На правах рукописи

БОЛЬШАКОВА ОЛЬГА ИГОРЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТОГЕНЕЗА БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

НА МОДЕЛИ DROSOPHILA MELANOGASTER.

03.03.06- нейробиология, 03.03.01- физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт».

доктор биологических наук Научные руководители:

Саранцева С. В., заведующий лабораторией ФГБУ «Петербургский институт ядерной физики им.

Б. П. Константинова» НИЦ «Курчатовский институт», доктор биологических наук Полетаева И. И., ведущий научный сотрудник кафеды высшей нервной деятельности Биологического факультета ФГБОУ высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М. В.Ломоносова».

доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Климов Е. А. доцент, старший научный сотрудник кафедры генетики Биологического факультета ФГБОУ высшего профессионального образования «Московский государственный университет им.

М.В.Ломоносова», доктор биологических наук Рыбникова Е. А. ведущий научный сотрудник лаборатории нейроэндокринологии ФГБУН «Институт физиологии им. И. П. Павлова» РАН.

Ведущая организация: ФГБУН «Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии» РАН.

Защита состоится 18 ноября 2013 года в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 Биологического факультета Московского государственного университета имени М. В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, строение 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « » октября 2013года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, Умарова Белла Анверовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) нейродегенеративное заболевание, одним из наиболее важных факторов риска развития которого является возраст. Показано, что с увеличением продолжительности жизни человека в развитых странах, а также с увеличением доли пожилых людей в популяции, БА стала самой распространенной формой среди деменций разного типа. БА - прогрессирующее старческое слабоумие, поражающее более 15% населения в возрасте старше 65 лет. Первым признаком заболевания является легкое нарушение памяти на текущие события, которое появляется приблизительно за 5 лет до манифестации деменции (Petersen et al., 1999). Это может означать, что при БА нейродегенеративные процессы в мозге, по-видимому, начинаются задолго до начала заболевания. Наиболее важными нейропатологическими признаками этой болезни являются:

нейродегенеративные изменения в структурах мозга, наличие внутриклеточных нейрофибриллярных клубков и внеклеточных отложений амилоидного пептида (A) в виде «сенильных бляшек». Хотя основные патологические характеристики БА хорошо известны, тем не менее, до настоящего времени еще не существует ясного понимания механизмов, лежащих в основе ее патогенеза.

Важное значение придается гипотезе «амилоидного каскада» (Hardy, Selkoe, 2002), согласно которой к развитию БА приводит нарушение процессинга большого трансмембранного белка-предшественника амилоида (АРР), в результате чего образуется токсичный А42 пептид, который вызывает каскад событий, приводящих через многочисленные промежуточные этапы к развитию БА. Этот каскад включает: гиперфосфорилирование белка тау, разрушение микротрубочек, нарушение ионного гомеостаза нейронов и функций митохондрий, активацию глии, а также когнитивную дисфункцию вследствие развивающейся синаптической недостаточности. Однако в последние годы появилось много фактов, которые не укладываются в эту гипотезу. Кроме того, становится очевидной многофакторность данного заболевания.

Нейродегенеративные изменения в мозге может вызвать сложное взаимодействие между генетическими предпосылками, экологическими факторами, старением, медиаторами воспаления и т.д. В настоящее время существует много различных гипотез патогенеза БА. Так, «тау-гипотеза»

утверждает, что исходное нарушение при БА это чрезмерное фосфорилирование белка тау, которое приводит к трансформации его нормальной структуры и образованию в итоге нейрофибриллярных клубков.

Это, в свою очередь, вызывает дезинтеграцию микротрубочек, нарушение транспортной системы клетки – и приводит к ее гибели. Другие гипотезы этиологии и патогенеза БА предполагают нарушение процессов воспаления (Lucas et al., 2006), нарушение гомеостаза кальция (Bezprozvanny, Mattson, 2008), гормональные дисфункции (Hampl, Bickov, 2010), дисфункцию иммунной системы (Fulop et al., 2013), окислительный стресс (Tajes et al., 2013), нарушения процессов клеточного цикла и т.д. Все они пытаются объяснить причины когнитивных нарушений и нейродегенеративных изменений при БА.

