На правах рукописи

Кононова Наталья Вячеславовна

РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ОЧИСТКИ

РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ: ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА И

ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА.

Специальность – 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии).

02.00.10 – Биоорганическая химия.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА – 2010 г.

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова, опытнопромышленном производстве ЗАО «Мастерклон» и на опытном биотехнологическом производстве Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Научные руководители:

доктор химических наук Баирамашвили Дмитрий Ильич доктор химических наук, профессор, академик РАМН Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, ИНЭОС РАН Ямсков Игорь Александрович доктор химических наук, МГУ им. М.В. Ломоносова Селищева Алла Анатольевна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН.

Защита диссертации состоится « 15 » ноября 2010 года в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, по адресу: 119571 Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова, по адресу: 119571 Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте МИТХТ им. М.В. Ломоносова:

http//www.mitht.ru.

Автореферат разослан « 15 » октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н., с.н.с. А. И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность исследования.

Получение лекарственных препаратов с помощью методов генной инженерии является сегодня приоритетным направлением в развитии такой важной отрасли, как биотехнология. Возможность получения фармацевтических генно-инженерных белков в промышленности дает следующие преимущества: отсутствие ограничений по источнику сырья и низкая себестоимость конечного продукта.

В настоящее время в мировой практике четко выражена тенденция к замене препаратов, получаемых из природных источников, на их рекомбинантные аналоги. Такие препараты, разрабатываемые рядом зарубежных фармацевтических компаний, уже сегодня успешно применяются в медицинской практике. Способы получения инсулина, интерферонов, интерлейкинов, гормона роста человека, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, окситоцина и др. были запатентованы в разных странах. Они характеризуются различными способами экспрессии генов в клетках-продуцентах, штаммовой вариабельностью и видовым разнообразием продуцирующих культур, способами очистки и качеством самих препаратов.

Однако в России, по ряду причин, отсутствуют как собственные технологии получения многих, из перечисленных выше, терапевтических препаратов, а имеющиеся инновационные разработки не внедрены в производство.

Одним из путей быстрого развития биофармацевтической промышленности является производство дженериков - лекарственных препаратов, срок действия патентной защиты на которые уже закончился. Разработка таких технологий и организация собственного масштабного производства позволит быстро освоить современное оборудование, приобрести опыт работы в условиях GMP, изучить различные методы анализа и очистки, добиться высокого качества выпускаемого продукта, обеспечить необходимыми препаратами большее количество пациентов и заложить основы импортозамещения.

*Список используемых сокращений: АФС – активная фармацевтическая субстанция; ТВ – тельца включения; ЛАЛ-реактив – лизат амебоцитов Limulus; ГРЧ - гормон роста человека;

рГРЧ - рекомбинантный ГРЧ; Met-рГРЧ – рГРЧ, содержащий N-концевой метионин;

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; рчГ-КСФ – рекомбинантный человеческий Г-КСФ; ЛПС – липополисахариды; ОФ ВЭЖХ–обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ДЕ – динамическая емкость сорбента;

ИОХ - ионообменная хроматография; ГХ – Гидрофобная хроматография; КСЭ – контрольный стандарт эндотоксина; ЕЭ – единица эндотоксина, 1 ЕЭ = 0,1нг; ЭФ ПААГ - электрофорез в полиакриламидном геле; КЭФ – капиллярный электрофорез; МС - масс-спектрометрия;

ИЭФ – Изоэлектрическое фокусирование; ФС – фармакопейная статья; ВЭТТ – высота, эквивалентная высоте теоретической тарелки; CRS - Европейский стандарт рГРЧ; EP – Европейская фармакопея; GMP - надлежащая производственная практика.

Целью диссертационной работы являлась разработка технологий получения и очистки рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения для организации полномасштабного промышленного производства активных фармацевтических субстанций.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать условия проведения процессов солюбилизации и ренатурации рГРЧ и рчГКСФ в различных условиях.

2. Подобрать условия, позволяющие оптимально осуществить хроматографическую очистку рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения на промышленных сорбентах.

3. Подобрать условия ферментативного отщепления N-концевого метионина от Met-рГРЧ.

4. Выявить критерии, определяющие масштабирование процессов получения рГРЧ и рчГ-КСФ.

5. Масштабировать процессы получения рГРЧ и рчГ-КСФ в условиях опытно-промышленного производства.

6. Провести сравнительную оценку качества полученных препаратов с импортными аналогами.

Научная новизна полученных результатов 1. Впервые, для ренатурации белков, Met-рГРЧ и рчГ-КСФ, был применен пероксид водорода, который позволяет быстро и эффективно проводить процесс при высокой концентрации белка.

