На правах рукописи

Микулович Юлия Львовна

АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ, В ТОМ ЧИСЛЕ АНТИМИКОБАКТЕРИАЛЬНОЕ,

ДЕЙСТВИЕ ЭКЗОГЕННОГО КАРДИОЛИПИНА

Специальности 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

02.00.10 – Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2013

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова Научные руководители:

кандидат химических наук, доцент Сорокоумова Галина Моисеевна доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Селищева Алла Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, зав. лабораторией химии липидов Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Водовозова Елена Львовна кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Дерябина Юлия Ивановна Федеральное государственное

Ведущая организация:

бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита диссертации состоится «03» июня 2013 года в 15 ч 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86.

Автореферат диссертации разослан «29» апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И. Лютик

I.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

*

Актуальность темы. Несмотря на то, что к настоящему времени известно большое количество антибиотиков, борьба с туберкулезом (ТБ) до сих пор не окончена. Это связано со способностью возбудителя ТБ – Mycobacterium tuberculosis (МБТ) – переходить в дормантное (некультивируемое состояние), формируя латентную инфекцию, и приобретать резистентность к противотуберкулезным препаратам (ПТП). Эти факторы осложняют диагностику заболевания и его лечение. Схема терапии ТБ включает в себя прием одновременно нескольких ПТП в течение длительного периода времени, что сопровождается появлением у пациентов побочных эффектов. Кроме того, многие ПТП токсичны для организма человека, а лечение больных, зараженных резистентными штаммами МБТ, оказывается малоэффективным. Ввиду указанных выше недостатков ПТП актуальной является разработка принципиально новых лекарственных препаратов на основе природных наноразмерных липидных структур – липосом, которые легко захватываются фагоцитирующими клетками человека, в том числе макрофагами, в которых размножаются микобактерии туберкулеза (Bermudez L.E. et al., 1994; Kwon H.H. et al., 1995). Таким образом, с помощью липосом можно осуществить направленный транспорт лекарственных препаратов. Кроме того, минимальные ингибирующие концентрации (МИК) липосомальных форм ПТП в несколько раз меньше МИК традиционных форм препаратов (Mehta et al., 1993; Wiens et al., 2003). Как правило, липосомы с включенными в них препаратами получают на основе фосфатдилихолина (ФХ), который присутствует также в плазматической мембране фагоцитирующих клеток человека.

Ранние работы нашей лаборатории были посвящены изучению влияния «пустых»

(не содержащих антибиотик) липосом различного липидного состава (из ФХ, кардиолипина (КЛ), гликосфинголипидов) на рост Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Сорокоумова Г.М. и др., 2009). Было показано, что сами липосомы из КЛ обладают ингибирующим действием на рост этого микроорганизма. В связи с полученными результатами важным представлялось изучение действия липосомального КЛ на различные штаммы M. tuberculosis с перспективой создания новых форм лекарственных Список используемых сокращений: АФК – активные формы кислорода, БОЛВ – большие одноламеллярные везикулы (липосомы), ДК – диеновые конъюгаты, ЛК – линолевая кислота, КЛ – кардиолипин, лКЛ – лизокардиолипин, ллКЛ – бислизокардиолипин, Люц – люцигенин, Люц-ХЛ – люцигенин-активируемая хемилюминесценция, МИК – минимальная ингибирующая концентрация, МЛВ – мультиламеллярные везикулы, мРНК – матричная РНК, МЛУ – множественная лекарственная устойчивость, МБТ – микобактерии туберкулеза, Mycobacterium tuberculosis;

ОЕФ – оптические единицы флуоресценции, ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, ПТП – противотуберкулезные препараты, САР – супероксид анион-радикалы, ТБ – туберкулез, ТБК – 2-тиобарбитуровая кислота, ТБК-АП – ТБК-активные продукты, топо I – топоизомераза I, ТСХ – тонкослойная хроматография, ФК – фосфатидная кислота, ФХ – фосфатидилхолин, ШЛУ – широкая лекарственная устойчивость, ERM – эритромицин, GSH – глутатион, MALDI-TOF MS – матрично активированная лазерная десорбция/ионизация времяпролетная (time of flight) масс-спектрометрия, OD – оптическая плотность (optical density), ОFX – офлоксацин, LFX – левофлоксацин, RIF – рифампицин, SkQ1H2 – 10-(6’-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний.

препаратов для лечения туберкулеза путем инкапскулирования в липосомы на основе КЛ известных на сегодняшний день ПТП.

