На правах рукописи

МАТВЕЕВА

Марина Викторовна

РОЛЬ ЭНТЕРОЦИТОПРОТЕКТОРНОГО КОМПОНЕНТА

В ДЕТОКСИКАЦИОННОМ ЭФФЕКТЕ

АНТИГИПОКСАНТНОЙ ТЕРАПИИ

14.03.03 – патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2012

Работа выполнена в ФГБОУВПО «Российский университет дружбы народов», ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Саушев Игорь Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Трубицына Ирина Евгеньевна доктор медицинских наук профессор Пирожков Сергей Викторович

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО национальный исследовательский «Российский медицинский университет имени Н. И. Пирогова»

Защита состоится 11 апреля 2012 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.06 ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

по адресу: 117198 г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198 г. Москва, ул. МиклухоМаклая, 8.

Автореферат разослан «_» 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Г.А. Дроздова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Проблема перитонита в настоящее время не теряет актуальности из-за широкой распространенности заболевания и большой продолжительности лечения, высокого уровня летальности, особенно при присоединении осложнений – абдоминального сепсиса, полиорганной недостаточности, инфекционно-токсического шока (Гельфанд Б.Р. и др., 2000; Григорьев Е.Г. и др., 2000; Завада Н.В. и др., 2002; Савельев В.С. и др., 2006; Brun-Buisson C. et al., 1995; Kologlu M. et al., 2001). Острый перитонит – заболевание, затрагивающее все органы и системы. Патоморфологические изменения при остром перитоните, происходящие в кишечнике, обуславливают формирование энтеральной недостаточности, играющей особую роль в развитии системного воспалительного ответа, абдоминального сепсиса и комплекса висцеральных нарушений за счет выброса большого количества эндотоксинов в кровоток (Гаин Ю.М. и др., 2001;

Изимбергенов В.И. и др., 2003; Илларионов М.Ю. и др., 2004; Косинец А.Н. и др., 2004; Зайцев В.М. и др., 2008). Трансинтестинальная транслокация бактерий обуславливает степень выраженности и характер синдрома эндогенной интоксикации перитонеального генеза (Скорляков В.В., 2003; Чернов В.Н., 2004; Deitch E.A. et al.,1990; O'Boyle C.J. et al., 1998). Наряду с энтеральной недостаточностью, большое значение в прогрессировании эндотоксикоза при остром перитоните придается активизация процессов перекисного окисления липидов в комплексе с повышением активности ФЛА2 и подавлением собственной системы антиоксидантной защиты, приводящей в дальнейшем к деструкции мембран клеток, которая в свою очередь усиливает нарушения гомеостаза и метаболический дисбаланс в различных органах и тканях, в том числе кишечника, что является значимым для определения тяжести течения и исхода заболевания (Ерюхин И.А., 1987; Белова Т.А. и др., 2000; Алиев С. А. и др., 2003; Трофимов В. А., 2005;

Власов А.П. и др., 2007; Логинова О.В., 2008).

Многофакторность и поликомпонентность патогенеза острого перитонита обуславливают значительные трудности в выборе оптимальной лечебной тактики при энтеральной недостаточности на фоне острого перитонита. Невзирая на большие успехи современной медицины в области диагностики и совершенствование терапевтических схем, лечение не всегда оказывается эффективным (Власов А.П. и др., 2007).

Весьма актуальна проблема поиска путей повышения результативности терапии с помощью влияния на основные патогенетические механизмы при остром перитоните, данные о которых на настоящий момент не являются исчерпывающими. В частности, недостаточно сведений об участии гипоксии и липопероксидации в клеточных структурах тонкой кишки в развитии энтеральной недостаточности. Отсутствуют данные об эффективности антигипоксантной терапии в коррекции функционально-метаболического статуса кишечника.

Указанному кругу вопросов и посвящена настоящая работа.

Цель исследования. Дать оценку значимости энтероцитопротекторного эффекта антигипоксантной терапии в коррекции эндогенной интоксикации при остром перитоните.

Задачи исследования.

1. На модели острого перитонита в динамике определить выраженность мембранодестабилизирующих явлений клеточных структур слизистой и серозно-мышечной оболочек тонкой кишки.

2. Выявить значимость гипоксии и процессов перекисного окисления липидов в патогенезе мембранодестабилизирующих явлений клеточных структур различных оболочек стенки тонкой кишки при остром перитоните.

3. Установить при остром экспериментальном перитоните сопряженность развития энтеральной недостаточности с функционально-метаболическим состоянием тонкой кишки.

4. Определить патогенетическую направленность антигипоксантной терапии (на примере ремаксола) в коррекции энтеральной недостаточности и эндогенной интоксикации при остром перитоните.

5. Установить влияние антигипоксантной терапии на липидный обмен в клеточных структурах различных оболочек стенки тонкой кишки.

