На правах рукописи

Антонова Мария Олеговна

ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЛЕКСА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

И ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫХ СИСТЕМ ПРИНЯТИЯ РЕШЕНИЯ ДЛЯ

ИЗУЧЕНИЯ МОЧЕВЫХ КАМНЕЙ И МОЧИ И УСТАНОВЛЕНИЯ

СВЯЗИ МЕЖДУ НИМИ

Специальность 02.00.01 Неорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2013

Работа выполнена на кафедре «Физика и химия твердого тела» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова»

Научный руководитель: профессор, доктор химических наук Кузьмичева Галина Михайловна Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты: Федоров Павел Павлович профессор, доктор химических наук, заведующий лаборатории технологии наноматериалов для фотоники Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук Киселева Надежда Николаевна доктор химических наук, руководитель группы применения информационных технологий в материаловедении, заведующая лаборатории полупроводниковых материалов Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова Российской академии наук.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», химический факультет

Защита состоится 11 декабря 2013 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.05, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения высшего образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова»

Ваши отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86, МИТХТ им. М.В. Ломоносова

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.

Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86, МИТХТ им. М.В.

Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте http://mitht.ru.

Автореферат диссертации разослан 8 ноября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Е.Е. Никишина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Наблюдаемая в настоящее время тенденция к междисциплинарности в решении имеющихся проблем в каждой области знания не обошла и медицину, в частности, урологию. Выбор метода лечения мочекаменной болезни (МКБ) и метафилактических мероприятий напрямую зависит от состава и строения мочевых камней, состава мочи, в которой произошло их образования и рост, и связи между ними, что требует усилий не только медиков, а также специалистов в других областях науки (химия, математика, информационные технологии).

На сегодняшний день известны работы по определению качественного и количественного фазового состава мочевых камней, в основном, рентгенографическим методом (Лонсдейл К.И. и Сьютор Д. 1971; Каткова В.И.

1996; Голованова О.А. 2009 и др.) и частично методом ИК-спектроскопии (Голованов С.А. 2002), элементного состава рентгенофлуоресцентным методом (Борат В.Ф. 2002 и др.) и изучение микроструктуры методом сканирующей электронной микроскопии (Каткова В.И. 1996 и др.). Однако в литературе не представлено описание качественного и количественного анализа многофазных (более 2-х) мочевых камней всех композиций, в частности, фосфатных (разделение апатитов и фосфатов магния). Результаты систематического изучения камней большого размера, включая коралловидные, отсутствуют, а имеющиеся данные ограничиваются лишь определением качественного фазового состава. За исключением небольшого числа работ (Голованов С.А. 2002; Dionex Corporation, 2003) в литературе нет сведений о методах определения в моче таких важных для процесса камнеобразования ионов как оксалат-, цитрат-ионы, мочевая кислота. Все это делает невозможным установление корреляций между составами мочевых камней и мочи – среды их образования.

С другой стороны, развитие и постоянное усовершенствование инструментальной базы, методического и программного обеспечения позволяют применить методы, которые ранее не были доступны, или оптимизировать известные. Эти возможности создают благоприятные условия не только для подтверждения и уточнения имеющихся на сегодняшний день результатов и устранения противоречий, но и для получения новых знаний о мочевых камнях и моче, теории камнеобразовании, что впоследствие позволит научно обоснованно подойти к проблеме предотвращения рецидивов, а также к выбору мер метафилактики МКБ.

Цель данной работы: обоснование, усовершенствование и применение комплекса информативных физико-химических методов для характеризации общего состава мочевых камней, определения состава мочи и нахождения корреляций между ними.

Для достижения поставленной цели необходимо решить ряд задач:

1. Адаптировать известные и применить новые методы для определения качественного и количественного общего состава многокомпонентных мочевых камней in vitro, включающего фазовый и элементный состав, содержание белковых и небелковых органических компонентов, а также кристаллизационной воды в ряде конкрементов;

2. Определить содержание ионов-ингибиторов и ионов-катализаторов камнеобразования в составе мочи с использованием клинических, химических и физико-химических методов исследования;

3. Установить корреляции между составом и свойствами (твердость in vitro, структурная плотность in vivo) мочевых камней и составом мочи; выявить специфику мочевых камней большого размера, в том числе, коралловидных;

4. Уточнить и расширить теории роста и предложить процесс роста мочевых камней на основе результатов комплексного исследования мочевых камней и мочи;

5. Разработать методологию изучения камнеобразования с использованием результатов обследования больных МКБ, включающего, в том числе, анализы мочи и мочевых камней in vivo и in vitro с конечной обработкой полученных данных с использованием интеллектуальных систем принятия решения.