2. Установлено, что применение CuSO4 в процессе ренатурации осложняет очистку белков от эндотоксинов.

3. Выявлена новая, ранее нигде не опубликованная структурная модификация рГРЧ, связанная с преобразованием дисульфидной связи Cys182-Cys189 в тиоэфирную при рН 12.

Практическая значимость полученных результатов:

1. Разработан опытно-промышленный регламент на производство 150 г субстанций рГРЧ за один производственный цикл.

2. Разработанный технологический процесс производства рГРЧ используется для производства лекарственного препарата «Растан».

3. Разработан опытно-промышленный регламент на производство 100 г субстанций рчГ-КСФ за один производственный цикл.

4. Разработанный технологический процесс производства рчГ-КСФ используется для производства лекарственного препарата «Нейпомакс».

Сведения об апробации работы.

Основные положения диссертации доложены на четвертом московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: Состояние и перспективы развития» (Москва 2007); на международной школе-конференции, посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетика (Москва 2008), на Российском симпозиуме с международным участием «Биофарма-2009»

(Турция, Анталия 2009); на международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.

А. Овчинникова (Москва - Пущино 2009).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Во введении обоснована актуальность работы и сформулирована ее цель и практическая значимость.

Литературный обзор состоит из трех частей. В первой части кратко описано строение и функция ГРЧ и Г-КСФ, проведено сравнение первичной структуры природных белков с их рекомбинантными аналогами. Описано применение лекарственных препаратов рГРЧ и рчГ-КСФ. Во второй части обсуждается тема, касающаяся солюбилизации и ренатурации белков, выделяемых из ТВ. В третьей части представлены основные требования, предъявляемые Европейской фармакопеей к фармацевтическим препаратам. Также достаточно подробно рассмотрены химические и биологические свойства эндотоксинов и обсуждены методы удаления эндотоксинов из биофармацевтических препаратов.

В экспериментальной части дается описание оборудования и материалов, использованных при проведении исследования и методик анализа.

В обсуждении результатов описаны этапы разработки технологии производства рГРЧ и рчГ-КСФ, проблемы, возникшие при оптимизации той или иной стадии и способы их решения. Приведены результаты масштабирования процессов и сравнительного анализа выделенных препаратов с импортными аналогами.

Диссертация изложена на 112 страницах, содержит 26 рисунков, 11 таблиц и список литературы из 128 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

Экспериментальная часть.

Объекты исследования. Получение рГРЧ и рчГ-КСФ осуществляли в штаммахпродуцентах E. coli BL-21(DE3)/pES1-6 и E. coli BL-21(DE3)/pES3-7, ранее сконструированных в ИБХ РАН. Продуктивность штаммов составляла 800 мг Met-рГРЧ и 400 мг рчГ-КСФ с 1 л культуральной жидкости. Синтезируемые белки образовывали нерастворимые тельца включения в клетках.

Методы исследования. Анализ фракций проводили методами ЕР 6.0 и ФС ЗАО «Мастерклон». В качестве внешних стандартов использовали Европейский стандарт соматотропина (Cedex, Швейцария) и фармацевтический препарат Г-КСФ «Нейпоген»

(Amgen Inc. США).

Динамическую емкость сорбентов по соматотропину и филграстиму определяли на модельных колонках Tricorn 5/50 (GE Healthcare, Швеция), заполненных соответствующим сорбентом, следующим образом: осуществляли сорбцию целевого белка на 1 мл геля до наблюдения десорбции. Количество сорбировавшегося белка рассчитывали по формуле:

Где ДЕ – динамическая емкость сорбента в г белка/л сорбента, Сисх – исходная концентрация целевого белка в г/л, Vисх – объем исходного раствора белка в л, Vост. – объем раствора белка, не прошедшего через колонку в л.

Коэффициент емкости (k) рассчитывали по формуле:

Где tx – время удерживания белка на колонке, t0 – время выхода свободного объема колонки.

Элюирование осуществляли линейным градиентом ионной силы. Во фракциях определяли концентрацию общего белка, родственных белков и наличие эндотоксинов и белков, продуцируемых клетками E.coli.

Качественное и количественное определение эндотоксинов проводили гель-тромб тестом с помощью ЛАЛ-реактива Endosafe (“Charles River Endosafe”, США) с заявленной чувствительностью =0,03 ЕЭ/мл КСЭ 10 нг/мл.

Содержание белков, продуцируемых клетками E.coli, определяли твердофазным иммуноферментным анализом с использованием набора “Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Е. coli Host Cell Proteins”(“Cygnus Technologies, Inc”, США).