Цель работы – изучение антибактериальной активности экзогенного липосомального КЛ в отношении различных бактерий, в том числе M. tuberculosis, и установление возможных механизмов бактерицидного действия КЛ.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• получение и характеристика липосом на основе КЛ – липида природного происхождения, выделенного из сердца быка;

• оценка влияния липосомального КЛ на рост чувствительного к ПТП лабораторного штамма M. tuberculosis H37Rv;

• исследование действия липосом из КЛ на рост резистентных к ПТП клинических штаммов M. tuberculosis (с множественной (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ));

• изучение влияния липосомального КЛ на рост грамотрицательных и грамположительных бактерий, не относящихся к роду Mycobacterium;

• исследование стабильности липосом на основе КЛ в условиях роста M. tuberculosis (степень окисления липида, деструкция);

• выявление мишеней и механизма бактерицидного действия экзогенного липосомального КЛ на E. coli.

Научная новизна работы. Впервые исследовано влияние липосом из КЛ на рост бактерий: Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli. Установлено бактерицидное действие КЛ на чувствительный к ПТП штамм M. tuberculosis H37Rv и штаммы M. tuberculosis с МЛУ и ШЛУ (МИК = 335 мкМ), а также на E.coli (МИК = 500 мкМ) и Streptococcus pneumoniae (МИК = 100 мкМ).

Изучена стабильность препарата КЛ в виде липосом (степень окисления липида и образование продуктов его деструкции). Обнаружено несущественное окисление КЛ в течение 30 ч при комнатной температуре и в процессе инкубации КЛ в среде роста M. tuberculosis (бульоне Дюбо). В последнем случае установлен факт деструкции КЛ с образованием лизокардиолипина (лКЛ), бислизокардиолипина (ллКЛ), фосфатидной (ФК) и линолевой кислот (ЛК), идентифицированных методами ТСХ и MALDI-TOF MS.

Впервые обнаружено многофакторное воздействие экзогенного липосомального КЛ на различные системы клеток E. coli: ингибирование реакций, катализируемых ДНКтопоизомеразой II типа (ДНК-гираза), in vitro; индукция системы ДНК-репарационного SOS-ответа, повышение содержания в клетках супероксид анион-радикалов (САР).

Предложена схема бактерицидного действия липосом из КЛ на E. coli, основанного на повреждении ДНК бактерий вторичными активными формами кислорода.

Практическая значимость работы. Установлен бактерицидный эффект экзогенного липосомального КЛ в отношении ряда микроорганизмов и прежде всего M. tuberculosis.

Самым существенным является то, что такой активностью КЛ обладает в отношении не только чувствительного к ПТП штамма M. tuberculosis, но и штаммов с МЛУ и ШЛУ. Это открывает реальные возможности создания новых эффективных липосомальных форм ПТП на основе КЛ для лечения резистентных форм ТБ: включение в липосомы из КЛ известных на сегодняшний день ПТП может снизить концентрацию используемой активной субстанции, благодаря чему уменьшится токсичность препарата, и повысить эффективность действия липосомальной формы препарата на патогенные штаммы, нечувствительные к антибиотикам.

Основные положения, выносимые на защиту:

• характеристика полученных липосом из КЛ;

• бактерицидный эффект экзогенного липосомального КЛ в отношении лабораторного штамма M. tuberculosis H37Rv, чувствительного к ПТП, а также штаммов с МЛУ и ШЛУ в концентрациях выше 335 мкМ.

• действие липосом из КЛ на рост грамположительных бактерий, вызывающих инфекции верхних дыхательных путей, – Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae – и грамотрицательных на примере Escherichia coli. Антибактериальная активность КЛ в отношении Str. pneumoniae и E. coli;

• деструкция липосомального КЛ в условиях роста M. tuberculosis с образованием лКЛ, ллКЛ, ФК и ЛК. Получение продуктов деструкции, их выделение и очистка.

Использование полученных липидов для изучения их влияния на рост M. tuberculosis H37Rv;

• выявление механизма действия экзогенного липосомального КЛ на E. coli:

а) индукция системы ДНК-репарационного SOS-ответа при культивировании E. coli с липосомами из КЛ, отсутствие влияния липосомального КЛ на скорость трансляции белков, б) установление причин повреждения ДНК под действием летальных концентраций КЛ.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Россия, г. Москва, 2010); European Respiratory Society Annual Congress (Испания, г. Барселона, 2010); I и II международных научно-практических конференциях «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Россия, г. Москва, 2010; респ. Татарстан, г. Казань, 2012); VI и VII Московских международных конгрессах «Биотехнология:

состояние и перспективы развития» (Россия, г. Москва, 2011 и 2013); международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии»

(Россия, г. Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 оригинальные статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, и 8 тезисов в материалах международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, материалов и методов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 178 источников. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками и содержит 13 таблиц.