Исследование участия в патогенезе БА генетических предпосылок, таких как мутации в генах АРР и пресенилинов, а также изучение нарушения функций, кодируемых ими белков и их взаимодействия, значительно расширяет наши представления об этом заболевании и дает возможность сделать предположения о происхождении спорадических форм этого заболевания.

Между тем, актуальность исследования БА и создание терапевтических препаратов, способных приостановить, или, по крайней мере, замедлить течение заболевания, стоит в последнее время особенно остро в связи с тем, что популяция пожилых людей в большинстве развитых стран растет более чем в раза быстрее по сравнению с общей численностью населения (Castellani et al., 2010). Нет сомнения, что понимание фундаментальных процессов, лежащих в основе патогенеза этой болезни, будет иметь большое социальное значение.

Цель исследования. Целью работы было проанализировать роль трех важных «участников» патогенеза болезни Альцгеймера: АРР (белкапредшественника бета-амилиода), пресенилина 1 (PS1) и собственно амилоидного пептида (А42) в развитии признаков этого заболевания с использованием в качестве модели трансгенных Drosophila melanogaster.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. На трансгенных линиях Drosophila исследовать влияние экспрессии генов человека: АРР, АРР с мутацией Swedish, PS1, его мутантных форм, а также последовательности А42 на продолжительность жизни, нейродегенеративные изменения мозга и поведение животных.

2. Провести анализ гибели холинергических и дофаминергических нейронов при экспрессии гена АРР человека в мозге Drosophila, а также попытаться разделить влияние экспрессии АРР и эффектов собственно амилоидного 3. Проанализировать влияние экспрессии гена PS1 человека и последовательности А42 на нейромышечные соединения (НМС) личинок Drosophila.

4. Провести исследование влияния экспрессии PS1 и последовательности А42 на распределение синаптических белков синаптотагмина и синаптобревина в мозге Drosophila 5. Исследовать влияние никотиновой кислоты на выживаемость, нейродегенеративные процессы в мозге, а также на способность к обучению и память у мух с экспрессией в нервных клетках генов АРР и бета-секретазы человека (BACE).

Основные положения, выносимые на защиту:

Снижение продолжительности жизни, нарушение поведения и нейродегенерация в мозге могут быть вызваны не только повышенным содержанием А42, но и гиперэкспрессией гена АРР человека и его мутантных форм.

Избыточная экспрессия АРР может приводить к нейродегенерации в мозге, которая затрагивает основные группы нейронов, такие как холинергические и дофаминергические. Гибель этих нейронов происходит независимо от образования А42.

Нарушение функций PS1, вызванное его гиперэкспрессией или мутациями, приводит к синаптическим нарушениям, которые усиливаются образованием А42.

Научная новизна. В работе показано, что экспрессия гена АРР человека в мозге Drosophila вызывает нейродегенерацию холинергических и дофаминергических нейронов. Впервые исследовано влияние экспрессии гена PS1 человека и его мутантных форм на нейромышечные соединения (НМС) Drosophila – на величину и форму синаптических бляшек (бутонов), число активных зон, распределение пресинаптических белков: синаптотагмина и синаптобревина, а также на количество и размеры кластеров митохондрий.

Исследовано также влияние совместной экспрессии PS1 человека, его мутантных форм и последовательности А42 на эти показатели, а также на распределение пресинаптических белков синаптотагмина и синаптобревина в грибовидном теле мозга Drosophila. Впервые показано влияние никотиновой кислоты на выживаемость и уровень нейродегенерации в мозге Drosophila.

