На правах рукописи
ЗАЙНУЛЛИНА ЛИАНА ФАНЗИЛЕВНА
РЕГУЛЯЦИЯ NMDA-РЕЦЕПТОРАМИ ФУНКЦИЙ
Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Уфа – 2013
Работа выполнена в лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук
Научный руководитель:
Вахитова Юлия Венеровна Доктор биологических наук
Официальные оппоненты:
Веселов Станислав Юрьевич Доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО Башкирский Государственный Университет Гейн Сергей Владимирович Доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии развития микроорганизмов ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН ФГБУН Институт биоорганической
Ведущая организация:
химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Защита диссертации состоится «18» декабря 2013 г. в «» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, проспект Октября, 71, ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, проспект Октября, д. 71;
с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН:
vak.ed.gov.ru; ibg.anrb.ru e-mail: [email protected].
Автореферат разослан «18» ноября 2013г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н С.М. Бикбулатова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Нейромедиаторы традиционно рассматриваются в качестве молекул, секретируемых нервными окончаниями и влияющих на те или иные функции нервных клеток. Вместе с тем появляется все больше доказательств функционирования нейромедиаторной системы глутамата на периферии (Gill, 2001).
На сегодняшний день в клетках иммунной системы обнаружены оба класса глутаматных рецепторов - метаботропные и ионотропные (mGluR и iGluR), а также система транспортеров медиатора в клетку из внешней среды (Pacheco, 2007).
Полагают, что глутамат играет определенную роль в иммунорегуляции в качестве нейро-иммуномедиатора (Levite, 2012). Считается, что глутамат, связываясь с метаботропными и ионотропными рецепторами на мембране иммунокомпетентных клеток, принимает участие в регуляции пролиферации (Lombardi, 2004), секреции цитокинов, в механизмах дифференцировки субпопуляций Т-хелперов (Gao, 2011), в контроле клеточного цикла и апоптоза (Lombardi, 2001), изменения мембранного потенциала клеток (Poulopoulou, 2005), в усилении образования свободных радикалов (Boldyrev, 2004), в интегрин - опосредованной адгезии к гликопротеинам экстраклеточного матрикса (Ganor, 2003). На наш взгляд, заслуживают внимания данные об участии iGluR и mGluR в регуляции кальциевого гомеостаза в активированных Т-клетках (Lombardi, 2001; Miglio, 2005). Между тем, на данный момент имеются лишь единичные работы, в которых показана экспрессия субъединиц NMDA-рецепторов в иммунокомпетентных клетках (Miglio, 2005; Kvaratskhelia, 2009;
Mashkina, 2010). В основном авторы ограничиваются тем, что демонстрируют представленность только GluN1-субъединицы. Однако известно, что функциональноактивные NMDA-рецепторы формируются в результате ассоциации GluN1субъединицы с представителями GluN2- и/или GluN3-семейств. Таким образом, вопрос о субъединичном составе NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах человека на данный момент остается открытым. Кроме того, несмотря на накопленный экспериментальный материал, механизмы стимуляции и регуляции активности NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах остаются в значительной степени не изученными.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы - исследование структуры NMDAрецепторов и их роли в регуляции функций Т-лимфоцитов человека.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Идентифицировать и локализовать субъединицы NMDA-рецепторов в Т- лимфоцитах человека;
2. Изучить возможное участие NMDA-рецепторов в механизмах депо зависимого входа Са2+ в Т-лимфоциты;
3. Изучить вклад NMDA-рецепторов в регуляцию пролиферации, прогрессии клеточного цикла и апоптоза Т-лимфоцитов, активированных через Т-клеточный комплекс;
4. Исследовать вовлеченность NMDA-рецепторов в регуляцию процесса дифференцировки Т-лимфоцитов и секреции цитокинов;
5. Выявить пути сигнальной трансдукции, сопряженные с NMDA-рецепторами Т-лимфоцитов человека.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование субъединичного состава NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах человека. С применением трех методических подходов идентифицированы и локализованы субъединицы NMDA-рецепторов в этом типе клеток. Показано, что при активации Тлимфоцитов происходит изменение субъединичного состава NMDA-рецепторов:
GluN1/GluN2B и/или GluN2D в нестимулированных клетках на GluN1/GluN2A и/или GluN2B в TCR-стимулированных Т-лимфоцитах. Установлено, что NMDA-рецепторы являются компонентами депо - зависимого входа Ca2+ в Т-лимфоциты. Показано участие глутаматных рецепторов NMDA подтипа в регуляции апоптоза и клеточного цикла активированных Т-лимфоцитов. Впервые выявлена вовлеченность NMDAрецепторов в регуляцию пролиферативного ответа Т-лимфоцитов при активации последних через Т-клеточный комплекс. Проведенные исследования дополнили имеющиеся сведения об участии NMDA-рецепторов в контроле секреции про- и противовоспалительных цитокинов и регуляции процесса дифференцировки Тлимфоцитов. В работе впервые охарактеризованы протеинкиназные каскады, участвующие в передаче сигнала от NMDA-рецепторов в клетках иммунной системы.
