На правах рукописи

Гладких Алина Александровна

Экспрессия циклинов фазы G1 в В-зрелоклеточных лимфомах человека

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2013

1

Работа выполнена на биологическом факультете Московского Государственного Университета им М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук И.А. Воробьев

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук А.А. Штиль (заведующий лабораторией механизмов гибели опухолевых клеток ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН) Доктор биологических наук, профессор А.М. Сапожников (заведующий лабораторией клеточных взаимодействий ИБХ РАН)

Ведущая организация: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Научноисследовательский Институт морфологии человека»

Защита диссертации состоится _2013 г. на заседании диссертационного совета Д501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1. Факс:8(495)939-17-46; e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ им. М.В. Ломоносова Автореферат разослан _ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Е.Н. Калистратова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы В–клеточные неходжкинские лимфомы представляют собой гетерогенную группу злокачественных опухолей, как правило, возникающих из зрелых В–клеток. К основным нозологиям этой группы относят В–клеточный хронический лимфолейкоз, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, волосатоклеточный лейкоз, фолликулярную лимфому, диффузную В–крупноклеточную лимфому (ДВККЛ) и лимфому Беркитта. Суммарно они составляют около 15 % от общего числа опухолей гематопоэтической и лимфоидной ткани (WHO classification of lymphomas, 2008).

Гетерогенность этой группы проявляется в большом количестве вариантов клинической картины, иммунофенотипа опухолевых лимфоцитов и различии в прогнозах заболеваний. Белки, дерегуляция которых играет центральную роль в патогенезе зрелоклеточных лимфоидных опухолей, с одной стороны должны быть эффекторным звеном нескольких сигнальных каскадов, с другой стороны – обладать плейотропностью действия. С этой точки зрения наиболее перспективными кандидатами на роль центральных белков - переключателей в опухолевых В–лимфоцитах представляются циклины группы D и циклины группы Е, чьей канонической функцией является стимуляция выхода клетки из фазы G1 и переход ее в фазу синтеза ДНК.

Для вхождения дифференцированной клетки в пролиферативный цикл необходим митогенный сигнал, в частности, связывание ростовых факторов (EGF, FGF, PDGF, IGF и т.п.) с рецептором и последующая активация ERK1/ERK2 каскада митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK-каскад). Активируемые этим каскадом транскрипционные факторы Мyc (Daksis et al., 1994) и AP-1 (Albanese et al., 1995) запускают синтез циклинов D1, D2 и D3, которые образуют комплексы с киназами CDK4 и CDK6 (Bates et al., 1994), обусловливая выход клетки из фазы G1 (Murray, 2004). Синтез циклинов D также регулируется FAK киназой и/или Rho семейством ГТФаз (Zhao et al., 1998; Gille et al., 1999), а активация PI3K пути ингибирует GSK3beta-зависимую деградацию циклинов D (Liang et al., 2003).

зависимой киназой CDK2 и циклинами E1 и E2. Комплекс CDK4/6-циклин D частично фосфорилирует Rb-белки, что приводит к диссоциации гистондеацителазы от комплекса HDAC-Rb-E2F и позволяет E2F запустить синтез циклина E. Комплекс циклина Е и CDK дополнительно фосфорилирует Rb, и тот отсоединяется от E2F, снимая его ингибирование (Gottlieb et al., 1994; Ribes –Zamora et al., 2007).

Гиперэкспрессия циклинов группы D была показана методами иммуногистохимии, проточной флуориметрии и ИФА в некоторых лимфоидных опухолях, в частности, в опухолевых лимфоцитах фолликулярной лимфомы (Teramoto et al., 1999), диффузной В – крупноклеточной лимфомы (Filipits et al., 2002), в части опухолевых лимфоцитов В– клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) (Komaczewaska et al., 2009). Лимфома из клеток мантийной зоны была выделена из группы В–ХЛЛ по наличию транслокации t(11;14)(q13;q32), перемещающей ген циклина D1 под промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулинов, поэтому в клетках ЛКМЗ наблюдается наиболее высокий уровень экспрессии циклина D1 (Williams et al., 1995). Несмотря на то, что циклин Е является основным нижележащим эффекторным звеном циклина D (Geng et al., 1999), сведения о его экспрессии в опухолях иммунной системы носят весьма разрозненный и несистематический характер. До недавнего времени оценка уровня экспрессии циклинов проводилась исключительно качественными методами, обладающими относительно низкой чувствительностью, возможно, что использование более чувствительных методов детекции с определением уровня мРНК вместо количества белка позволит выявить не одиночные, а систематические изменения уровня экспрессии циклинов фазы G1 в опухолевых лимфоцитах В–зрелоклеточных лимфом.

