На правах рукописи

ШОСТАЛЬ ОЛЬГА АНДРЕЕВНА

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ОСВЕЩЕНИЯ

НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ

DROSOPHILA MELANOGASTER

Специальность 03.02.08 – «Экология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Сыктывкар 2010 1

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Москалев Алексей Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Болотов Иван Николаевич кандидат биологических наук, доцент Мыльников Сергей Владимирович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии Карельского научного центра Российской академии наук

Защита состоится 8 декабря 2010 года в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 004.007.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН по адресу: 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д. 28.

Факс: (8212) 24-01- E-mail: [email protected] Адрес сайта Института: http://ib.komisc.ru/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Коми научного центра Уральского отделения РАН по адресу: 167982, г. Сыктывкар, ул. Коммунистическая, д. 24.

Автореферат разослан «_» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Г. Кудяшева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Под действием света в организме животного осуществляются важные фотобиологические процессы. Суточные и годовые колебания интенсивности света являются внешними факторами, регулирующими сон, двигательную активность, покой, рост, размножение, линьку.

В ходе эволюции выработались приспособления для полезного использования световой энергии. Поэтому изменения спектрального состава света или светового режима могут вызвать патологические реакции и повлиять на скорость старения. Было обнаружено, что увеличение длины светового дня или интенсивности света приводит к значительному снижению продолжительности жизни у экспериментальных животных (Москалев и др., 2006;

Massie et al., 1993; Majercak, 2002; Sheeba еt al., 2000; Anisimov et al., 2004; Vinogradova et al., 2009), однако механизмы этого влияния изучены слабо. Предполагается, что изменение длительности светового дня влияет на общий уровень метаболизма и выработку свободных радикалов, что существенно модифицирует репродуктивную и иммунную функции организма, развитие возрастной патологии, в конечном счете, сказываясь на продолжительности жизни (Анисимов, 2003). В то же время, генетические механизмы (роль отдельных генов) при влиянии света на продолжительность жизни прежде не были изучены.

В настоящее время интерес к изучению механизмов влияния света на продолжительность жизни усилился в связи с возникшей проблемой светового загрязнения искусственными источниками освещения, свойственной большим городам. У людей искусственный свет в ночное время влияет на регуляторные процессы, отвечающие за сон, вызывает желудочно-кишечные и сердечно-сосудистые заболевания, нарушения обмена веществ и репродуктивной системы, увеличивает риск развития онкологических заболеваний (Anisimov et al., 2006; Vinogradova et al., 2009). Исследование механизмов влияния света на продолжительность жизни является актуальным для жителей северных широт, где наряду с другими неблагоприятными факторами (перепады температуры, давления, нерегулярно меняющаяся геомагнитная активность) имеют место длительные периоды «белых ночей» и «полярной ночи», что также негативно сказывается на здоровье населения и вносит свой вклад в изменение продолжительности жизни.

Удобным объектом для изучения генетических механизмов влияния светового режима на продолжительность жизни, на наш взгляд, является плодовая мушка Drosophila melanogaster, наиболее изученный в генетическом отношении модельный организм. Имеются данные, свидетельствующие об эволюционной консервативности основных регуляторных путей, контролирующих продолжительность жизни в ряду от дрожжей до млекопитающих (Kramer, 2003; Kenyon, 2005; Soti, Csermely, 2007; Puig, 2010).

Используя мутантные линии дрозофилы, несущие измененную активность различных генов, можно выявить роль определенных генов в реакции организма на изменение длины светового дня. Подобные исследования на человеке трудновыполнимы, а на млекопитающих – очень дорогостоящие. Кроме того, короткий жизненный цикл, малая продолжительность жизни (3- месяца), легкость содержания в лабораторных условиях, удобство проведения генетических экспериментов также делает дрозофилу удобной моделью для данных исследований.