Масштабирование процесса проводили с помощью хроматографической системы АKTAPilot (GE Healthcare, Швеция), управляемой программой «UNIСORN». Использовали промышленные колонны серии BPG 140/500, 200/500 (GE Healthcare, Швеция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГРЧ (соматотропин, соматотропный гормон) – белковый гормон, вырабатываемый передней долей гипофиза. Представляет собой одноцепочечный полипептид с молекулярной массой 22 кДа, структура которого стабилизирована двумя внутримолекулярными дисульфидными связями в положениях Cys - Cys и Cys -Cys. Основной функцией ГРЧ является регуляция соматического роста. Помимо этого, он участвует в регуляции метаболизма белков и липидов, влияет на углеводный и минеральный обмен, воздействует на скелет, соединительную, мышечную ткани, а также внутренние органы, такие как печень, кишечник и почки. Лекарственные препараты на основе ГРЧ применяют для лечения малорослости, синдрома Шерешевского – Тернера, гипофизарного нанизма и при комплексной терапии таких заболеваний, как диабет II типа, гипертония, атеросклероз, сердечно – сосудистая недостаточность, ожирение.

Г-КСФ - гликопротеин с молекулярной массой 19 кДа, содержит в положении Cys свободную сульфгидрильную группу и две внутримолекулярных дисульфидных связи в положениях Cys36- Cys42 и Cys64-Cys74. Продуцируется моноцитами, фибробластами и эндотелиальными клетками. Обладает стимулирующим действием на стволовые клетки, регулирует образование функционально активных нейтрофилов и их выход в кровь из костного мозга. В отличие от природной молекулы, рекомбинантный Г-КСФ (рчГ-КСФ), полученный путем экспрессии в клетках E.coli, не подвергается гликозилированию, но по аминокислотной последовательности и конформационной структуре идентичен природному. Большинство клинических данных по Г-КСФ были получены именно с этим препаратом. Лекарственные препараты на основе рчГ-КСФ применяются при лечении нейтропений различной этиологии и онкологических заболеваний.

Оптимизация процессов солюбилизации и ренатурации Met-рГРЧ и рчГ-КСФ.

Рекомбинантные белки, экспрессированные в ТВ, могут иметь как нативно-подобную вторичную структуру, так и структуру статистического клубка. Поэтому солюбилизация рекомбинантных белков из телец включения очень важный этап. Г-КСФ и ГРЧ относится к одному суперсемейству цитокинов типа I, так как обладают сходной третичной структурой (пучок из четырех антипараллельных -спиралей и три нерегулярных участка). Исходя из этого, мы предположили, что солюбилизация и ренатурации данных белков должна проходить по одинаковой схеме.

Растворение ТВ, в основном, зависит от температуры, времени экспонирования белка в растворе, рН и солюбилизирующего агента. На рис. 1 показана схема проведения исследования ренатурации рГРЧ и рчГ-КСФ из ТВ. Эффективность процесса оценивали по следующим характеристикам: выход целевого белка после ренатурации, время, затраченное на процесс и масштабируемость процесса.

Подбор условий солюбилизации и ренатурации начали проводить для рчГ-КСФ, так как данный белок является более сложным объектом, поскольку имеет свободную SH-группу.

Рис. 1. Схема исследования процесса ренатурации.

Солюбилизация в мягких условиях (Схема 1). ТВ рчГ-КСФ помещали в буферные растворы с различными значениями рН (от 7,0 до 12,5), которые содержали 20 мМ Трис-HCl и не содержали мочевину. Как следует из данных, представленных на рис. 2a, при значениях рН >10 выход белка из ТВ резко увеличивается. Таким образом, значение рН равное 12, было выбрано и на тот момент считалось оптимальным.

Далее изучали влияние концентрации мочевины на высвобождение белка из ТВ (с учетом выбранного значения рН) рис. 2b и на процесс ренатурации рис. 2c. Процедуру ренатурации проводили по следующей схеме: сначала раствор солюбилизированного белка в соотношении 1:100 разбавляли водой, затем рН реакционной смеси доводили до значения 8,0 и оставляли на 16-18 ч при комнатной температуре.

Рис. 2 Подбор условий солюбилизации рчГ-КСФ из ТВ. a) Влияние рН раствора на солюбилизацию рчГ-КСФ из ТВ; b) Зависимость концентрации рчГ-КСФ в солюбилизате от концентрации мочевины; c) Зависимость выхода рчГ-КСФ, % после ренатурации от концентрации мочевины в солюбилизате. За 100 % принято количество белка, солюбилизированного 8М мочевиной;

Как следует из представленных на рис. 2 данных, концентрация солюбилизированного рчГ-КСФ из ТВ в 8 М мочевине выше на 15 %, чем при солюбилизации в 2 М мочевине.