Цель исследования Целью данной работы было получение новых знаний об экспрессии мРНК циклинов групп D и Е в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани методом ПЦР в реальном времени.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить коллекцию образцов кДНК из зрелоклеточных опухолей и нормальной лимфоидной ткани.

2. Определить оптимальные референтные гены для нормализации данных ПЦР в реальном времени.

3. Определить уровень экспрессии мРНК генов циклинов D1, D2 и D3 в нормальных и опухолевых лимфоцитах.

4. Определить уровень экспрессии мРНК гена циклина Е1 в нормальных и опухолевых лимфоцитах.

Новизна исследования 1. Впервые исследована выборка образцов кДНК, полученной из свежезамороженных образцов лимфоидной ткани от 165 пациентов с известным имунофенотипом опухолевых клеток.

2. Использование корректной стратегии нормализации и наличие трех стабильно экспрессирующихся референтных генов впервые позволило детектировать повышенный уровень экспрессии мРНК циклинов D1 и Е в опухолевых лимфоцитах по сравнению с нормальной лимфоидной тканью.

3. Предложен новый диагностический метод разделения нозологий В-зрелоклеточных лимфом по уровню экспрессии мРНК циклина D1.

Научно–практическая значимость исследования Полученные результаты могут быть использованы в дифференциальной диагностике лимфоидных опухолей, данные об экспрессии циклинов G1 фазы в лимфоидной ткани могут быть использованы в курсах лекций по гематологии, частной гистологии и клеточной биологии.

Материалы диссертации доложены на: внутреннем семинаре Совета Молодых Ученых в Гематологическом Научном Центре РАМН (2009 год), международной конференции «Experimental Hematology Association» (2010), второй Международной Школе по практической проточной цитометрии (Москва, 2011), 18-й международной конференции «18th Leipziger Workshop on Cytomics and Congenital Heart Disease» (2013) и обсуждены 23 мая 2013 года на специализированном семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии Московского Государственного Университета имени М.В.

Ломоносова.

Публикации по теме диссертации По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 3 тезиса конференций.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 132 страницах машинописи и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», заключения и выводов. Работа содержит 16 рисунков и таблиц. Библиографический материал включает в себя ссылки на 303 источника литературы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты Для исследования были выбраны образцы тканей селезенок, лимфоузлов и периферических мононуклеаров крови (48 биопсий селезенки, 23 биопсии лимфоузлов и 94 образца периферических мононуклеаров крови) 165 пациентов на базе гематологического Научного Центра (Москва, Россия). У 33 пациентов был поставлен диагноз ЛКМЗ, и у 97 был поставлен диагноз В–ХЛЛ. Все пациенты не проходили курс лечения в момент взятия образца крови или биопсии лимфоузла. 35 референтных случаев содержали 2 случая фолликулярной лимфомы, 4 случая диффузной В–крупноклеточной лимфомы, 11 случаев лимфомы из клеток маргинальной зоны и 18 случаев с реактивным лимфаденитом (пролиферация клеток неопухолевой природы). Диагнозы «лимфома из клеток мантийной зоны» и «хронический лимфолейкоз» были поставлены с помощью методов трехцветной проточной цитофлуориметрии и иммуногистохимии, в 1 случае диагноз был поставлен по наличию транслокации и клиническим данным.

Цитогенетические данные по транслокации t(11;14)(q13;q32) были доступны для пациентов из 33. Средний возраст пациентов с В–ХЛЛ составил 62 года (разброс 48– лет), средний возраст пациентов с ЛКМЗ составил 58 лет (разброс 39-75 лет).

Иммуногистохимия и проточная флуориметрия.

