно.

Результаты определения устойчивости к офлоксацину 2 методами оказались схожими - у 7 (5,7%) пациентов из 123 обследованных. При этом, у одного пациента отмечено присутствие как проб «дикого типа», так и мутации. Мутации в гене gyrA представлены в таблице 5.

Таблица 5 – Мутации в гене gyrA, обнаруженные в ходе исследования устойчивости к офлоксацину Присутствующие мутации Совпадение результатов двух методов установлено у 117 пациентов (95,1%). Чувствительность и специфичность метода Genotype MTBDRsl для офлоксацина составила 57,1% (95% ДИ 20,2 – 88,2) и 97,4% (95% 92,1 – 99,3) соответственно.

Таким образом, при сравнении результатов использования метода Genotype MTBDRsl и МАК на среде Левенштейна – Йенсена специфичность оказалась высокой при определении устойчивости к офлоксацину и инъекционным препаратам, но несколько ниже – при определении устойчивости к этамбутолу. Эти результаты позволяют с высокой достоверностью регистрировать лекарственную устойчивость при выявлении мутации в соответствующих генах. Показатель чувствительности варьировал от 27% до 64%, что в случаях отсутствия мутаций не позволяет полагаться только на результаты метода Genotype MTBDRsl и требует использования дополнительных методов ТЛЧ для диагностики лекарственной устойчивости к препаратам второго ряда, в том числе ШЛУ.

Диагностика и лечение микобактериозов В нашем исследовании мы проанализировали случаи выявления НТМБ на территории Архангельской области. Для идентификации был использован метод Genotype Mycobacterium CM, позволяющий определять наиболее распространенные виды микобактерий.

С 2010 по 2012 годы в Архангельской области нетуберкулезные микобактерии были обнаружены у 17 пациентов с подозрением на туберкулез, из них женщин – 6 (35,3%) и мужчин – 11 (64,7%). В 2010 году выявлено 7 (41,2%) случаев, в 2011 и 2012 годах - по 5 (29,4%). Средний возраст больных составил 58,4 ± 12,91 лет. На момент выявления НТМБ два пациента находились в пенитенциарной системе Архангельской области. В подавляющем большинстве случаев выявлены штаммы M. avium complex : M.

avium - у 8 (47,1%) больных, и M. intracellulare - у 4 (23,5%). Данные по каждому случаю выявления НТМБ на территории Архангельской области представлены в таблице 6.

международными и российскими рекомендациями: для микобактериоза M.

avium – REClr (2 эффективных курса, 1 - продолжает лечение), KmREClr (1 эффективный курс), HREZClr (умер от микобактериоза на фоне ВИЧинфекции), MfxClrPtoKm (прерванное лечение); M. intracellulare – REClr в 3х случаях и KmZRMfxPtoPasCs/ZRMfxPtoPasCs в 1 случае (все эффективные курсы); M. gordonae – REClr (диагноз снят); M. fortuitum – AmClrLfx (эффективный курс); M. chelonae – ZPtoPasGfxAmClr (прерванное лечение).

Таким образом, эффективность химиотерапии отмечена у 9 из пациентов. Неэффективное лечение зарегистрировано у 4 пациентов: в одном случае пациент с ВИЧ-инфекцией умер от микобактериоза, два пациента прервали лечение, у одного диагноз был снят.

Таблица 6 – Характеристика микобактериозов, выявленных в Архангельской области в 2010-2012 гг.

*Примечание: ПС – пациент на момент обнаружения НТМБ находился в пенитенциарной системе В заключение можно сказать, что дифференцировать микобактериоз и туберкулез, основываясь только на клинико-рентгенологической картине, а также на результатах лабораторных исследований по обнаружению кислотоустойчивых микроорганизмов без идентификации вида микобактерии, практически невозможно. Более того, без проведения идентификации вида микобактерий возможна гипердиагностика в случае контаминации материала сапрофитными микобактериями. Применение метода Genotype Mycobacterium CM микобактериозы на территории Архангельской области и назначить адекватное лечение. Эффективность химиотерапии отмечена в 69,2% случаев, при этом основной причиной неэффективного лечения явилось прерывание его самими пациентами.

Данные исследования позволили внедрить молекулярно – генетические методы Genotype в алгоритм выявления МБТ, определения их лекарственной чувствительности, а также диагностики микобактериозов на территории Архангельской области. В частности, до начала лечения больной ТБ сдает два образца мокроты для проведения микроскопии, а также выполнения посева на плотную и жидкую питательные среды. При получении положительного результата микроскопии в одной из проб данный образец исследуется методом Genotype MTBDRplus для подтверждения присутствия МБТ, а также для определения лекарственной чувствительности к изониазиду и рифампицину. При отрицательном результате микроскопии для выделенная на питательных средах культура (рис. 1).

Рисунок 1. Алгоритм обследования больного туберкулезом для выявления M.tuberculosis и определения чувствительности к ПТП.