Цель и задачи исследования. Цель исследований заключалась в изучении генетических механизмов влияния различных условий освещения на продолжительность жизни Drosophila melanogaster. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) исследовать динамику смертности имаго лабораторной линии дикого типа Canton-S при различной интенсивности и длительности освещения;

2) изучить роль генов Sod, mus209, mus210, dSir2, транскрипционного фактора FOXO, белков теплового шока семейства 70 в изменении продолжительности жизни Drosophila melanogaster при различных условиях освещения;

3) выявить действие антиоксиданта мелатонина на продолжительность жизни различающихся по генотипу имаго Drosophila melanogaster в связи с влиянием различных условий освещения.

Связь работы с научными программами. Исследования проводились в течение 2005-2010 гг. в рамках бюджетных тем Отдела радиоэкологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Проведенные исследования были поддержаны грантом РФФИ на 2008-2010 гг., грантом президента РФ для молодых докторов наук, грантами Президиума РАН по целевым программам «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки – медицине» на 2009-2011 гг., Молодежным научным грантом УрО РАН на 2009-2010 гг.

Теоретическая значимость и научная новизна работы. Показано, что снижение активности систем детоксификации свободных радикалов и эксцизионной репарации ДНК у дрозофил вызывает уменьшение продолжительности жизни в условиях постоянного освещения. Данный факт говорит о том, что образование дополнительного количества активных форм кислорода и повреждение молекулы ДНК вносит непосредственный вклад в изменение продолжительности жизни на свету. Показан FOXO-зависимый механизм увеличения продолжительности жизни дрозофил в темноте.

Предложена концептуальная модель механизмов влияния изменения длины светового дня на продолжительность жизни дрозофилы. Полученные результаты внесли новый вклад в понимание генетических механизмов влияния условий освещения на продолжительность жизни.

Практическая значимость работы. Результаты исследований могут быть использованы при разработке рекомендаций по снижению негативных последствий для здоровья населения светового загрязнения в крупных населенных пунктах, а также «полярного дня» и «полярной ночи» в условиях Крайнего Севера. Поскольку исследованные гены имеют место и у человека, кодируемые ими белки могут служить новыми мишенями для разработки фармакологических средств, снижающих неблагоприятные последствия искусственного увеличения длины светового дня или нарушения циркадных ритмов у человека.

Личный вклад автора. Соискатель принимал участие в постановке и решении задач исследования, в проведении экспериментальных работ, сборе материала (оценка смертности, измерение плодовитости), статистической обработке данных, анализе и обобщении полученных результатов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных конференциях молодых ученых Института биологии и Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2005-2007, 2009, 2010 гг.); на научной конференции молодых ученых Института геронтологии АМН Украины (Киев, 2009 г.); на 13 международном конгрессе Международной ассоциации биогеронтологов (Квебек, Канада, 2009); на международной научной конференции «Генетика продолжительности жизни и старения» (Сыктывкар, 2010 г.); на VIII международной конференции «Биоантиоксидант»

(Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах из списка изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего работ, в том числе 162 публикации зарубежных авторов. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста и содержит 5 таблиц и 38 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе рассматриваются две основные группы гипотез о механизмах старения: стохастическое и запрограммированное старение. Обсуждаются вопросы о роли генотипа и среды в изменчивости продолжительности жизни. Анализируются данные литературы о влиянии изменений светового режима на продолжительность жизни и старение животных: нарушение циркадных ритмов, увеличение плодовитости, интенсификация метаболизма, нейроэндокринные изменения. Приводятся данные о влияние света на продукцию гормона мелатонина и роли последнего в процессах старения.

Рассматривается участие белков теплового шока, сиртуинов и транскрипционного фактора FOXO в стресс-ответе и в регуляции продолжительности жизни организмов. Таким образом, в регуляции скорости старения и продолжительности жизни важную роль играют как генетические, так и внешнесредовые факторы, однако механизмы их взаимосвязи требуют дальнейших исследований.

Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе. В зависимости от поставленной задачи в экспериментах использовали следующие лабораторные линии Drosophila melanogaster:

1. Линия дикого типа Canton-S.

2. Линия w1118 – в качестве маркера гомозиготности несет рецессивную мутацию гена white.

3. Линия Sodn1/+ (генотип Sodn1red1/TM3,Sb1Ser1) – гетерозигота с мутацией гена цитоплазматической супероксиддисмутазы (Sod), участвующей в детоксикации O2– радикала; сохраняет только 36.7% нормальной активности фермента Cu/Zn Sod (Phillips et al., 1995).