Непрямая иммуногистохимическая окраска парафиновых срезов толщиной 4-5 мкм проводилась по стандартной методике (Petrosyan et al., 1999). Пробоподготовку образцов для флуориметрии проводили по стандартной методике, описанной ранее (Gretsov et al., 2004). Для окраски использовали моноклональные антитела к CD5-FITC (клон DK23, DAKO, Дания), CD19-Cy5 (клон HIB19, eBioscience, США), CD23-PE (клон MHM6, Dako, Дания), FMC7-FITC (клон MCA792F, AbD Serotec, США), CD20-Cy5 (клон 2H7, eBioscience, США), поверхностное антитело к – легкой цепи иммуноглобулинов и поверхностное антитело к -легкой цепи иммуноглобулинов (-FITC/ –PE, клон AHM4907, Invitorgen, США). Полученные пробы анализировались на проточном цитофлуориметре FACsCalibur (BD). Результаты обрабатывались в программе CellQuest (BD Biosciences, США). Отсечки выставлялись по негативным контролям.

Выделение периферических мононуклеаров крови и получение суспензий Клетки мононуклеаров крови выделяли в градиенте Ficoll-Histopaque (SigmaAuldrich, США) по стандартной методике. Полученные клетки дважды отмывались в среде RPMI-1640 (Панэко, Россия) и замораживались в жидком азоте. Из кусочков ткани лимфатических узлов и селезенок приготавливалась суспензия в medi-machine (BD BioSciences). Суспензии также замораживались в жидком азоте. Нормальные В– лимфоциты из периферических мононуклеаров крови здоровых доноров выделяли на колонках miniMACS (Miltenyi Biotech GmbH, Germany) по протоколу производителя.

Получение РНК и кДНК Выделение РНК из замороженных клеток осуществлялось при помощи RNeasy Mini Kit (Qiagen, США) по протоколу производителя. После выделения РНК была дополнительно обработана ДНКазой (Fermentas, США) в течение 30 минут при 37 С.

Концентрация РНК измерялась на спектрофотометре (Genesis UV10, Thermo Electron, США). Анализ чистоты выделенной РНК проводился по измерению пиков А260/А280 и А260/А230. Среднее соотношение А260/А280 составило 1,85 (диапазон 1,7-1,9), среднее соотношение А260/А230 составило 1,7 (диапазон 1,65-1,95).

Подбор праймеров Для амплификации ПЦР–РВ использовались е последовательности праймеров, предложенные Vandesompele et al., (2002). Для генов циклинов D2, D3 и циклина Е были написаны следующие праймеры: cyclin D2 sense: 5’ - CTG GGG AAG TTG GAA GTG GA -3’; cyclin D2 antisense: 5’ - CAA TCC ACG TCT GTG TTG G; cyclin D3 sense: 5’- GAC CTT TTT GGC CCT CTG T- 3’; cyclin D3 antisense: 5’ – GCT TCG ATC TGC TCC TGA C;

cyclin E1 sense: 5’ – AGC ACT TCA GGG GCG TCG-3’; cyclin E1 antisense: 5’ – GCC CGC TGC TCT GCT TCT. Результаты ПЦР подтверждались на электрофорезе. Результат ПЦР для гена циклина D1 проверяли с помощью клонирования продукта реакции в вектор pGem-T Easy Vector (Promega) согласно инструкции производителя с последующим сиквенсом вставки. Для того чтобы минимизировать амплификацию геномной ДНК, праймеры были составлены так, чтобы каждую пару разделял хотя бы один интрон. По последним данным, все выбранные нами гены выполняют независимые функции и не имеют общей регуляции.

ПЦР в реальном времени Количественные ПЦР–реакции в реальном времени проводили на приборе MiniOpticon (Biorad Headquaters, Hercules, California) методом неспецифической детекции с красителем SybrGreen I (Синтол, Россия).

Стандартная ПЦР реакция проводилась в объеме 25 мкл с реактивами фирмы «Синтол» (Россия) и включала в себя 2,5 мкл 10 х кратного ПЦР буфера с Sybr Green I, 2,5 мМ MgCl2, 2,5 мМ дНТФ, 1,5 единицы Taq-полимеразы Hot Rescue, 10 пмоль каждого праймера и 5 мкл 5 –кратного разведения кДНК. Условия реакции включали первоначальную денатурацию (при 95 С) и последующие 40 циклов репликации (95 С 15 сек, 64 С 30сек, 72 С 60 сек).