При наличии в образце МБТ и чувствительности к обоим препаратам для лечения назначаются препараты первого ряда. При выявлении устойчивости к рифампицину или обоим препаратам регистрируется случай МЛУ ТБ, при определении устойчивости только к изониазиду - случай ТБ, устойчивого к изониазиду, назначаются соответствующие схемы ХТ и выполняется исследование методом Genotype MTBDRsl для выявления чувствительности к этамбутолу, фторхинолонам и инъекционным ПТП. При определении устойчивости принимается решение о коррекции ХТ. У всех больных МЛУ ТБ обязательно проводится определение лекарственной чувствительности к ПТП второго ряда методом Bactec MGIT 960.

При отрицательных результатах использования метода Genotype MTBDRplus, выполняется исследование методом Genotype Mycobacterium CM с целью определения вида микобактерий, регистрации случая микобактериоза и назначения соответствующего лечения.

Разработанный алгоритм позволяет в короткие сроки выявить больных с лекарственно устойчивым ТБ, в том числе МЛУ и ШЛУ ТБ, а также своевременно диагностировать у больного микобактериоз.

ВЫВОДЫ

Genotype MTBDRplus является информативным методом для определения мутаций, ассоциированных с множественной лекарственной устойчивостью МБТ. Чувствительность и специфичность теста составила к изониазиду соответственно 96,6% и 100%, рифампицину – 100% и 98,1%, для МБТ с МЛУ – 100% и 98,1%.

Genotype MTBDRsl обладает высокой специфичностью при выявлении устойчивости M. tuberculosis к этамбутолу и ПТП второго ряда.

Чувствительность и специфичность метода составила: для этамбутола и 70,8%, для канамицина – 27,8% и 96,2%, для капреомицина – 53,8% и 98,2%, для офлоксацина – 57,1% и 97,4% соответственно.

MTBDRsl свидетельствуют об устойчивости МБТ к препарату и позволяют своевременно выявить туберкулез с устойчивостью возбудителя к этамбутолу и ПТП второго ряда. Отсутствие мутаций требует использования дополнительных методов определения лекарственной чувствительности.

Mycobacterium CM при верификации случаев заболевания микобактериозами нетуберкулезных микобактерий преобладали M. avium (47,1 %) и M.

intracellulare (23,5%).

Разработанный алгоритм обследования больного ТБ на основе молекулярно-генетических методов позволяет с высокой точностью диагностировать случаи МЛУ и ШЛУ ТБ, выявлять НТМБ и проводить верификацию микобактериозов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Метод Genotype MTBDRplus можно использовать в качестве метода скрининга у больных ТБ с массивным бактериовыделением для определения лекарственной чувствительности МБТ к изониазиду и рифампицину.

Метод Genotype MTBDRplus необходимо использовать как основной метод при диагностике МЛУ ТБ, а также у пациентов с устойчивостью к изониазиду при сохраненной чувствительности к рифампицину.

Рекомендуется использовать метод Genotype MTBDRsl для диагностики ШЛУ ТБ в комплексе с фенотипическими культуральными методами определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis к этамбутолу и противотуберкулезным препаратам второго ряда.

Метод Genotype Mycobacterium CM целесообразно применять для идентификации вида микобактерии при обнаружении кислото-устойчивых микроорганизмов в клиническом материале, выделенной культуре микобактерий и при отрицательных результатах использования метода Genotype MTBDRplus.

Разработанный алгоритм рекомендуется применять с целью диагностики туберкулеза с лекарственной устойчивостью МБТ, в том числе МЛУ/ШЛУ и микобактериозов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Елисеев, П. И. Сравнительная характеристика методов Genotype MTBDRplus и абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена при определении лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза / А. О. Марьяндышев // Материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар.

туберкулезом». – СПб., 2010. – С. 112.

2. Mann, G. Beyond accuracy: creating a comprehensive evidence base for tuberculosis diagnostic tools / G. Mann, S. B. Squire, K. Bissel, P. Eliseev, E. Du Toit, A. Hesseling, M. Nicol, A. Detjen, A. Kritski // The International Journal of tuberculosis and lung disease. – 2010. – Vol. 14, № 12. – P. 1518 – 1525.

Елисеев, П. И. Сравнение методов Genotype MTBDRsl и абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена при определении лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза к этамбутолу, офлоксацину, канамицину и капреомицину / П. И. Елисеев, Д. В. Перхин, «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом». – СПб., 2011. – С. 439.

Елисеев, П. И. Результаты применения методов GenoType MTBDRplus и BACTEC MGIT для определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза / П. И. Елисеев, Д. В. Перхин, Г. П. Горина, «Инновационные технологии в организации фтизиатрической и пульмонологической помощи населению». – СПб., 2011. – С. 89.

Елисеев, П. И. Результаты применения методов GenoType MTBDRplus и BACTEC MGIT для определения лекарственной Е. И. Никишова, Г. П. Горина, А. О. Марьяндышев // Туберкулез и болезни легких. – 2012. – № 6. – С. 31 – 34.