Теоретическое и практическое значение работы. Исследование механизмов, лежащих в основе патогенеза БА, имеет большой теоретический и практический интерес, поскольку любые установленные факты патогенеза БА являются мишенью для разработки новых лекарств и лечебных мероприятий и могут иметь решающее значение для развития эффективной терапии. Кроме того, подобные исследования способствуют поиску новых возможностей для диагностики заболевания на ранних стадиях, т.е. до клинических проявлений, т.к. помогают лучше понять, каким образом синаптические изменения возникают и преобразуются в мозге.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях, конгрессах и симпозиумах: Первом международном симпозиуме «Combinatorial Sciences in Biology, Chemistry, Catalysts and Materials»

Международном Междисциплинарном конгрессе «Нейронауки для медицины и физиологии» (Судак, 2007, 2011, 2012, 2013); Третьей международной конференции «Фундаментальные науки – медицине»

(Новосибирск, 2007); Международном симпозиуме «Biological Motility. From fundamental achievements to nanotechnologies» (Пущино, 2008); Первой международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008); Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины возможное и реальное»

(Санкт-Петербург, 2010, 2012); Двадцать втором Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 4 работы опубликованы в журналах, включенных в список ВАК, 14 статей в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 130 страниц включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, (29 рисунков, 10 таблиц), заключение, выводы и список литературы, включающий 265 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования, его теоретическая и практическая значимость.

1. Обзор литературы. Рассмотрены современные представления о развитии патогенеза болезни Альцгеймера. Даны характеристики А, АРР и PS1, обсуждены данные о их роли в развитии болезни Альцгеймера. Обобщены данные о моделировании основных признаков болезни Альцгеймера на животных.

2. Материалы и методы. Перечислены линии Drosophila melanogaster, которые были использованы в работе. Описаны условия содержания мух и проведения экспериментов. Описаны основные методы, использованные в работе: высокоразрешающая сканирующая конфокальная микроскопия и световая микроскопия; приготовлениие препаратов мозга и нейромышечных соединений Drosophila; изготовление парафиновых срезов мозга Drosophila;

иммуногистохимические методы; методы анализа поведения, выживаемости и продолжительности жизни насекомых, статистические методы обработки данных.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Анализ продолжительности жизни, нейродегенерации и поведения Drosophila при гиперэкспрессии в их нервных клетках генов человека:

АРР, АРР с мутацией Swedish, PS1 и его мутантных форм, последовательности А42.

Для оценки того, какое участие в нейропатологии БА могут принимать АРР, A42 и PS1, мы провели сравнение интегрального показателя жизнедеятельности продолжительности жизни, а также уровня нейродегенерации в мозге и поведения Drosophila, с экспрессией в их нервных клетках генов человека: APP, APP-Swedish, PS1, PS1.M146V, PS1.P267S и собственно последовательности А42. Анализ кривых выживаемости показал, что в линиях с экспрессией АРР и АРР-Sw, особенно у мух с экспрессией АРР, наблюдается массовая гибель в первые дни их жизни, связанная с появлением нежизнеспособных мух с морфологическими нарушениями.

Продолжительность жизни мух с гиперэкспрессией АРР и АРР-Sw не сильно различалась между собой и составляла 40–44 дня, у мух с А продолжительность жизни была несколько выше и составляла 49–50 дней.

Экспрессия в геноме Drosophila PS1 дикого типа и PS1 с мутациями не снижала продолжительности жизни мух относительно контроля и составила 63 дня у контроля (Canton S), PS1, PS1.P267S и 67 дней – у PS1.M146V. Одновременная экспрессия PS1 и его мутантных форм с последовательностью А42 вызывала снижение выживаемости мух, сопоставимое с выживаемостью при экспрессии APP или APP-Sw.

Анализ 50% выживаемости показал, что самая низкая 50% выживаемость наблюдалась у мух с АРР и с АРР-Sw. 50% выживаемость мух с А42 была достоверно выше, чем АРР и АРР-Sw, но достоверно ниже, чем у мух контрольной линии и мух с экспрессией PS1 и PS1.M146V, 50% выживаемость которых была равна контролю. В то же время у мух с мутацией PS1.P267S она была достоверно ниже контроля, на уровне мух А42 (рис. 1).