Нормализация данных В работе была использована методика расчета относительного нормализованного количества кДНК с помощью фактора нормализации (Vandesompele et al., 2002).

Результаты были проанализированы с помощью бесплатных приложений для обработки данных ПЦР в реальном времени: GeNorm (Center of medical Genetics, Ghent University hospital, geNorm version 3.5, 2002), NormFinder (Molecular Diagnostic Laboratory, Department of clinical Biochemistry, Aarhus University Hospital, Denmark, 2004) и BestKeeper (FML-Weihenstephan, Centre of Life and Food Science, Technical University of Munich, Для статистического анализа данных и построения графиков Germany, 2003).

использовалась программа GraphPad® Prism (GraphPad Software, version 5, San Diego, Для теста на нормальность распределения использовали критерии CA, USA).

д’Агостино–Пирсона и Холмогорова–Смирнова.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Иммунофенотипирование и иммуногистохимия Классификация исследованных в работе нозологий проводилась по данным проточной флуориметрии (рис.1). Согласно классификации ВОЗ(1), для клеток В–ХЛЛ характерен иммунофенотип CD5+/CD19+/CD23+/FMC7-, для клеток ЛКМЗ характерен подтверждали по экспрессии одного из вариантов легких цепей иммуноглобулинов (каппа или лямбда).

При работе с образцами тканей нозологии «хронический лимфолейкоз» и «лимфома из клеток мантийной зоны» описывали не только по данным проточной цитофлуориметрии, но и по данным иммуногистохимической окраски на циклин D1 и CD23 на парафиновых срезах. Практически все опухолевые лимфоциты В–ХЛЛ экспрессируют CD23, а в лимфоме из клеток мантийной зоны позитивно по CD окрашена лишь часть лимфоцитов в редуцированных остаточных фолликулах, тогда как основная масса опухоли вокруг фолликулов является CD23–негативной (Рис. 2 B, C).

Ядра большей части опухолевых лимфоцитов ЛКМЗ ярко окрашиваются антителами к циклину D1, тогда как за небольшим исключением остальные зрелоклеточные лимфопролиферативные заболевания, включая большинство случаев В-ХЛЛ и лимфомы из клеток маргинальной зоны, являются циклин D1–негативными. В исследованной выборке ядерное окрашивание опухолевых лимфоцитов антителами к циклину D наблюдалось во всех образцах солидных тканей с нозологией ЛКМЗ (12 из 12), пример такого окрашивания приведен на рис. 2, A. В образце ткани лимфоузла с нозологией В– ХЛЛ окрашивание антителами к циклину D1 детектируется лишь в небольшой части ядер лимфоцитов в центрах пролиферации (Рис. 2 D).

По литературным данным в небольшом числе случаев наблюдается ядерное окрашивание антителами к циклину D1 части клеток лимфоузлов с нозологией В–ХЛЛ (Cheuk et al., 2004). Было установлено, что существует группа образцов В–ХЛЛ с гиперэкспрессией этого белка в части лимфоцитов, хотя в большинстве случаев В–ХЛЛ надежно детектировать экспрессию этого белка методом иммуногистохимии не удалось.

Так как отсутствие гиперэкспрессии белка на качественном уровне не всегда означает отсутствие гиперэкспрессии на уровне мРНК, далее было решено проанализировать уровень экспрессии мРНК гена циклина D1 на выборке пациентов с В– ХЛЛ и лимфомой из клеток мантийной зоны методом количественного ПЦР в реальном времени.

Рисунок 1. Иммунофенотипические характеристики клеток ЛКМЗ и В–ХЛЛ по данным проточной флуориметрии. (A) Выделение лимфоцитарного полигона в суспензии клеток ЛКМЗ (B) Коэкспрессия CD5/CD19 в клетках ЛКМЗ (C) Коэкспрессия CD19/CD23 в клетках ЛКМЗ (D) Клональность опухолевых клеток ЛКМЗ (E) Экспрессия FMC7 в опухолевых лимфоцитах ЛКМЗ (F) Выделение лимфоцитарного полигона в суспензии клеток В-ХЛЛ (G) Коэкспрессия CD5/CD19 в клетках В-ХЛЛ (H) Коэкспрессия CD19/CD23 в клетках В-ХЛЛ, (I) Клональность опухолевых клеток ЛКМЗ (J) отсутствие экспрессии FMC7 в опухолевых лимфоцитах В-ХЛЛ.