Научная новизна. Дана экспериментальная оценка значимости мембранодестабилизирующих явлений клеточных структур в различных оболочках тонкой кишки в развитии острой энтеральной недостаточности и эндогенной интоксикации при перитоните. Установлено, что в патогенезе острой энтеральной недостаточности при перитоните определяющую роль играют мембранодестабилизирующие явления в клеточных структурах слизистой оболочки, меньшую – в серозно-мышечной. Доказано, что в развитии мембранодестабилизирующих явлений в клеточных структурах кишечной стенки при остром перитоните важную роль играют гипоксия и процессы перекисного окисления липидов. Выявлено, что в начале заболевания в слизистой оболочке превалируют явления гипоксии, в серозно-мышечной оболочке – процесс перекисного окисления липидов. Установлено, что в динамике заболевания в исследованных тканевых объектах до 2 суток отмечается пропорциональное повышение активности указанных патогенных агентов, а затем вплоть до конца периода наблюдения – их снижение с преобладанием темпа уменьшения гипоксии.

Экспериментально показано, что своевременное применение антигипоксанта ремаксола приводит к существенному снижению уровня токсических продуктов в портальной системе – важнейшему эффекту в коррекции энтеральной недостаточности. Установлено, что в основе указанного эффекта антигипоксанта лежит его мембранопротекторная активность за счет способности быстро корригировать явления гипоксии в начале заболевания в слизистой оболочке и процессы перекисного окисления липидов – в серозно-мышечной.

Практическая ценность работы. В хронических опытах установлено, что развитие энтеральной недостаточности при остром перитоните сопряжено с мембранодестабилизирующими явлениями в тканевых структурах кишечной стенки, особенно в слизистой оболочке.

Показано, что включение в терапию острого перитонита антигипоксанта ремаксола приводит к существенному уменьшению проявлений энтеральной недостаточности и, как следствие, воспалительного процесса в брюшной полости. Выявлено, что наибольшая эффективность антигипоксантной терапии в купировании энтеральной недостаточности при остром перитоните отмечается в своевременном применении препарата, когда возможно предупредить резкое прогрессирование мембранодестаблизирующих явлений со стороны слизистой оболочки кишечника.

Положения, выносимые на защиту.

1. В патогенезе острой энтеральной недостаточности при перитоните определяющую роль играют мембранодестабилизирующие явления в клеточных структурах слизистой оболочки, меньшую – в серозно-мышечной. В развитии мембранодестабилизирующих явлений в клеточных структурах кишечной стенки при остром перитоните важную роль играют гипоксия и процессы перекисного окисления липидов.

2. Своевременное применение антигипоксанта ремаксола при остром перитоните приводит к уменьшению энтеральной недостаточности. В основе указанного эффекта препарата лежит его мембранопротекторная активность за счет способности корригировать явления гипоксии и процессы перекисного окисления липидов в тканевых структурах кишечной стенки.

Внедрение в практику. Разработанные диссертационные положения включены в программу обучения студентов на кафедре факультетской хирургии Медицинского института Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарева.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на Огаревских чтениях – научно-практической конференции Мордовского университета (Саранск, 2007–2011), Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в ХХI веке» (Москва, 2011), III межрегиональной научной конференции (Пенза, 2011), XVIII Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2011), XV научной конференции молодых ученых Медицинского института Мордовского государственного университета (Саранск, 2011), IV Всероссийской конференции с международным участием «Медикофизиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2011), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (СанктПетербург, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), материалов и методов исследования (2-я глава), результатов собственных исследований (3–5-я главы), обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 205 отечественных и 88 иностранных источников. Работа содержит 28 таблиц и 34 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В основу работы положены экспериментальные исследования на 36 взрослых беспородных половозрелых собаках обоего пола массой от 8,37 до 14,44 кг. В процессе исследования животные были разделены на две группы.

Первая группа (I) – контрольная (n = 18). В этой группе при остром экспериментальном перитоните на фоне антибактериальной и инфузионной терапии исследовали выраженность энтерального синдрома по уровню токсических продуктов гидрофобной и гидрофильной природы в плазме крови общего кровотока и в портальной системе (брыжеечного кровотока), интенсивность процессов ПОЛ (по накоплению МДА, ДК и ТК), активность ФЛА2, состояние антиоксидантной системы (по активности СОД и каталазы) в тканях тонкой кишки. Состояние биомембран клеточных структур оценивали по качественным и количественным характеристикам липидного спектра тканей стенки тонкой кишки.

Вторая группа (II) – опытная (n = 18). В данной группе оценивали динамику указанных биохимических показателей при включении в комплексную терапию острого экспериментального перитонита антигипоксанта ремаксола в дозе 15 мл на 1 кг массы тела животного (ежедневное внутривенное введение).