Научно-практическая значимость. Работа посвящена исследованию фундаментальной проблемы изучению механизмов нейроиммунного структуре NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов человека и их участии в механизмах регуляции ключевых функций иммунокомпетентных клеток, что позволяет, по крайней мере, частично, выявить общие закономерности взаимодействия нервной и иммунной систем. Расшифровка механизмов этого взаимодействия имеет как фундаментальное, так и прикладное значение, связанное, главным образом, с совершенствованием диагностики и формированием новых подходов к фармакотерапии воспалительных нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, изучение механизмов активации и регуляции NMDA-рецепторов в Т-лимфоцитах человека позволяет расширить теоретические знания об особенностях сигнализации в электрически невозбудимых клетках.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XIV Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология - Наука XXI века” (Пущино, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация»
(Пущино, 2011, 2013), III Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012), IV Международной научнопрактической конференции «Проблемы современной биологии» (Москва, 2012), XXV Международной зимней молоджной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2013), VI Российском Симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), 38-м Конгрессе Федерации европейских биохимических сообществ «Биологические механизмы» (Санкт-Петербург, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе, статья в журнале из перечня ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3-6), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 234 наименования, в том числе 229 работ иностранных авторов. Работа изложена на 152 страницах и содержит 27 рисунков и 7 таблиц.
Благодарности. Автор благодарит сотрудников лаборатории молекулярной фармакологии и иммунологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Салимгарееву М.Х., аспирантов Фаткуллину У.Ш. и Кудоярова Э.Р. за помощь при выполнении и обсуждении работы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объекта исследований использовали Т-лимфоциты периферической венозной крови условно-здоровых доноров-добровольцев. Все доноры давали письменное добровольное согласие на участие в исследовании. Работа получила одобрение в Локальном этическом комитете при ФГБУН ИБГ УНЦ РАН.Забор крови (20 мл) осуществляли из локтевой вены в амбулаторных условиях.
Выделение мононуклеаров проводили по стандартной методике градиентного центрифугирования в плотности фиколла (1.077 г/см3) (Boyum, 1968).
Культивирование лимфоцитов проводили в полной среде культивирования RPMIсодержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, США), 210-3 M L-глутамина (или без L-глутамина) и 50 мкг/мл гентамицина сульфата (ПанЭко, Россия). Активацию клеток проводили инкубацией с фитогемагглютинином (ФГА; 10 мкг/мл; ПанЭко, Россия), моноклональными антителами (МКА) против субъединицы CD3 (аCD3 МКА, клон OKT3; eBioscience, США), антителами против CD28 (aCD28 МКА, клон CD28.2; BD Pharmingen™, США), рекомбинантным IL-2 ( нг/мл; Invitrogen, США) в течение 24-72 ч. Участие NMDA-рецепторов в регуляции функций Т-клеток устанавливали с помощью неконкурентного антагониста (+)-МКМ; Tocris, США). Для оценки пролиферации активированных Тлимфоцитов использовали набор «CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit» (Invitrogen, США). Все процедуры проводили в соответствии с протоколом производителя.
Анализ клеточного цикла осуществляли на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США) после окрашивания клеток пропидием йодидом (PI).
Численную обработку гистограмм проводили с помощью модуля для оценки клеточного цикла и пролиферации программы FCS Express 4.0 (De Novo Software, Канада). Характеристику апоптотических событий проводили с помощью набора «Annexin V-FITC Kit» (Beckman Coulter, США) в соответствии с протоколом производителя. Измерение уровня цитокинов проводили с помощью коммерческих наборов для иммуноферментного анализа «ИФА-IL6», ИФА-IL10», «ИФА-TNF», «ИФА-INF» (Цитокин, Россия). Оптическую плотность образцов измеряли на мультипланшетном флуориметре EnSpire® Multimode Plate Readers (Perkin Elmer, США) при 450 нм и референсной длине волны 650 нм. Для измерения концентрации внутриклеточного Са2+ Т-лимфоциты ресуспендировали в безкальциевом буфере (1 PBS, 1.110-5 М глюкозы, 510-3 М Хепес, 210-3 М пробенецида, pH 7.4.), добавляли 210-6 M Ca2+-индикатора Fluo-4AM и 0.02% плюроновой кислоты (Invitrogen, США) и инкубировали в темноте 20 мин при 30°C.