Однако максимальный выход целевого белка после ренатурации наблюдался при концентрации мочевины 2М и составлял 85-90 % от исходного количества солюбилизированного белка.

Поэтому в качестве оптимальной была выбрана концентрация мочевины 2 М. Максимальная концентрация белка в 2 М мочевине при рН 12, составляла 6 мг/мл.

Поскольку Г-КСФ имеет свободную SH-группу цистеина, поэтому его ренатурацию нельзя проводить в присутствии окислительно-восстановительных пар. Из литературных данных известно, что сульфат меди (CuSO4) в концентрации 40 мкМ катализирует процесс окисления цистеинов в молекуле рчГ-КСФ и позволяет использовать в процессе высокую концентрацию белка. Изучение кинетики окисления SH-групп в присутствии CuSO4 позволило установить максимальную концентрацию белка (0,5 мг/мл) и, время (16-18 ч), за которое рчГКСФ приобретает нативное конформационное состояние. Однако это время было также слишком долгим для технологического процесса.

Окисление SH-групп молекулярным кислородом в присутствии каталитических количеств ионов двухвалентных металлов происходит с образованием перекиси водорода (Н2О2) по следующей реакции:

Последняя может, в свою очередь, при нейтральных и кислых значениях рН также, окислять SH-группы цистеинов. Окислительно-восстановительный потенциал (Е0, В) Н2О2 выше, чем потенциал O2 почти в 2,5 раза (Е=+1,77 и +0,682). Мы предположили, что более высокий Е Н2О2 будет способствовать более эффективному образованию дисульфидных связей. Согласно реакции (4) мы теоретически рассчитали количество 37% Н2О2 (=1,138 г/см3), необходимое для образования двух дисульфидных связей в молекуле рчГ-КСФ (5,3мкМ):

В Табл. 1 представлены результаты изучения влияния Н2О2 на процесс ренатурации рчГ-КСФ в течение 60 мин и концентрации рчГ-КСФ 0,05 мг/мл.

Таблица 1. Влияния Н2О2 на ренатурацию рчГ-КСФ.

Как следует из приведенных в таблице 1 данных, реакция (4) проходит не стехиометрически и, скорее всего, при окислении цистеинов Н2О2 является сложной реакцией.

Для полного сворачивания рчГ-КСФ в описанных выше условиях необходимо 740 мкМ Н2О2.

Далее мы провели ряд экспериментов с целью минимизации объема. В ходе опытов меняли степень разведения солюбилизата (в 20, 10, 5 и 2 раз), при концентрации Н2О2 (740мкМ), времени ренатурации 60 мин и концентрации белка в солюбилизате 5 мг/мл. Эксперименты показали, что в процессе ренатурации максимальная концентрация белка может быть 1 мг/мл (в условиях описанных выше). Также было установлено, что при увеличении концентрации белка в растворе в 20 раз концентрацию Н2О2 необходимо увеличить в 1,4 раза.

Солюбилизация в жестких условиях (Схема 2).

Ранее лабораторией биокатализа ИБХ РАН был предложен высокоэффективный процесс получения рГРЧ, который согласно опубликованным данным, хорошо масштабировался. Мы оптимизировали стадии солюбилизации и ренатурации предложенного процесса.

Солюбилизацию Met-рГРЧ из ТВ проводили по стандартной процедуре с применением высокой концентрации хаотропных агентов (7 М гуанидин–HCl или 8 М мочевины) в присутствии ДТТ при 37°С. Максимальная растворимость белка в 8 М мочевине составляла 4–5 мг/мл. Использование 7 М гуанидин–HCl позволило обеспечить наиболее полное растворение ТВ, восстановление дисульфидных связей в молекуле и увеличить концентрацию солюбилизированного Met-рГРЧ до 9-10 мг/мл.

Для образования нативных дисульфидных связей была применена система буферных растворов, содержащих окислительно-восстановительную пару цистеамин/цистамин в соотношении 1:0,1. Оптимизацию условий проводили по нескольким параметрам: степень и скорость разбавления солюбилизата, состав буферного раствора для ренатурации. Процесс вели методом разбавления белка в буферном растворе с низкой ионной силой. Процедура ренатурации состояла из нескольких этапов. Сначала солюбилизированный белок переводили в буферный раствор, содержащий 8 М мочевину и 10 мМ цистеамин, с помощью гель-фильтрации для удаления ДТТ и гуанидин–HCl. Условия хроматографии были подобраны таким образом, чтобы конечная концентрация белка составляла 4-5 мг/мл. Затем полученный раствор белка разбавляли при комнатной температуре буферным раствором для ренатурации в течение 4 часов, варьируя степень разведения белка и концентрацию мочевины в конечной точке. Как следует из приведенных в таблице 2 данных, оптимальная концентрация белка в растворе для ренатурации в данных условиях составила 0,1 мг/мл, содержание мочевины 0,3 М, время ренатурации 8-10 часов.