2.2 Подбор референтных генов Статистическое описание уровня экспрессии кандидатов в референтные гены в лимфоидной ткани.

Для оценки уровня экспрессии гена циклина D1 необходимо было выбрать референтные гены, которые можно использовать в качестве внутренних стандартов при расчете относительного нормализованного количества мРНК исследуемых генов циклинов фазы G1. Экспрессия таких генов должна быть сопоставима с нормальным уровнем транскрипции мРНК генов циклинов группы D и Е (относительно низкая экспрессия) и при гиперэкспрессии этих мРНК в опухолевых лимфоцитах, кроме того, их экспрессия должна быть стабильной в клетках крови, селезенки и лимфоузлов как в нормальной лимфоидной ткани, так и при различных вариантах неопластической трансформации (Vandesompele et al., 2002).

Рисунок 2. Иммуногистохимическая окраска на циклин D1 и CD23 на парафиновых срезах лимфоузлов с диагнозами В–ХЛЛ и ЛКМЗ. (А) Ядерное окрашивание опухолевых лимфоцитов ЛКМЗ на циклин D1, основная масса опухолевых клеток позитивна по циклину D1, x20 (B) Иммуногистохимическое окрашивание лимфоузла с ЛКМЗ на CD23.

Цитоплазматическая окраска CD23 в центрах размножения редуцированных фолликулов, вокруг негативные по CD23 опухолевые лимфоциты, х20 (С) Ядерное окрашивание небольшой части лимфоцитов В–ХЛЛ на циклин D1, циклин D1–позитивные лимфоциты находятся в редуцированных центрах размножения, основная часть опухоли циклин D1– негативна, х20 (D) Цитоплазматическая окраска опухолевых лимфоцитов В–ХЛЛ на CD23, основная масса опухоли позитивна по CD23, х20. На врезках дано увеличение х60.

Для лимфоцитов в качестве кандидатов в референтные гены с предполагаемым высоким уровнем транскрипции (величина порогового цикла от 20 до 25) были выбраны гены B-ACTIN, GAPDH (Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase), B2M (Beta-2microglobulin) и RPL13A (Ribosomal protein L13a), в качестве референтных генов со средним уровнем транскрипции (величина порогового цикла от 25 до 30) были выбраны гены UBC (Ubiquitin C) и HPRT1 (Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1), в качестве референтного гена с низким уровнем транскрипции (величина порогового цикла от 30 и выше) был выбран ген YWHAZ (Tyrosine 3-monooxygenase tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide).

На предварительном этапе анализа было показано, что экспрессия мРНК выбранных референтных генов детектируется во всех типах лимфоидной ткани, то есть мРНК всех генов удалось обнаружить в образцах клеток крови, лимфоузлов и селезенки. Продукты каждой ПЦР–реакции детектировались с помощью гель–электрофореза в 1,5% агарозном геле и имели ожидаемую молекулярную массу, совпадающую с размером ампликона В экспериментах ПЦР в реальном времени специфичность амплификации доказывали по наличию единичного пика на кривой плавления. Для каждого из образцов стандартное отклонение в трипликате всегда было меньше 0,2. Диапазон пороговых циклов и средние значения представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Значения пороговых циклов для экспрессии референтных генов в лимфоидной ткани.

В различных типах лимфоидной ткани уровень экспрессии мРНК исследуемых генов не отличался. Эквивалентность экспрессии генов в выборке проверяли с помощью теста Манна-Уитни. По результатам этого теста была доказана эквивалентность экспрессии референтных генов для опухолевой и нормальной лимфоидной ткани (p0,1, = 0,05), для остальных генов (HPRT1, GAPDH, B-ACTIN, RPL13A, B2M) выборки данных по уровню экспрессии мРНК не прошли проверку на нормальность распределения, что делает применение к ним t-теста некорректным.