На рис. 2 представлены результаты анализа нейродегенерации в мозге Drosophila, с экспрессией в нервных клетках мух генов человека: APP, APP с мутацией Swedish, PSN1, PS1.M146V, PS1.P267S и последовательности А42 на 25 день их жизни. Из рисунка следует, что самый высокий уровень нейродегенерации наблюдается у мух с экспрессией APP. У мух с экспрессией PS1 дикого типа и с мутациями этого гена уровень нейродегенерации в мозге соответствует контролю.

В таблице 1 представлены результаты анализа поведения Drosophila с экспрессией в нервных клетках генов APP, APP-Swedish, PS1, PS1.M146V, PS1.P267S и последовательности А42. Тесты заключались в оценке и анализе уровня локомоторной активности мух и геотаксиса.

Анализ поведения Drosophila melanogaster, с экспрессией в их нервных клетках генов APP, APP с мутацией Swedish, PS1, PS1.M146V, PS1.P267S и последовательности А генотип **,*** достоверно отличается от контроля при р 0.01, р 0.001, соответственно.

В первые дни жизни мухи исследованных линий не различаются между собой по этим параметрам. На 25 день у мух с экспрессией АРР, в отличие от контроля, обнаруживалось резкое снижение локомоторной активности и нарушение геотаксиса. Наблюдения показали, что у мух с экспрессией последовательности А42 снижается только локомоторная активность, но не геотаксис. У мух с экспрессией PS1 и PS1.P267S также наблюдалось ослабление локомоторной активности, однако, нарушение геотаксиса обнаруживали только мухи с экспрессией мутантного PS1. У мух с мутацией PS1.M146V геотаксис был в норме, а локомоторная активность была снижена незначительно. Одновременная экспрессия PS1и последовательности А вызывала снижение локомоторной активности у мух.

Полученные нами результаты полностью согласуются с данными о том, что при прямой экспрессии последовательности А 42 в нервных клетках мух у них наблюдаются нарушения локомоторной активности, нейродегенерация в мозге и ранняя гибель (Iijima et al., 2004). В то же время, сравнивая эти нарушения с нарушениями у мух с экспрессией гена АРР, мы видим, что в последнем случае эффекты оказываются более сильными. Экспрессия PS1, кроме PS1.P267S, не влияла на выживаемость мух и уровень нейродегенерации в их мозге, но в то же время она влияла на поведение этих мух, причем во всех случаях по-разному. Это может быть следствием нарушения синаптических функций при гиперэкспрессии PS1. Наши данные подтверждают предположение о том, что функции APP и PS1 в БА не ограничены только участием в продукции А.

3.2. Анализ влияния гиперэкспрессии гена АРР человека на нейродегенерацию в мозге мух холинергических нейронов способствует развитию значительных когнитивных расстройств людей с БА. Предполагается, что важную роль в гибели и дисфункции холинергических нейронов при БА играет образование А (Perez et al., 2005).

Мы исследовали роль гена АРР в развитии нейродегенерации на трансгенных линиях Drosophila, позволяющих дискриминировать эффекты экзогенного белка АРР и непосредственно А42. Анализ холинергических нейронов проводили на 3 – 5, 15 и 29 – 30 день их жизни методом конфокальной микроскопии, используя в качестве критерия общий уровень флуоресценции холинергических нейронов в мозге. Как видно из полученных данных (рис. 3), уровень флуоресценции нервной ткани мух на 3 – 5 день одинаков в контрольной и опытных линиях, в то время как на 15 – 17 день он снижен в линиях, экспрессирующих АРР, и достоверно снижен в мозге мух этих линий на 27 – 30 день. В контрольной линии относительный уровень флуоресценции во время опыта оставался практически неизменным.

Дисфункция дофаминергических нейронов характерна для различных нейродегенеративных заболеваний мозга и психических расстройств. С потерей дофаминергических нейронов в области черной субстанции в мозге человека связывают проявление симптомов паркинсонизма, которые наблюдаются у более чем трети больных БА (Kazee et al., 1995; Burns et al., 2005).