Научная новизна работы 1. На основании результатов изучения мочевых камней всех композиций комплексом физико-химических методов (дифрактометрия с использованием рентгеновского и синхротронного излучения, ИК-спектроскопия, термогравиметрия, спектрофотометрия, газовая хроматография с пламенноионизационным детектором, сканирующая электронная микроскопия с рентгеноспектральным микроанализом; оценка твердости in vitro и определение структурной плотности методом мультиспиральной рентгеновской томографии in vivo) и их анализа впервые:

Разработан рентгенографический экспресс-метод количественного определения содержания отдельных компонентов, входящих в состав многофазных (двух, трех и более) мочевых камней, в том числе, и смесей апатитов (карбонатапатит, гидроксилапатит и карбонатгидроксилапатит) и фосфатов магния (струвит и гексагидрат смешанного фосфата магния и калия), которые успешно разделены качественно и количественно; предложен рентгенографический и термогравиметрический методы определения количества кристаллизационной воды в составе оксалатов;

Оптимизирован метод Лоури для количественного определения белковых компонентов, и впервые применен метод газовой хроматографии с пламенноионизационным детектором для качественного и количественного определения ряда небелковых компонентов (ацетальдегид, ацетон, пропан-2-ол, бутан-1-ол, пропионовая кислота, уксусная кислота, этанол). Установлен разный характер распределения белка, коррелирующий с элементным составом, и небелковых компонентов по объему уратов, оксалатов и фосфатов;

Предложена оценка фазового состава мочевых камней (ведделлит, мочевая кислота, дигидрат мочевой кислоты, урат аммония, карбонатапатит, гидроксилапатит, карбонатгидроксилапатит, струвит, брушит) на основе особенностей их морфологии с использованием метода сканирующей электронной микроскопии;

Выявлена связь между твердостью мочевых камней, с одной стороны, и характером микроструктуры, наличием текстуры, количеством кристаллизационной воды и количеством белка в составе мочевых камней, с другой стороны. Найдена связь между твердостью мочевого камня in vitro и структурной плотностью in vivo;

Показано, что мочевые камни большого размера представлены преимущественно оксалатами и оксалатно-уратными смесями, а коралловидные – фосфатами и фосфатно-оксалатными смесями, редко уратами и оксалатами.

Для больших камней найдено изменение от центра к периферии как фазового состава камня (центральная часть камня представлена оксалатом или фосфатом, а периферия, соответственно уратом или оксалатом), так и элементного (во внутренней части камней элементный состав менее разнообразен, чем на внешней);

С использованием предложенного и примененного комплекса методов исследования мочевых камней изучены камни предстательной железы, в результате чего найдено, что в их составе преобладают фосфаты (апатит), центр камня более разнообразен по элементному составу, в состав камней предстательной железы в большинстве случаев входит белок в количестве ~ масс. %, подтверждена связь твердости камней предстательной железы с содержанием белка, найденная для мочевых камней.

2. Анализ результатов определения состава мочи комплексом методов (клинический: общий анализ, суточная экскреция, бактериологическое исследование; химический: ферментативный анализ, титриметрия; физикохимический: безреагентная ионная хроматография) позволил впервые:

Предложить диапазоны нормальных показателей в моче ионов, участвующих в камнеобразовании и изоцитрат CH2)2C(OH)(COO)3] ионов) и подтвердить известные для NH4+, Na+, K+, Mg2+, 3Ca2+, Сl-, SO42-, PO43-, цитрат- [(CH2)2C(OH)(COO)3]3- и мочевой кислоты.

Объяснить расхождение результатов определения ионов PO43- и мочевой кислоты методами клинического исследования мочи (суточная экскреция) и безреагентной ионной хроматографии.

3. Сопоставление результатов изучения состава мочевых камней и мочи позволило впервые установить связь между составом камня (оксалат, урат, фосфат), с одной стороны, а с другой стороны, с концентрацией иона – камнеобразователя (соответственно, оксалат – ион, мочевая кислота, фосфат-ион) в моче больных МКБ для оценки состава мочевого камня in vitro и с содержанием цитрат-ионов в моче для оценки риска камнеобразования.

4. На основании литературных и полученных экспериментально результатов совместного изучения мочевых камней и мочи уточнена и дополнена теория роста мочевых камней (органическая, коллоидная, инфекционная и нанобактериальная) и предложен процесс роста камней по двум моделям: при значительных отклонениях камнеобразующих компонентов от нормы (оксалаты и ураты) и при колебаниях концентрации этих компонентов в пределах нормы (фосфаты).