Анализ данных о динамике уровня Са2+ проводили с помощью кинетического модуля программы FCS Express 4.0 (De Novo Software, Канада). В качестве положительного и отрицательного контролей, необходимых для расчета концентрации ионов кальция, использовали растворы иономицина (2.510-5 М) и ЭГТА (110-2 М). Содержание фосфорилированных форм протеинкиназ изучали методом проточной цитофлуориметрии с использованием антител к p-p44/42 (ERK 1/2), рSAPK/JNK 1/2, р-p38, рPKC, pCaMKII, pGSK3 (разведение 1:200; Cell Signaling, США). Анализ содержания протеинкиназ проводили по среднему геометрическому гистограммы флуоресценции. При изучении поверхностной экспрессии субъединиц NMDAрецепторов клетки ресуспендировали в 100 мкл блокирующего буфера (1 PBS + 0.5% БСА или 1 PBS, 2% глицина, 2% БСА, 0.2% желатина, 510-2 М NH4Cl, pH 7.4) и инкубировали 30 мин на льду. Далее добавляли первичные антитела к субъединицам NMDA-рецепторов (60 мин на льду). В качестве отрицательного контроля использовали изотипические антитела, рекомендованные производителем (табл. 1). В качестве маркера плазматической мембраны использовали антитела к CD45, меченные комплексом фикоэритрин - техасский красный (ECD) (разведение 1:20; Beckman Coulter, США). Клетки фиксировали 4%-ным параформальдегидом мин при 37оС и окрашивали вторичными антителами аnti-mouse/rabbit IgG (H+L), F(ab’)2 - Alexa Fluor® 488/594 (разведение 1:200) в течение 30 мин на льду. При фиксировали 4%-ным параформальдегидом в течение 10 мин при Плазматическую мембрану пермеабилизовали 0.1%-ным Triton-X100 в течение мин на льду. В дальнейшем клетки окрашивали описанным выше способом. В качестве маркера эндоплазматического ретикулума (ЭПР) использовали антитела к кальнексину (5 мкг/мл; Abcam, США). Клетки рассаживали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином (0.01%). Препарат обрабатывали реагентом Mowiol® 4- с добавлением 0.1%-ого p-фенилендиамина. Изображения получали на конфокальном микроскопе Axio Observer Z1, оснащенном лазерным сканирующим модулем LSM EXCITER VarioTwo RGB (Carl Zeiss, Германия). Для измерений использовали объектив Plan-Apochromat 63x/1,4 Oil Dic M27.
Список антител к субъединицам NMDA-рецепторов, использованных в работе Суммарную РНК выделяли с помощью коммерческого набора «Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit» (Zymo Research, США). кДНК получали из 0.5-5 мкг суммарной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием 0.5 мкг oligo(dT)12-18праймеров или «случайных» праймеров (9-меры) и 40 ед. акт. обратной транскриптазы RevertAid™ Reverse (Thermo Scientific, США). Анализ уровней мРНК проводили методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени на приборе iQ™ Multicolor RealTime PCR Detection System (BioRad, США). В качестве внутреннего контроля был использован ген HPRT1. Изменения в уровнях экспрессии генов рассчитывали с использованием значений пороговых циклов с помощью специализированной программы REST 2005 v.1.9.9 (Corbertt Research, CША).
Выделение тотального клеточного лизата (10-12106 клеток) проводили стандартным методом (Yan, 1995). Электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970) в полиакриламидном геле (ПААГ) с 0.1%-ным ДДС-Na в линейном градиенте акриламида (6 - 16 %). Электроперенос белков осуществляли с использованием оборудования Mini-PROTEAN II Electrophoresis Cell, Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer Cell (BioRad, США). Все операции выполняли в соответствии с инструкцией производителя. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли в рамках стандартного пакета методов статистического анализа Statistiсa 6.0 для Windows (StatSoft, США), GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Эксперименты проводили в 5-7 биологических повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация и локализация субъединиц NMDA-рецепторного комплекса Изучение представленности мРНК генов, кодирующих субъединицы NMDAрецепторов, а также оценку качественного и количественного изменения относительного уровня мРНК исследованных генов в стимулированных Тлимфоцитах проводили методом ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени.Согласно полученным нами данным, в Т-лимфоцитах детектируется мРНК генов, кодирующих GluN1 (GRIN1), GluN2A (GRIN2A), GluN2B (GRIN2B), GluN2C (GRIN2C), GluN2D (GRIN2D), GluN3A (GRIN3A) и GluN3B (GRIN3B) субъединицы (рис. 1).
Рис 1. Представленность мРНК генов, кодирующих субъединицы NMDA-рецепторов в покоящихся и aCD3/aCD28-стимулированных Т-лимфоцитах (2.5/1.25 мкг/мл, 24 часа).
«к» - контрольная группа нестимулированных Т-лимфоцитов; «aCD» - активированные клетки; HPRT1 - ген «домашнего хозяйства»; М - ДНК-маркер (100-3000 п.о.).
На рисунке представлены данные одного из трех независимых экспериментов.
При сравнительном анализе относительных уровней экспрессии в активированных Т-лимфоцитах нами было показано, что наиболее представленными являются мРНК генов, кодирующих GluN1-, GluN2C- и GluN3A-субъединицы, тогда как гены, кодирующие субъединицы GluN2A- и GluN2B-, экспрессируются на более низком уровне (рис. 2).