Для определения стабильности уровня экспрессии мРНК исследуемых генов были использованы программы geNorm, NormFinder и BestKeeper. Программа geNorm использует алгоритм последовательного исключения генов–кандидатов на основе их стабильности. Лучшие гены используются для расчета фактора нормализации, определяемого как среднее геометрическое относительных нормализованных количеств кДНК. Для выбранных генов была рассчитана величина V, которая является стандартным отклонением для выборок попарных соотношений уровней экспрессии мРНК исследуемых генов. После этого гены были проранжированы по их мере стабильности М, рассчитываемой как среднее арифметическое для всех величин V. Гены с высоким значением М имеют наименее стабильный уровень экспрессии мРНК, так как чем больше величина М, тем больше величина стандартных отклонений анализируемых выборок.

Порядок генов в общей выборке и во всех группах, за исключением ЛКМЗ и CD5– негативных лимфом, был одинаковым. Порядок генов, начиная с наиболее стабильного, оказался следующим: YWHAZ и UBC, ACTB, HPRT1, GAPDH, RPL13A, B2M (Таблица 2).

Таблица 2. Распределение генов по стабильности согласно программам geNorm и NormFinder. Наиболее стабильные гены находятся в верхней строчке таблицы.

В группе ЛКМЗ и CD5–негативных лимфом GAPDH, ACTB and HPRT1 менялись местами, но YWHAZ и UBC имели самые низкие значения меры стабильности M, тогда как у RPL13A и B2M значения М были самыми высокими. Анализ значений уровня экспрессии мРНК референтных генов в программе Best Keeper, так же, как и в программе geNorm, в качестве наиболее стабильных выявил гены YWHAZ and UBC как прошедшие установленный порог SD (стандартное отклонение) < 1. Для определения стабильности наших генов–кандидатов также была использоваана программа NormFinder. В качестве наиболее стабильного гена в программе NormFinder также оказался ген YWHAZ со значением меры стабильности 0,045 и UBC с мерой стабильности 0,049.

Для того чтобы оценить количество генов, необходимое и достаточное для корректной нормализации данных ПЦР в реальном времени, использовали анализ коэффициентов парной вариации в программе geNorm. Для большинства групп, так же как и для целой выборки, наиболее низкое значение парного отклонения (V) было получено для отношения четвертого и пятого генов (V4/5), и варьировало от 0,18 до 0, (Рис. 4). Это означает, что различиями в уровне экспрессии мРНК этих генов можно пренебречь, и для эффективной нормализации достаточно трех генов. В группе образцов лимфоидной тканей с нозологией ЛКМЗ и группе, состоящей из образцов ткани лимфатических узлов, минимальное значение V было получено для отношения пятого и шестого генов (V5/6 = 1,9 и 0,22 соответственно). Однако графики линейной регрессии, построенные в парных осях факторов нормализации, показали, что наиболее удачная линеаризация получается для NF3 напротив NF4 (R2 = 0.81), то есть различия в уровне экспрессии этих генов являются незначительными. Таким образом, отношение уровней экспрессии мРНК этих генов остается практически постоянным, что делает необязательным добавление четвертого гена в расчет фактора нормализации.

По итогам анализа с помощью программ geNorm, NormFinder и BestKeeper, гены YWHAZ и UBC имеют наиболее стабильный уровень экспрессии в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани. Трех рефрерентных генов, YWHAZ, UBC и BACTIN достаточно для корректной нормализации данных ПЦР в реальном времени для лимфоидной ткани.

2.3. Оценка экспрессии циклина D1 в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани Популяция В-клеток из образцов периферических мононуклеаров крови здоровых доноров (n=10) была обогащена на колонках Mylteniy Biotech, клетки сортировали по экспрессии пан В–клеточного антигена CD19, чистота обогащенной популяции составляла от 73 до 93 %. Относительное нормализованное количество кДНК циклина D в таких образцах варьировало от 0,00003 до 0,0005. Относительное нормализованное количество кДНК циклина D1 в тех же образцах цельной крови варьировало от 0,00008 до 0,0007, таким образом, в нормальных В- и Т-клетках циклин D1 экспрессируется на очень низком уровне, причем уровень экспрессии циклина D1 не отличается в сортированных Влимфоцитах и несортированных периферических мононуклеарах крови. Относительное нормализованное количество кДНК в образцах солидных тканей неопухолевой природы D1 варьирует от 0,00001 до 0,002 у разных больных (медиана 0,00007), т. е. экспрессия гена циклина D1 в образцах воспалительной природы ниже, чем в опухолевых клетках (Рис. 5). В клетках ЛКМЗ относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 варьирует от 0,04 до 13,55 у разных больных (медиана 0,226) и превышает относительное нормализованное количество кДНК в клетках реактивного лимфаденита на 3 порядка (Таблица 3). Относительное количество кДНК гена циклина D1 в клетках ВХЛЛ варьирует от 0,00002 до 0,09 (медиана 0,003) и может отличаться на 3 порядка в клетках разных больных с этой нозологией (см. рис. 5).