Работа выполнена при финансовой поддержке и в рамках ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» Федерального агентства по образованию (ГК № П2277, ГК № 14.740.11.0120 и Соглашение с МОН РФ № 14.В 37.21.0193).

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы диссертации, сформулирована цель и в соответствии с ней поставлены задачи исследования, указаны научная новизна и практическая значимость работы, количество публикаций и конференции, на которых были представлены основные результаты работы.

Обзор литературы состоит из трех разделов: в первом рассмотрено строение клеточной оболочки двух основных объектов исследования – бактерий M. tuberculosis и E. coli, – общим компонентом цитоплазматической мембраны которых является фосфолипид КЛ; во втором освещены физико-химические свойства, метаболизм и роль фосфолипида КЛ в клетках бактерий. Акцентировано внимание на неравномерном распределении КЛ с образованием доменов в цитоплазматической мембране, что связано с участием липида в репликации ДНК и делении клеток. В третьем разделе обсуждены известные на сегодняшний день основные группы антибиотиков, их мишени и механизмы действия.

В работе использовали динатриевую соль КЛ из сердца быка, в состав которого входят остатки линолевой (~87%) и олеиновой (~8%) кислот, степень чистоты 98% по данным ВЭЖХ («Avanti Polar Lipids», США); ЛК («Acros Organics», Бельгия), ФХ из бобов сои Lipoid S-100, степень чистоты 94% по данным ВЭЖХ («Lipoid GmbH», Германия), в составе которого содержатся преимущественно остатки ЛК (~70%); плазмиду pUC («Invitrogene», США), топоизомеразу I из E.coli («New England Biolabs», США), ДНК-гиразу из E.coli, предоставленную доктором Энтони Максвеллом («John Innes Centre», UK); люцигенин («Sigma», США).

В качестве объектов исследования использовали следующие микроорганизмы:

штаммы M. tuberculosis с различной чувствительностью к ПТП – лабораторный штамм M. tuberculosis H37Rv (чувствительный к ПТП); штамм M. tuberculosis MS-115, устойчивый к пяти ПТП 1-го ряда: рифампицину, изониазиду, стрептомицину, пиразинамиду и этамбутолу (МЛУ); штамм M. tuberculosis СS-37, резистентный, кроме перечисленных выше ПТП 1-го ряда, еще и к амикацину, капреомицину, офлоксацину (ШЛУ) (из коллекции ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН); грамположительные бактерии: штамм Staphylococcus aureus АТСС № 25923 (F-49), ГКПМ 201189; штамм Staphylococcus epidermidis 817/5 (клинический изолят из коллекции ФБУН МНИИЭМ им.

Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора); штамм Streptococcus pyogenes 23-10 (клинический изолят, ГКБ-23, Москва); штамм Streptococcus pneumoniaе 101 (клинический изолят, Инфекционный Центр Агентства Общественного Здравоохранения, Лондон, Великобритания); грамотрицательные бактерии: штаммы Escherichia coli BL21(DE3), CSH50 sfiA::lacZ; tolC, трансформированный плазмидами pRFPCER-TrpL2A и pRFPCER-PsulA.

Получение липосом. Липосомы (большие одноламеллярные везикулы, БОЛВ) из КЛ получали методом экструзии (MacDonald R.C. et al., 1991) дисперсии КЛ в 0,9% NaCl (изотонический раствор NaCl) с использованием экструдера «LiposoFast Basic» («Avestin, Inc.», США) и поликарбонатных мембран с диаметром пор 400 и 100 нм («Whatman», США). Размер частиц определяли методами турбидиметрии (Кленин В.И. и др., 1977) и фотонно-корреляционной спектроскопии, -потенциал измеряли методом электрофоретического светорассеяния.

Действие КЛ на рост M. tuberculosis. Влияние различных концентраций липосомального КЛ на рост МБТ определяли при культивировании клеток в модифицированной среде Middlebrook 7Н9 при 37°С в течение 20-42 суток в автоматизированной системе регистрации роста BACTEC MGIT 960 («BD», США). Рост микобактериальных клеток оценивали в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ).

Для оценки динамики роста культуры M. tuberculosis в бульоне Дюбо в присутствии липосом из КЛ использовали также метод количественной ПЦР (Андреевская С.Н. и др., 2006).

Жизнеспособность микобактерий оценивали их окраской по методу Мурохаши (Murohashi T. et al., 1957). Просмотр мазков осуществляли на световом микроскопе Olympus при увеличении 400 и 1000. Также выживаемость клеток определяли методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) (Андреевская С.Н. и др., 2006) по количеству мРНК. Во всех экспериментах использовали клетки МБТ, находящиеся в одной фазе роста.