Drosophila собраны в небольшие билатеральные кластеры, расположенные по всему мозгу. Автоматический подсчет (программа ImageJ) числа дофаминергических нейронов был проведен на 3 – 5, 15 – 17 и 27 – 30 дни жизни. Полученные результаты представлены на рис. 4. Как видно из рисунка, количество дофаминергических нейронов, начиная с 15 – 17 дня, статистически достоверно снижается в линиях, экспрессирующих АРР. В то же время в контрольной линии количество дофаминергических нейронов остается на одном и том же уровне в течение всего этого временного периода. Между линиями, в которых гибель нейронов вызвана экспрессией APP и линиями с образованием А, статистически достоверных различий не выявлено. Таким образом, полученные нами результаты указывают на то, что гибель холинергических и дофаминергических нейронов, вызываемая экспрессией АРР, может происходить в мозге Drosophila в отсутствие образования А.

Анализ нейродегенеративных изменений при БА показывает, что у таких больных степень гибели холинергических нейронов коррелирует со степенью когнитивной дисфункции (Francis et al., 1999, Kar et al., 2004). Параллельно оценке состояния холинергических и дофаминергических нейронов в мозге Drosophila мы провели анализ способности мух к обучению и запоминанию навыка на 2 – 5 и 15 дни их жизни. Было использовано обучение мух избеганию удара электрического тока, ассоциированного с определенным запахом.

Способность к обучению и запоминанию в этом тесте оценивали соответствующими индексами. В таблицах 2 и 3 представлены результаты тестов на способность мух к обучению и запоминанию Влияние экспрессии генов APP и BACE на обучаемость трансгенных мух Cha/APP Cha;APP-Sw Cha/BACE;APP-Sw APP;ple APP/BACE;ple APP-Sw/ple BACE;APP-Sw/ple В таблице представлены индексы обучения, которые рассчитывали как разницу числа мух, сделавших «правильный» выбор (т.е. выбравших обонятельный стимул, не совмещенный с электрическим током), и числа мух, сделавших «неправильный»

выбор, деленную на общее число мух и умноженную на 100.

* достоверно отличается от контрольных линий при p 0.05 (однофакторный ANOVA и post hoc тест Tukey-Kramer multiple comparison).

Влияние экспрессии генов APP и BACE на память трансгенных мух Cha/APP Cha;APP-Sw Cha/BACE;APP-Sw APP;ple APP/BACE;ple APP-Sw/ple BACE;APP-Sw/ple В таблице представлены индексы памяти, которые рассчитывали как разницу числа мух, сделавших «правильный» выбор (т.е. выбравших обонятельный стимул, не совмещенный с электрическим током), и числа мух, сделавших «неправильный»

выбор, деленную на общее число мух и умноженную на 100.

* - достоверно отличается от контрольных линий при p 0.05 (однофакторный ANOVA и post hoc тест Tukey-Kramer multiple comparison).

Из этих данных следует, что способность животных к обучению и запоминанию была достоверно снижена по сравнению с контролем уже со второго дня жизни мух. Это показано как для линий, экспрессирующих только АРР (АРР-Sw), так и для линий, у которых происходило формирование А42.

Важно отметить, что гибель нейронов начинали регистрировать, начиная только с 15 или 30 дня жизни мух.

Таким образом, выявленное в наших экспериментах резкое снижение способности мух к обучению и запоминанию по сравнению с контролем указывает на то, что происходят более ранние события, чем формирование А, связанные, по всей видимости, с потерей синапсов. В этой связи надо отметить, что проведенные post mortem исследования мозга больных БА показали, что гибель синапсов предшествует изменению уровня ChATв (Tiraboschi et al., 2000).

3.3. Анализ морфологических и функциональных нарушений в нейромышечных соединениях личинок Drosophila при экспрессии гена PS человека и последовательности A42.

Гиперэкспрессия PS1 в нервных клетках Drosophila не вызывала преждевременной гибели мух и нейродегенерации, но изменяла поведение животных. Для анализа клеточных механизмов, лежащих в основе наблюдаемых нарушений, мы исследовали морфологическое и функциональное состояние нейромышечных соединений (НМС) личинок Drosophila при экспрессии гена PS1, а также при совместной экспрессии PS1 и последовательности А42. В отличие от центральных синапсов позвоночных, у насекомых каждый моторный нейрон, образующий пресинаптическое окончание, каждая «постсинаптическая» мышечная клетка легко различимы и уникальны. Это позволяет анализировать функции синапса in vivo на уровне одного нейрона.