Таблица 3. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 в опухолевых клетках и реактивном процессе Нозология В группе образцов CD5–негативных лимфом (n = 17), куда входили образцы тканей с нозологиями «фолликулярная лимфома», «лимфома из клеток маргинальной зоны», «диффузная В–крупноклеточная лимфома», относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 варьировало от 0,00005 до 0,004 (медиана 0.0004) (см. табл. 3;

рис. 5). По уровню экспрессии мРНК гена циклина D1 можно получить статистически значимые отличия для этой группы от группы образцов ткани с реактивным процессом (p < 0,002, критерий Манна-Уитни), но нельзя различить нозологии внутри нее (p = 0, для лимфомы из клеток маргинальной зоны и p = 0,26 для ДВККЛ).

мРНК нозологии В-зрелоклеточных лимфом могут быть расположены следующим образом (начиная с наименьшей) CD5-негативные лимфомы, В-ХЛЛ, ЛКМЗ. При этом уровень экспрессии мРНК циклина D1 повышен во всех опухолевых лимфоцитах по сравнению с нормальными В-клетками. Гиперэкспрессия мРНК циклина D1 наблюдается в клетках В-ХЛЛ в отсутствие транслокации t(11;14).

Различия в уровне экспрессии мРНК циклина D1 между всеми нозологиями являются статистически достоверными.

3.4. Сравнение различных подходов к нормализации данных ПЦР в реальном времени Для того чтобы иметь возможность сравнить полученные данные с данными литературы, относительное количество мРНК гена циклина D1 было нормализовано методом Ct (Livak et al., 2001) по одному референтному гену, для чего был выбран ген YWHAZ, так как его экспрессия является наиболее стабильной в выборке (рис. 6).

Использование этого подхода позволяло разделить выборку по нозологиям, но разница между медианами для групп стала менее достоверной, а различия между группами образцов реактивной лимфоидной ткани и CD5–негативных опухолей стали статистически недостоверными (p=0.11, тест Манна–Уитни, Таблица 4).

Таким образом, использование одного референтного гена для нормализации данных ПЦР в реальном времени не позволяет достоверно различить нозологии с разницей в уровне экспрессии мРНК менее двух порядков.

Таблица 4. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 в клетках нормальной и опухолевой лимфоидной ткани. Нормализация по методу Ct с геном YWHAZ.

3.4. Пролиферация клеток с гиперэкспрессией мРНК циклина D пролиферативного маркера Ki-67, оцененного методом проточной флуориметрии. В образцах лимфомы из клеток мантийной зоны пролиферативный индекс варьировал от 0, до 44 % (среднее 8,41), пролиферативный индекс в образцах с нозологией В-ХЛЛ варьировал от 0 до 10 % (среднее 3%). На рис. 7 приведен пример типичного окрашивания клеток из суспензии лимфоузлов с нозологиями В-ХЛЛ (рис.7, А, В) и ЛКМЗ (рис.7, C, D). В выборке отсутствовала корреляция между уровнем экспрессии мРНК гена циклина D1 и количеством пролиферирующих клеток в образцах с нозологией ЛКМЗ, оцененному по маркеру пролиферации Ki-67, коэффициент Спирмена для корреляции между нормализованным количеством мРНК гена циклина D1 был равен - 0,005. Количество мРНК циклина D1 в образцах с нозологией ЛКМЗ не зависело от типа опухолевого роста в ткани: максимальное количество мРНК циклина D1 было обнаружено в образцах с диффузным типом роста опухоли при отсутствии на срезах митотических фигур, а в образцах с бластоидным вариантом ЛКМЗ оно было относительно низким.