4. Линия mus210G1/+ (генотип mus210G1/CyO) несет дефект гена mutagensensitive 210, кодирующего белок, участвующий в эксцизионной репарации нуклеотидов (гомолог белка XPC млекопитающих) (Isaenko et al., 1994;

Sekelsky et al., 2000).

5. Линия mus209B1/+ (генотип mus209B1b pr cn/CyO) несет дефект гена mutagen-sensitive 209, кодирующего белок-гомолог PCNA млекопитающих, участвующий в эксцизионной репарации в составе кофакторного комплекса ДНК-полимеразы d и сборке митотического веретена (Henderson et al., 1994; Ruike et al., 2006).

6. Линии FOXO21 (с генотипом y, w; Sp/CyO; dFOXO21 /TM6B Tb, Hu) и FOXO25 (y, w; FRT 82 dFOXO25 /TM6BTb, Hu) содержат в гетерозиготе гипоморфные аллели гена транскрипционного фактора FOXO, который участвует в реакциях стресс-ответа, регулируя различные функции клетки (пролиферацию, дифференциацию, репарацию ДНК) (Puig et al., 2003; Lee et al., 2003; Vogt et al., 2005). Для получения особей-гомозигот с пониженной активностью гена FOXO проводили скрещивание линий FOXO21 и FOXO25 (обозначены FOXO21/ FOXO25).

7. Линии с мутациями генов различных белков теплового шока семейства 70:

– w1118 ; Df(3R)Hsp70A, Df(3R)Hsp70B (обозначена Df(3R)Hsp70A, Df(3R)Hsp70B) – гомозигота, содержит делеции нескольких генов семейства Hsp70 (Hsp70Aa, Hsp70Ab, Hsp70Ba, Hsp70Bb, Hsp70Bbb и Hsp70Bc).

Линия очень чувствительна к воздействию различных видов стресса (температурный, окислительный) (Gong, Golic, 2006).

– w1118; Df(3R)Hsp70A (обозначена Df(3R)Hsp70A) – несет делеции генов Hsp70A (Hsp70Aa и Hsp70Ab).

8. Линии с мутациями гена белка сиртуина:

– Sir217/+ (генотип w1118; Sir217/SM6a) – гетерозигота по мутации гена Sir2, кодирующего белок сиртуин, который участвует в ответе на стрессовые воздействия, деацетилируя гистоны и различные транскрипционные факторы (FOXO, HSF, p53) (Sauve et al., 2006; Tanno et al., 2007).

– Sir22A-7-11 (генотип w1118; Sir22A-7-11) содержит делецию гена Sir2. Данный дефект снижает устойчивость линии к различным видам стресса.

Условия содержания дрозофил и получение экспериментального материала. Культивирование родительских линий проводили в термостате при температуре 25±1 °C и стандартном режиме освещения (12:12 ч). После появления имаго в течение суток производили отбор необходимого количества особей, мух разделяли по полу, предварительно наркотизировав эфиром, и помещали в баночки (100 мл) с 25 мл дрожжевой питательной среды (Ashburner, 1989).

В первой серии экспериментов особей линии Canton-S содержали в условиях стандартного режима освещения (12:12 ч) при интенсивности 10 лк от лампы накаливания, остальная часть особей этой линии находилась в темноте на протяжении всей жизни. Во второй серии экспериментов особей линий Canton-S, а также линий Sodn1/+, mus210G1/+ и mus209B1/+ содержали в условиях круглосуточного освещения при интенсивности 120 лк от лампы дневного света, остальная часть мух исследуемых линий находилась в темноте. Для того, чтобы исключить различия сравниваемых групп по случайным причинам, условия круглосуточного освещения и затемнения воспроизводились одновременно в пределах одной термокомнаты.

В сериях последующих экспериментов часть особей исследуемых линий с мутациями генов транскрипционного фактора FOXO, белков теплового шока, сиртуина содержали при стандартном режиме освещения (12:12 ч) при интенсивности 120 лк, остальная часть мух находилась в условиях постоянной темноты на протяжении всей жизни.