Была осуществлена экспрессия гена PS1 человека и его мутантных форм в моторных нейронах личинок Drosophila, а морфология НМС детально исследована (рис. 5). НМС присутствовали во всех сегментах тела, и они имели стандартную морфологию. Было проанализировано количество синаптических бутонов. Полученные данные представлены в таблице 4.

Количество синаптических бутонов в НМС личинок Drosophila разных генотипов PS1/+ PS1.M146V/+ PS1.P267S/+ *, **, достоверно отличается от контроля при р 0.05, р 0.01.

При экспрессии гена PS1 дикого типа, его мутантных форм, а так же последовательности A42 общее число бутонов не отличалось от контроля, в качестве которого использовали линию CD8/+;D42/+. В то же время было обнаружено увеличение числа саттелитных бутонов при экспрессии гена PS1, а также при одновременной экспрессии PS1 дикого типа и A42. Саттелитные бутоны это растущие, отделяющиеся от родительских бутонов или от межбутонной связки (интерстициальные бутоны). Изменение их числа свидетельствует, в частности, о нарушениях в формировании НМС (Carrillo et al., 2013). Полученные данные свидетельствуют об участии пресенилина в образовании НМС.

Показателем функционального состояния НМС является число активных зон в пресинаптических терминалах. Активные зоны – это места высвобождения нейромедиатора и изменение их числа может свидетельствовать о наличии синаптической дисфункции (Smith, Taylor, 2011).

На рис. 6 представлены снимки НМС разных генотипов (конфокальная микроскопия), на которых активные зоны визуализированы с помощью антител к белку дрозофилы Bruchpilot, который является важным компонентом активной зоны синапса (Wagh et al., 2006). В таблице 5 представлены количественные данные по числу активных зон синапсов. Можно видеть, что в линиях с экспрессией гена PS1 дикого типа и его мутантных форм число активных зон ниже, чем в контроле более, чем в 2 раза. Наименьший эффект наблюдается для экспрессии PS1.P267S. При совместной экспрессии гена PS1 и последовательности A42 число активных зон было таким же, как при экспрессии только гена PS1.

Анализ активных зон в НМС личинок Drosophila разных генотипов PS1/+ PS1.M146V/+ PS1.P267S/+ *, **, *** достоверно отличается от контроля при р 0.05, р 0.01 и P0.001, соответственно.

Другим важным показателем функционального состояния НМС является состояние митохондрий в аксонах и НМС. На рис. 7 и в таблице 6 представлены данные по количественной оценке кластеров митохондрий в НМС. В контрольной линии митохондрии собраны в большие ярко светящиеся кластеры. В линии c экспрессией гена PS1.P267S наблюдалось уменьшение числа кластеров митохондрий и уменьшение их размеров. В остальных линиях число кластеров и их размер были на уровне контроля. Из таблицы 6 видно, что при одновременной экспрессии гена PS1 и последовательности A42 число кластеров митохондрий не отличается от контроля, но они меньше по размеру Анализ митохондрий в НМС личинок Drosophila разных генотипов PS1/+ PS1.M146V/+ PS1.P267S/+ *, ** достоверно отличается от контроля при р 0.05 и р 0.01, соответственно.

Рис. 5. Анализ морфологии НМС личинок Drosophila разных генотипов.

А Контроль, Б PS1/+, В PS1.M146V/+, Г PS1.P267S/+, Д A42/+;PS1/+, Е A42/+;PS1.M146V/+.

Рис. 6. Анализ активных зон НМС личинок Drosophila разных генотипов.

А Контроль, Б PS1/+, В PS1.M146V/+, Г PS1.P267S/+, Д A42/+;PS1/+, Е A42/+;PS1.M146V/+.