6. Nikishova, E. Pulmonary tuberculosis treatment based on drug susceptibility test results in Arkhangelsk region / E. Nikishova, P. Eliseev, D. Perkhin, G. Balantsev, A. Maryandyshev //

Abstract

book of 43 World conference on lung health of the international union against tuberculosis and lung disease. – Kuala Lumpur, Malaysia, 2012. – S. 311.

7. Eliseev, P. Evaluation of the impact of line probe assay on time to treatment initiation for smear-positive multidrug-resistant tuberculosis cases in the Arkhangelsk region of Russia / P. Eliseev, G. Balantsev, E. Nikishova, P. Phillips, R. Dacombe, E. Gospodarevskaya, A. Maryandyshev, S. Squire // Abstact book of 43 World conference on lung health of the international union against tuberculosis and lung disease. – Kuala Lumpur, Malaysia, 2012. – S. 421.

Елисеев, П. И. Влияние метода MTBDRplus на сроки начала лечения больных с МЛУ туберкулезом и экономическую эффективность системы здравоохранения в Архангельской области / П. И. Елисеев, Г. А. Баланцев, А. О. Марьяндышев, С. Б. Сквайер // Материалы 1-го Конгресса ассоциации «Национальная ассоциация фтизиатров». – СПб., 2012. – С. 181.

Баланцев, Г.А. Технология количественно-качественной оценки новых методов диагностики туберкулеза / Г. А. Баланцев, П. И. Елисеев, Е. Н. Богданова, Е. И. Никишова, А. О. Марьяндышев // Материалы 1-го Конгресса ассоциации «Национальная ассоциация фтизиатров». – СПб., 2012.

– С. 218.

10. Никишова, Е. И. Результаты лечения больных туберкулезом легких в Архангельской области в соответствии с тестами лекарственной чувствительности МБТ / Е. И. Никишова, П. И. Елисеев, Д. В. Перхин, Г. А. Баланцев, А. О. Марьяндышев // Материалы 1-го Конгресса ассоциации «Национальная ассоциация фтизиатров». – СПб., 2012. – С. 120.

11. Елисеев, П. И. Результаты применения методов Genotype для определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза к препаратам первого и второго ряда в Архангельской области / П. И. Елисеев, Е. И. Никишова, И. В. Тарасова, Г. П. Горина // Материалы науч.-практ.

конф. молодых ученых с междунар. участием, посвящ. всемирному дню борьбы с туберкулезом, «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей». – М., 2012. – С. 37.

12. Eliseev, P. I. Epidemiological analyses of tuberculosis in Arkhangelsk, Russia and implementation of a rapid assay for detection of resistance in this high burden setting / P. I. Eliseev, A. O. Maryandyshev, E. I. Nikishova, I. V. Tarasova, G. P. Gorina, E. Chryssanthou, M. Malin Ridell, L. Larsson // International Journal of Mycobacteriology. – 2013. – Vol. 2, № 2. – P. 103 – 108.

13. Eliseev, P. I. Epidemiological analyses of tuberculosis in Arkhangelsk, Russia and implementation of a rapid assay for detection of resistance in this high burden setting / P. I. Eliseev, A. O. Maryandyshev, E. I. Nikishova, I. V. Tarasova, G. P. Gorina, E. Chryssanthou, M. Ridell, L. Larsson // Scientific Program including Abstracts of Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology. – Florence, Italy, 2013. – P. 70.

14. Чернокова, Е. Ф. Выявление и лечение микобактериозов с применением метода Genotype Mycobacterium CM в Архангельской области / Медицинского Университета. – Архангельск, 2013. – № 1. – С. 80.

15. Елисеев, П. И. Результаты применения метода GenoType MTBDRsl для определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза к этамбутолу, офлоксацину, канамицину и капреомицину в Архангельской области / П. И. Елисеев, И. В. Тарасова, Е. И. Никишова, А. О. Марьяндышев // Туберкулез и болезни легких. – 2013. – № 1. – С. – 36.

Clr - кларитромицин Сm – капреомицин Cs – циклосерин Km – канамицин Lfx – левофлоксацин MAC – Mycobacterium avium complex Mfx – моксифлоксацин Pas – Пара-аминосалициловая кислота (ПАСК) Pto – протионамид R – рифампицин Z – пиразинамид ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВОЗ – Всемирная Организация Здравоохранения ГБУЗ АО АКПТД – Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Архангельской области «Архангельский клинический противотуберкулезный диспансер»

ДИ – 95% доверительный интервал МАК – метод абсолютных концентраций определения лекарственной чувствительности на среде Левенштейна-Йенсена МБТ – микобактерия (ии) туберкулеза МЛУ – множественная лекарственная устойчивость НТМБ – нетуберкулезные микобактерии ТЛЧ – тест лекарственной чувствительности ПТП – противотуберкулезные препараты ПЦР – полимеразная цепная реакция РФ – Российская Федерация ТБ – туберкулез ХТ – химиотерапия ШЛУ – широкая лекарственная устойчивость