Практическая значимость 1. Создан банк данных, включающий в себя информацию комплексного обследования больных МКБ. Применены математические методы распознавания образов для оценки составов камней in vivo, прогноза возможного рецидива и определения типа камнеобразования с использованием различных алгоритмов распознавания.

2. Разработано исполняемое приложение с графическим интерфейсом для наблюдения динамики изменения показателей мочи (программа «Lithos-Test 1»), мочи и крови (программа «Lithos-Test 2») и оценки риска рецидивного камнеобразования. Применение данных программ позволяет выделить отдельные показатели мочи и крови, выходящие за пределы стандартных (т.е. за пределы «нормы»), контролировать динамику содержания в моче камнеобразующих ионов и ингибиторов роста камней, выбрать оптимальные метафилактические мероприятия, индивидуальные для конкретного больного МКБ. Для эффективного распространения и использования программ Lithos-Тest 1 и LithosТest 2 создан интернет-сайт www.chem-for-med.ru.

Разработанная методология изучения процесса камнеобразования применяется на кафедре урологии (заведующий кафедрой – член-корреспондент РАМН, профессор Ю.Г. Аляев) Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты применения комплекса новых, усовершенствованных и адаптированных к мочевым камням физико-химических методов для определения их общего состава (качественный и количественный фазовый состав и элементный состав, содержание белка и небелковых компонентов) и строения:

дифрактометрия с использованием рентгеновского и синхротронного излучения, ИК-спектроскопия, спектрофотометрия, термогравиметрия, газовая хроматография с пламенно-ионизационным детектором, сканирующая электронная микроскопия с рентгеноспектральным микроанализом; оценка твердости.

2. Корреляции между составом и свойствами (твердость камня in vitro и структурная плотность камня in vivo) мочевых камней, видами камней различного фазового состава (оксалаты, фосфаты, ураты) и составом мочи (содержание ионов-ингибиторов камнеобразования: цитрат-ионы и ионовкатализаторов: оксалат-ионы, фосфат-ионы, мочевая кислота), определенных химическими и физико-химическими методами, и основанная на них уточненная теория камнеобразования и предложенный процесс роста камней.

3. Методология по результатам изучения процессов камнеобразования, включающая в себя 4 этапа обследования больных МКБ до лечения, после соответствующего лечения, после метафилактических мероприятий с последующей математической обработкой результатов, полученных в рамках предыдущих этапов (нахождение корреляций между составом мочевых камней и мочи - математические методы распознавания образов, оценка динамики изменения показателей мочи и крови - интеллектуальные системы принятия решения).

Личный вклад Планирование эксперимента, проведение рентгенографических работ, спектрофотометрических исследований, подготовка банков данных для применения математических методов распознавания образов и создания компьютерных программ, обработка, анализ и обобщение всех экспериментальных результатов выполнено непосредственно соискателем.

Апробация работы Основные результаты работы докладывались и обсуждались на Российских и Международных конференциях: Всероссийская конференция с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2007), XVIII Менделеевская конференция молодых ученых (Белгород, 2008), Научнопрактическая конференция «Научно – техническое творчество молодежи – путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, 2008), Всероссийская конференция по рентгеноспектральному анализу с международным участием (Краснодар, 2008), III Всероссийская конференция с международным участием «Аналитика России» к 175-летию со дня рождения Д.И. Менделеева (Краснодар, 2009), Конкурс проектов молодых ученых в рамках 15-й международной выставки химической промышленности и науки «Химия – 2009» (Москва, 2009), I Международная конференция Российского химического общества имени Д.И.

Менделеева «Ресурсо- и энергосберегающие технологии в химической и нефтехимической промышленности» (Москва, 2009), Российская научная конференция с международным участием «Фундаментальные исследования в уронефрологии» (Саратов 2009), XVII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010), Российская научная конференция с международным участием «Мочекаменная болезнь:

фундаментальные исследования, инновации в диагностике и лечении» (Саратов 2011), XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Волгоград 2011), IV молодежная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии – 2011» (Москва, 2011), II-Конгресс урологов Сибири с международным участием (Томск, 2013), Первая российская конференция по медицинской химии «MedСhem Russia 2013» (Москва, 2013).

Получено 6 дипломов лауреата Российских и Международных выставок, конференций и конкурсов.

Публикации По результатам диссертационной работы опубликовано 12 оригинальных статей, из них 8, входящих в список изданий, рекомендованных ВАК, а также тезисов докладов на Российских и международных конференциях и семинарах, получены 2 свидетельства о регистрации программ для ЭВМ.

Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка цитируемой литературы (127 наименований) и 13 приложений. Объем диссертации составляет 218 страниц машинописного текста (154 страницы основного текста), содержит 21 таблицу и 64 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, показано современное состояние проблемы, сформулированы цель и основные задачи работы, представлены положения, выносимые на защиту, научная новизна и практическая значимость.

В представленной работе изучено ~ 500 камней пациентов НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека Первого МГМУ им. И. М.

Сеченова.

Рентгенография с использованием рентгеновского и синхротронного излучения. Рентгеновская съемка мочевых камней осуществлена на автоматизированных дифрактометрах ДРОН-3 (графитовый плоский монохроматор) и HZG-4 (Ni фильтр) на CuK излучении в интервале углов 2 5непрерывный режим, 1град/мин) и в интервале углов 2 5-100 (пошаговый режим: время набора импульса 10 с, величина шага 0.02°).

Съемка ряда образцов проведена в Научно-исследовательском центре «Курчатовский институт» на пучке синхротронного излучения с =0.98004 из поворотного магнита накопителя «Сибирь-2».

Качественный рентгенофазовый анализ выполнен с использованием автоматизированной базы данных PDF JCPDS, структурного банка данных ICSD и оригинальных работ (r = 3 5%).

Количественный рентгенофазовый анализа проведен методами:

коэффициентов (впервые рассчитаны коэффициенты К для всех возможных сочетаний составов многофазных мочевых камней, r = 2 %), модельных смесей (подготовлены и изучены 10 смесей с различным содержанием вевеллита и мочевой кислоты, r = 5 %), корундового числа (смеси корунда - -Al2O3 и вевеллита; впервые определено Ii/Icor = 1.07 для вевеллита (r = 3 %), полнопрофильным методом (смешанные мочевые камни, состоящие из вевеллита и мочевой кислоты [13] (r = 1 %).

Впервые качественно и количественно разделены апатиты на карбонатгидроксил- и карбонатгидроксилапатит, а также фосфаты магния на струвит и гексагидрат смешанного фосфатат калия и магния на основе выбора рентгенометрических данных группы отражений (не всегда максимальных и не подверженных текстуре), однозначно характеризующих отдельную фазу [13].

Для определения количества кристаллизационной воды в составе оксалатных мочевых камней по структурным данным ведделлита CaC2O4 nH2O был выполнен расчет теоретических значений интенсивности дифракционных отражений по формулам дифракционной кристаллографии в предположении разного содержания молекул кристаллизационной воды (n =2.0, 2.25, 2.375, 2.5).

Анализ результатов расчета позволил найти отражения (121, 141, 213, 532), наиболее чувствительные к вариациям величины n (отражение 213 меняется наиболее сильно) [3].

Термогравиметрический анализ был проведен на приборе Q-дериватограф:

термопара – Pt/Pt-Rh, tнач ~28 С, tкон 600 С; скорость развертки (нагрева) 10/мин; материал тигля – кварц, масса навесок ~ 100 мг [3] (r = 10 %).

Метод ИК-спектроскопии (ИК-Фурье спектрометр EQ 5.5) был применен для качественного анализа и определения количественного состава мочевых камней аналогично (Голованов С. А. 2002 г) [1, 3] (r = 10 %).

Содержание белка в мочевых камнях разных композиций определено методом Лоури на спектрофотометре СФ-26 (длина волны =750 нм). При построении градуировочного графика использовались 6 стандартных растворов триптофана C11H12N2O2 с концентрацией от 8 до 48 мкг/мл. Для установления времени выщелачивания проводилось исследование белка, выделившегося из навески (0.1 г и 0.15 г) измельченного камня в растворе 0.1М NaOH в дискретном временном интервале 24 - 144 ч. Экспериментально установлено, что в течение 24, 48 и 72 ч белок выделялся не полностью, наибольшая концентрация белка выделяется при выщелачивании в течение 96 ч, а в течение 120 и 144 ч белок разлагается [1, 3] (r = 7 %).

Для определения небелковых органических компонентов в составе камней (ацетальдегид, ацетон, пропан-2-ол, бутан-1-ол, пропионовая кислота, уксусная кислота, этанол) впервые применен метод газовой хроматографии: хроматограф Кристалл-2000М с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой ZB-5 (длина 30 м, диаметр 0.32 мм, толщина слоя жидкой неподвижной фазы с 5% фенилполисилоксаном и 95% диметилполисилоксаном 0.5 мкм;

используемый расход газа-носителя: водород - 20 мл/мин, воздух - 200 мл/мин, азот - 0,7 мл/мин, сброс - 21 мл/мин, деление потока - 1:30; линейная скорость азота через колонку при 40 С - 25,286 см/сек; нагрев колонки: 40 С - изотерма мин., далее нагрев до 300 С со скоростью 10 С/мин). Количественный анализ ацетальдегида, ацетона и пропан-2-ола проводился по методу внешнего стандарта [12] (r = 7 %).