Таблица 2. Оптимизация условий проведения ренатурации Met-РГРЧ в присутствии окислительно-восстановительной пары цистеамин:цистамин (1:0,1).

Далее оценили производительность каждой схемы. Для этого схему 1 применили для Met-рГРЧ. Оценивали следующие характеристики: выход целевого белка после ренатурации, время, затраченное на процесс и масштабируемость процесса.

Таблица 3. Сравнение эффективности схемы 1 и схемы 2 (S-солюбилизация, R-ренатурация).

* процесс провести не удалось, вследствие большого объема раствора белка (800 л) Как следует из приведенных в таблице 3 данных, схема 1 является более эффективной, чем схема 2. В результате проведенных экспериментов было установлено: схема 1 применима в случае Met-рГРЧ, но для полного сворачивания в течение 60 мин необходимо 650 мкМ Н2О2.

Таким образом, проведенный многофакторный анализ солюбилизации и ренатурации Met-рГРЧ и рчГ-КСФ позволил подобрать оптимальные общие условия для двух белков и добиться высокого выхода (80-87%) каждого белка с правильно замкнутыми S-S связями.

Исследование процесса ренатурации белков в присутствии Н2О2 в данной работе проводилось впервые. Оно показало, что Н2О2 в микромолярной концентрации эффективно окисляет SH-группы цистеинов в течение 60 мин при высокой концентрации белка и без образования побочных продуктов.

Подбор условий очистки Met-рГРЧ и рчГ-КСФ.

Ионообменная хроматография.

Первой стадией очистки была выбрана ионообменная хроматография среднего давления (ИОХ). Преимуществами использования ИОХ в технологическом процессе на первой стадии очистки являются: высокая рабочая скорость, сорбционная и разделяющая способность сорбентов. Подбор условий разделения проводили на тестовых колонках Tricorn 5/ (GE Healthcare, Швеция) объемом 1 мл и заполненных следующими сорбентами: Mono Q, Mono S, Q-Sepharose FF, SP-Sepharose FF (GE Healthcare, Швеция). Нагрузка на сорбент по общему белку при подборе условий разделения составляла 20 %. Исследовали влияние на процесс следующих факторов: рН буферных растворов, динамической емкости сорбента, рабочей скорости на процесс сорбции и десорбции.

1. Исследование влияния рН и размера частиц сорбента на процесс ИОХ.

Для очистки Met-рГРЧ методом ИОХ исследовали значения рН 7.0 и 8.0.

Как следует из приведенных на рис. 3 данных, очистка рГРЧ от примесей происходит наиболее эффективно на сорбенте Mono Q при значении рН 8.0. Следует отметить, что Q-Sepharose FF также обеспечивает эффективность разделения (Rs>1), достаточную для очистки рГРЧ от примесей.

Для очистки рчГ-КСФ методом ИОХ исследовали рН в интервале значений от 4.0-6.0.

Из литературных данных известно, что при значении рН 4.0 Г-КСФ проявляет максимальную конформационную стабильность. Поэтому рН раствора белка после ренатурации доводили до значения 4.0 с помощью уксусной кислоты, что приводило к помутнению раствора.

Как следует из данных, приведенных на рис. 4, примеси (пик 1, 3 и 4), содержащиеся в растворе при рН 8.0 (рис. 4а, б) отсутствуют в нем, после доведения рН до значения 4.0.

(рис. 4в). Эти данные позволяют сделать вывод, что стадия закисления является необходимой для очистки препарата от нестабильных форм. Далее супернатант наносили на SP-Sepharose FF.

Во время проведения процесса хроматографии весь белок сорбировался на колонке, однако потери на стадии десорбции (градиентное элюирование) составляли 45-50 % от исходного количества.

Важным фактором, оказывающим определяющее влияние на процесс ионообменной хроматографии, является состав буферных растворов. В таблице 4 представлены результаты изучения влияния CH3COO- и С6Н5О73- анионов на селективность процессов сорбции, десорбции рчГ-КСФ и выпадение примесей из раствора после ренатурации при различных значениях рН раствора.

Таблица 4. Влияние типа аниона на селективность процесса ИОХ Ионный состав буферного раствора 50 мМ NaCH3COO 5мМ Na3 С6Н5О