3.5. Иммунофенотипирование лимфом «серой зоны»

В процессе иммунофенотипирования тканей В-зрелоклеточных лимфом была обнаружена группа образцов с имунофенотипическими характеристиками, не соответствующим в полной мере ни одной из нозологий. Такие клетки, как правило, экспрессируют на поверхности маркеры, характерные как для клеток ЛКМЗ (высокий уровень экспрессии поверхностных маркеров CD20 и FMC7), так и маркеры, характерные для опухолевых лимфоцитов В–ХЛЛ (экспрессия поверхностного маркера CD23). Такие образцы были условно отнесены к нозологии лимфом «серой зоны». Пример иммунофенотипа, характерного для опухолевых лимфоцитов лимфом «серой зоны», приведен на рис. 8. В связи с появлением новой нозологической группы была создана отдельная выборка кДНК, состоящая из 27 образцов ЛКМЗ, 27 образцов В–ХЛЛ, образцов лимфомы из клеток маргинальной зоны (ЛМарЗ), 26 образцов лимфом «серой зоны» и 15 образцов реактивной ткани.

Экспрессия циклина D1 в группе лимфом «серой зоны»

3.6.

В новой выборке самый высокий уровень экспрессии мРНК гена циклина D по–прежнему наблюдался в опухолевых лимфоцитах ЛКМЗ (медиана 1,99), в клетках В– ХЛЛ (медиана 0,004) он был снижен по сравнению с клетками ЛКМЗ, но выше, чем в реактивной лимфоидной ткани. Данные об уровне экспрессии мРНК гена циклина D1 в новой выборке представлены в Таблице 5. По экспрессии циклина D1 группа лимфом «серой зоны» разделилась на 2 части: в 7 образцах из 26 относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 было больше условного порога в 0,1 (диапазон 0,88что дало возможность отнести эти образцы к нозологии «лимфома из клеток мантийной зоны». В 19 образцах из 26 относительное нормализованное количество кДНК было меньше 0,1 (диапазон 0,003-0,078), для этих образцов был исключен диагноз «лимфома из клеток мантийной зоны».

В новой выборке тканей В-зрелоклеточных лимфом появилась группа образцов с иммунофенотипом, промежуточным для клеток ЛКМЗ, В–ХЛЛ и лимфомы маргинальной зоны. Эта группа образцов была условно названа «лимфомы серой зоны». По уровню экспрессии мРНК циклина D1 в этой группе можно однозначно выделить образцы с гиперэкспрессией мРНК циклина D1, для которых подтверждается транслокация t(11;14)(q13;q32), и которые можно отнести к нозологии «лимфома из клеток мантийной зоны». Остальные образцы без молекулярных характеристик были отнесены к нозологиям «хронический лимфолейкоз» и «лимфома из клеток маргинальной зоны». Таким образом, оценка уровня экспрессии мРНК циклина D1 в образцах позволяет разделить нозологии Взрелоклеточных лимфом в тех случаях, когда результаты имунофенотипирования неочевидны.

Таблица 5. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина D1 в опухолевых клетках и реактивной лимфоидной ткани (новая выборка) Рисунок 8. Пример иммунофенотипического описания образца с нозологией «лимфома из клеток серой зоны». (А) Выделение лимфоцитарного полигона в суспензии клеток (B) Коэкспрессия CD5 и CD19 на опухолевых лимфоцитах (С) Частичная экспрессия CD23 на опухолевых лимфоцитах - (D) Экспрессия FMC7 на части опухолевых лимфоцитов (Е) Клональность опухолевых лимфоцитов 3.7. Экспрессия циклинов D2 и D3 в опухолевых и нормальных лимфоцитах Экспрессия мРНК циклина D2 была выявлена во всех образцах (n=109), за исключением четырех образцов реактивной ткани. Наиболее высокий уровень D наблюдался в клетках В–ХЛЛ (медиана 1,424), самый низкий уровень экспрессии наблюдался в опухолевых лимфоцитах лимфомы из клеток маргинальной зоны (медиана 0,0078). По уровню экспрессии мРНК гена циклина D2 можно было достоверно отличить группы образцов CD5 – положительных опухолей (нозологии В-ХЛЛ, ЛКМЗ и лимфомы