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) с рентгеноспектральным микроанализом (РСМА) (сканирующий электронный микроскоп высокого разрешения с автоэмиссионным катодом 7500F фирмы JEOL). С целью исключения эффектов зарядки поверхности образцов и их разрушения под воздействием электронного пучка применяли методические подходы:

исследования проводили при низком токе электронного пучка (310–11 А), применяли специальный режим Gentle Beam (диаметр электронного зонда оставался небольшим, что способствовало сохранению высокого разрешения), на поверхность скола методом магнетронного напыления наносили металлическую пленку платины (для повышения электронной плотности поверхности образца). Количественный и качественный РСМА выполнен на энергодисперсионном рентгеновском микроанализаторе INCA Penta FETx фирмы OXFORD (Великобритания), установленным в той же высоковакуумной камере микроскопа. Калибровка прибора (6 итераций) осуществлялась по двум линиям К-серии стандартного образца кобальта. Количественный анализ элементов с атомным номером N3. проведен с использованием программы INCA Penta FET [3] (r = 0.5 %).

Метод безреагентной ионной хроматографии. Разделение катионов и анионов выполнено на ионном хроматографе ICS-2000 фирмы «Dionex» с кондуктометрическим детектором с использованием колонок «IonPac СS17»

(250х4 мм, 5 мкм, 30С) и «IonPac AS11» (250х4 мм, 5 мкм, 30С), соответственно. В результате полностью разделены неорганические катионы NH4+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+ и анионы Сl-, NO2-, NO3-, SO42-, PO43-, а также цитратCH2)2C(OH)(COO)3]3-, изоцитрат - [(CH2)2C(OH)(COO)3]3- ионы и мочевая кислота - C5H4N4O3. Для определяемых ионов разрешение пиков больше 1. (сравнимые результаты получены в Dionex corporation, 2003) [7]. Для определения ионов С2О42- и цитрат – ионов в моче применялся ферментативный метод с малатдегидрогеназой и L-лактатдегидрогеназой (Голованов С.А., 2002) [7]. В нашем распоряжении были клинические анализы мочи: общий анализ (удельный вес, бактерии, лейкоциты, эритроциты, солевой осадок, пигменты, рН среды, общий белок) и суточная экскреция (альбумин, креатинин, Ca2+, Na+, K+, Cl-, неорганический фосфор, мочевая кислота и мочевина), а также результаты титриметрического определения оксалат-ионов и мочевой кислоты, применяемый в Консультативно-диагностическом центре ФГУП МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Состав мочевых камней можно условно разделить на три группы: фазовый, элементный и общий. Элементный состав включает в себя химические элементы, которые входят в состав камня и определяются физико-химическими, химическими и различными спектральными методами (в частности, мы используем для этих целей РСМА, который позволяет качественно и количественно определять элементы, начиная с лития). К фазовому составу можно отнести все твердые компоненты как кристаллические, так и аморфные.

На сегодняшний день известно 45 видов мочевых камней, которые разделяют на 4 основные группы по фазовому составу: оксалаты, фосфаты, ураты и другие (органические и неорганические) соединения (рис. 1).

Cреди 500 изученных мочевых камней на долю камней большого размера (10 мм) приходится ~ 10%: ~13% оксалаты, ~27.6% - фосфаты, ~26.6% - ураты, остальные 33.7% - камни смешанного состава с преобладанием смесей (оксалаты + ураты, оксалаты + фосфаты). Около 80% этих камней составляют коралловидные, занимающие практически всю полостную систему почки и представленные фосфатами, смешанными фосфатно-оксалатными камнями и редко уратами и оксалатами. Данные камни встречаются в ~3 5% случаев МКБ, вероятность их рецидива достигает ~10%, а в течение 5 лет уже ~50% при отсутствии лечения (рис. 2).

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ МОЧЕВЫХ КАМНЕЙ 2000-2013 гг Рис. 2. Распространенность мочевых камней Если же провести подобную статистику среди камней всех размеров ( 1 мм), то оксалаты, фосфаты и ураты составляют ~67%, ~11% и ~4%, соответственно, а остальные ~18% - смешанные камни (оксалаты+ураты и оксалаты+фосфаты) (рис. 2). Отметим, что наиболее часто встречаются камни смешанного типа, являющиеся и более сложными в исследовании, для которых мы применили усовершенствованный нами дифракционный метод, а для подтверждения найденного состава - метод ИК-спектроскопии (рис. 3), хотя в случае