Влияние КЛ на рост стрептококков, стафилококков и E. coli. Культивирование клеток стрептококков и стафилококков с липосомами из КЛ осуществляли в мясопептонном бульоне без перемешивания при 37°С в течение 24 ч, E. coli BL21(DE3) с КЛ – в жидкой среде LB в течение 5 ч при 37°С при перемешивании 200 об/мин. Для оценки роста микроорганизмов использовали метод подсчета КОЕ (проводили серии 10кратных разведений образцов, высевали их на агаризованную среду и подсчитывали число жизнеспособных клеток).

Определение степени окисления КЛ. Количество диеновых конъюгатов (ДК) определяли спектрофотометрически в этанольном растворе липида при =233 нм (Pryor W.A. et al., 1985), ТБК-активные продукты (ТБК-АП) определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Ланкин В.З. и др., 1975).

Идентификация продуктов деструкции КЛ методами ТСХ и MALDI-TOF MS.

Продукты деградации КЛ были выделены методом экстракции системой растворителей СHCl3–CH3OН (2:1) из смеси, полученной после инкубации липосом на основе КЛ в среде Дюбо (конечная концентрация КЛ 500 мкМ) в течение 10 мин (0-ые сутки) и 2 суток.

Состав липидного экстракта анализировали методом ТСХ на пластинках с флуоресцентным индикатором Kieselgel 60 F254 («Merck», Германия) в системе растворителей СHCl3–CH3OН–H2O (65:25:4) (А). Визуализацию соединений проводили при орошении пластинок раствором молибденового синего или фосфорномолибденовой кислоты (проявители 1 и 2 соответственно) с последующим прогреванием при ~120°С.

Идентифицировали вещества в общем липидном экстракте методом MALDI-TOF MS.

Масс-спектры получали на MALDI-TOF масс-спектрометре Autoflex III TOF («Bruker Daltonics», Германия) в режиме детектирования положительных ионов; N2-лазер, 337 нм;

матрица – 2,5-дигидроксибензойная кислота.

Получение лКЛ и ллКЛ проводили по модифицированной методике, изложенной в работе (Болдырев И.А. и др., 2009), с использованием лиофилизированного порошка кардиолипина из сердца быка и фосфолипазы А2 из Naja mossambica mossambica («Sigma», США).

Получение ФК полусинтезом с использованием фосфолипазы D. Сначала получали препарат неочищенной фосфолипазы D (КФ 3.1.4.4), которую использовали для получения ФК гидролизом соевого ФХ (Бергельсон Л.Д. и др., 1981).

Получение суперскрученной ДНК E. coli для реакций с топоизомеразой I и ДНК-гиразой. Cуперскрученную плазмиду pUC19 получали и выделяли щелочным лизисом по протоколу с помощью QIAGEN Plasmid Maxi Kit. Реакции с топоизомеразой I и ДНК-гиразой E. coli in vitro проводили при 37С в твердотельном термостате «Гном», рассчитанном на микропробирки типа «Eppendorf» («ДНК-технология», Россия), по методикам (Mizushima T. et al., 1992) и (Reece R.J. et al., 1989) соответственно.

Исследование накопления никованной и линейной ДНК под действием КЛ в реакциях с топо I и ДНК-гиразой соответственно проводили по методике (Heddle J.G. et al., 2001).

Люц-ХЛ клеток E. coli в присутствии КЛ и офлоксацина. Содержание О2 • (САР) в E. coli в присутствии препаратов регистрировали с помощью Люц-ХЛ на приборе «Биотокс-7» («АНО Инженерный Центр - Экология», Россия) в режиме счета фотонов (имп/с) (в течение 100 секунд). Ночную культуру клеток E. coli BL21(DE3) центрифугировали при 3,5 тыс. об/мин в течение 15 мин, отмывали фосфатным буфером (рН 8,16) и к ресуспендированным в том же буфере клеткам добавляли люцигенин (95 мкМ) и/или препараты (липосомы из КЛ, офлоксацин (OFX)).

Оценка роста E. coli и M. tuberculosis в присутствии КЛ и антиоксидантов Культивирование E. coli с липосомальным КЛ в присутствии антиоксиданта глутатиона (GSH) проводили в среде LB в течение 5 ч. Оценивали рост по КОЕ. Культивирование M. tuberculosis с липосомами из КЛ и антиоксидантом 10-(6’-пластохинонил)децилтрифенилфосфонием (SkQ1H2) осуществляли в бульоне Дюбо в течение 20 суток, измеряя ежедневно OD600.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Microsoft Office Excel. Оценку статистической значимости различий проводили с использованием критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при