Рис. 7. Анализ митохондрий в НМК Drosophila разных генотипов.

А Контроль, Б PS1/+, В PS1.M146V/+, Г PS1.P267S/+, Д A42/+;PS1/+, Е A42/+;PS1.M146V/+.

Число кластеров митохондрий в аксонах в линиях с экспрессией гена PS1 было снижено: контроль 11,6±0,6; PS1/+ 7,8±0,8 (р 0.01);

PS1.M146V/+ 8,6±0,8 (р 0.05); PS1.P267S/+ 7,8±0,8 (р 0.05);

A42/+;PS1/+ 7,5±0,4 (р 0.01); A42/+;PS1.M146V/+ 8,7±0,6 (р 0.01 и р 0.05, соответственно).

Следует отметить, что уменьшение числа митохондрий и нарушение их функций наблюдаются и в мозге больных БА (Mattson et al., 2008; Lin and Beal, 2006; Reddy, 2009; Wang et al., 2009). Однако в настоящее время не существует однозначного ответа на вопрос: являются ли эти нарушения следствием патологии при БА или основополагающими событиями в патогенезе этого заболевания. Полученные нами данные показывают, что при экспрессии гена PS1 человека и его мутантных форм, а также при экспрессии последовательности A42 происходит нарушение распределения митохондрий.

Мы предполагаем, что обнаружение их сниженного числа в аксонах может свидетельствовать о нарушении транспорта митохондрий. В свою очередь, дефекты транспорта могут быть причиной синаптической дисфункции.

Наблюдаемое уменьшение размеров кластеров митохондрий также свидетельствует о происходящих нарушениях, причем экспрессия A42 в этом случае вносит свой существенный вклад.

3.4. Распределение пресинаптических белков в мозге Drosophila при экспрессии гена PS1 человека.

Для оценки изменений в синапсах при гиперэкспрессии PS1, его мутантных форм и последовательности A42 мы исследовали распределение пресинаптических белков синаптотагмина 1 (synaptotagmin 1, syt1) и синаптобревина (n-synaptobrevina, n-syb) в линиях с экспрессией PS1. Мы проанализировали распределение syt1 и n-syb в грибовидных телах и каликсе мозга Drosophila в зависимости от возраста мух. Грибовидные тела являются самыми важными ассоциативными центрами мозга мух. Они играют важную роль в координации сложного поведения: обучения и памяти. Анатомически грибовидные тела состоят, в основном, из аксонов определенной популяции нейронов, называемых клетками Кеньона. Дендриты этих клеток образуют другую структуру мозга – каликс. Проведенный нами анализ распределения пресинаптических белков показал их присутствие не только в грибовидном теле, но и в каликсе. Недавние исследования выявили существование в каликсе пресинаптических активных сайтов. Предполагается, что через них осуществляется связь между отдельными субпопуляциями клеток Кеньона, в частности ответственными за восстановление и консолидацию памяти (Christiansen et al., 2011).

Анализ распределения syt1 в мозге Drosophila на 30 день жизни представлен в таблице 7, из которой следует, что уровень syt1 в грибовидном теле при экспрессии гена PS1 и последовательности A42 не отличается от такового в контроле. В то же время в каликсе уровень syt1 резко снижен. То же самое было выявлено при совместной экспрессии PS1 дикого типа и последовательности A42. При этом в случае совместной экспрессии последовательности A42 и мутантного PS1 количество этого белка в каликсе по сравнению с контролем не снижалось, а увеличивалось.

Распределение syt1 мозгe Drosophila *** достоверно отличается от контроля при р 0. Другая картина наблюдалась при анализе распределения n-syb (Таблица 8). При экспрессии PS1 его количество было уменьшенным по сравнению с контролем в грибовидном теле и в каликсе, хотя в каликсе снижение и не было столь сильным, как в случае с syt1. Однако в случае совместной экспрессии последовательности A42 и мутантного PS1(PS1.P267S) количество этого белка в каликсе по сравнению с контролем было также не снижено, а повышено.

PS1.M146V/+ PS1.P267S/+