Интенсивность освещения в термокомнате измеряли прибором «Lux light meter» DVM 1300 (Velleman, China). Определение спектров проводили спектрорадиометром Field Spec HH (Analytical Spectral Devices, Inc., США).

Спектр использованной лампы дневного света (рис. 1, линия 3) был идентичен спектрам бытовых ламп дневного света (рис. 1, линия 2). Спектр лампы накаливания (рис. 1, линия 1) по сравнению со спектром солнечного света (рис. 1, линия 4) на максимуме сильно сдвинут в красно-инфракрасную область, его эффективность в видимой области низка. Известно, что дрозофилы, как и все высшие насекомые, видят все области видимого спектра (Чернышев, 1996; Биологические ритмы, 1984).

Рис. 1. Спектры бытовой лампы дневного света (2), лампы дневного света, использованной в эксперименте (3) и лампы накаливания (1) в сравнении со спектрами солнечного света (4).

Условия обработки мелатонином. В эксперименте по выявлению модифицирующего действия антиоксиданта мелатонина на продолжительность жизни при разных условиях освещения часть особей линий Canton-S, Sodn1/+, mus210G1/+ содержали в условиях круглосуточного освещения или постоянной темноты на питательной среде, смазанной дрожжевой пастой, содержащей 100 мкг/мл мелатонина (Sigma-Aldrich). Мелатонин растворяли в этиловом спирте из расчета 1 мл спирта на 100 мл пасты. Контрольные мухи получали пасту с добавлением 1 мл спирта.

Оценка продолжительности жизни и плодовитости. Подсчёт числа умерших мух проводили ежедневно. Один раз в неделю оставшихся в живых мух переносили на свежую среду без наркотизирования.

Каждую неделю оценивали плодовитость самок линий Canton-S, Sodn1/+, mus210G1/+, mus209B1/+, которых содержали в условиях круглосуточного освещения и в условиях постоянной темноты. Для этого особей женского пола (по 50 штук) помещали в баночки (100 мл) с питательной средой, подкрашенной активированным углем. Через сутки самок удаляли и производили подсчет отложенных яиц.

Статистическая оценка продолжительности жизни. Для оценки достоверности различий по продолжительности жизни в темноте и на свету применяли непараметрические критерии Гехана-Бреслоу-Вилкоксона (для оценки различий медианной продолжительности жизни) и Колмогорова-Смирнова (для сравнения кривых выживаемости) (Ермаков, 1987). Для оценки статистической значимости различий 90%-ой гибели особей применяли метод Ванг-Аллисона. Функции дожития оценивали с помощью процедуры Каплана-Мейера и представляли в виде кривых дожития (Крутько, Славин, Смирнова, 2002) в программе Statistica 6.1 (Statsoft, США). Плодовитость сравнивали по критерию Хи-квадрат (Лакин, 1990).

В главе приведены результаты экспериментального исследования по изучению влияния различных условий освещения на продолжительность жизни дрозофилы разных генотипов.

У линии дикого типа Canton-S средняя продолжительность жизни самцов, содержащихся при 12-часовом режиме освещения и интенсивности 10 лк, меньше, чем в темноте, примерно на 6%, у самок она снизилась на 11% (табл. 1, рис. 2). Аналогично изменилась и максимальная продолжительность жизни, оцененная по параметру «время гибели 90% особей».

Круглосуточное освещение с интенсивностью 120 лк также привело к снижению медианной продолжительности жизни особей – на 8% у самцов и 2% у самок. Таким образом, снижение продолжительности жизни у линии дикого типа на свету по сравнению с темнотой практически не зависело от интенсивности (10 и 120 лк) и длительности (12:12 и 24:00 ч) освещения. У самок линии Canton-S в условиях круглосуточного освещения наблюдалось увеличение ранней плодовитости, однако общий период яйцепродукции сохранялся дольше в темноте, чем на свету (рис. 3).

При круглосуточном освещении самцов и самок линии Sodn1/+ с нарушением детоксификации свободных радикалов происходило достоверное