Моделирование перитонита проводилось по способу профессора Власова А. П. (1991). Животным под внутривенным тиопентал-натриевым наркозом (0,04 г на 1 кг массы тела) в брюшную полость шприцем вводили 20% каловую взвесь из расчета 0,5 мл на 1 кг массы тела. Через сутки выполняли срединную лапаротомию, оценивали выраженность патологических изменений в брюшной полости, проводили ее санацию, шов раны. В контрольные сроки (1-е, 2-е, 3-и и 5-е сутки) послеоперационного наблюдения производили релапаротомию, забор венозной крови из брыжеечных и нижней полой вен, биопсию серозномышечного и слизистого слоя тонкой кишки. Экспериментальные исследования проводились исключительно под внутривенным наркозом (тиопенталнатрия из расчета 0,04 г на 1 кг массы тела животного). Каждому животному выполняли не более одной релапаротомии. Животных из эксперимента выводили введением летальной дозы тиопентал-натрия.

В послеоперационном периоде животным указанных групп проводили антибактериальную и инфузионную терапию: внутримышечные инъекции 2 раза в сутки раствора гентамицина из расчета 0,8 мг на 1 кг массы тела; внутривенно 1 раз в сутки 5% раствор глюкозы и 0,89% раствор хлорида натрия из расчета 50 мл на 1 кг массы тела.

Для получения исходных данных (условная норма) были изучены перечисленные показатели у 8 здоровых животных. Опыты выполнялись в соответствии с этическими требованиями к работе с экспериментальными животными («Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных»

(приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1987 г.), Федеральный закон «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г., приказ МЗ РФ от 19.06. г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики»), одобрены локальным этическим комитетом.

В работе использованы следующие методы исследования:

Определение содержания пирувата производили при проведении реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (Кушманова О.Д., Ивченко Г.М., 1983). Содержания лактата устанавливали по реакции с параоксидифенилом (Меньшиков В.В., 1987). Липиды из тканей кишечника экстрагировали хлороформметаноловой смесью (Хиггинс Дж.А., 1990). Липиды фракционировали методом тонкослойной хроматографии. Полярные фосфолипиды разделяли на пластинах фирмы «Merk» на стеклянной основе, нейтральные липиды – на силикагелевых пластинах для обращено-фазной тонкослойной хроматографии (Хиггинс Дж. А., 1990; Vaskovsky V.E. et al., 1975). Молекулярный анализ проводили на денситометре GS-670 (BIO-RAD, США) с соответствующим программным обеспечением (Phosphor Analyst/PS Sowtware). Показатели интенсивности ПОЛ: уровень диеновых и триеновых конъюгатов определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 232-233 и 275 нм (Ганстон Ф.Д., 1986); малонового диальдегида – спектрофотометрическим методом в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Sigma), активность каталазы – спектрофотометрическим метод с помощью молибдата аммония (Королюк М.А., 1988); активность супероксиддисмутазы оценивали в реакции с нитросиним тетразолием (Гуревич В.С. и др., 1990). Активность фосфолипазы А2 исследовали в среде, содержащей 10 ммоль трис-HCL-буфер (рH 8,0), 150 ммоль «Тритон Х-100», 10 ммоль CaCl2 и 1,2 ммоль субстрата, в качестве которого использовали фосфатидилхолины яичного желтка. Выраженность эндогенной интоксикации оценивали по следующим показателям: содержание молекул средней массы определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-46 при длинах волн 254 и 280 нм (Пикуза О.И., Шакирова Л.З., 1994); общую и эффективную концентрацию альбумина в сыворотке крови – флуоресцентным методом на специализированном анализаторе АКЛ-01 «Зонд»" (Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е., 1994).

Полученные цифровые данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента t и коэффициента корреляции r.

Вычисления производили на CPU 1600 MHz «Intel Pentium-IV» с помощью пакета программ «Microsoft Office». Динамика показателей отражена на графиках, построенных с использованием программы электронных таблиц «Microsoft Excel 2003».

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате исследования установлено, что моделирование острого экспериментального перитонита по описанному ранее способу приводили к развитию воспалительного процесса в брюшной полости уже на следующие сутки.

Эндогенная интоксикация, неизбежно возникающая при остром перитоните, играет значимую роль в патогенезе заболевания, а также во многом определяет его тяжесть и прогноз (Ерюхин И.А. и др., 2001). Насыщение организма эндотоксинами, происходящее в результате развития синдрома энтеральной недостаточности и сопутствующая ему транслокация микроорганизмов из просвета кишечника в брюшную полость в настоящее время оцениваются как основные индукторы формирования абдоминального сепсиса, синдрома системного воспалительного ответа, полиорганной и полисистемной недостаточности при остром перитоните (Савельев В.С. и др., 2004), что согласуется с результатами, полученными в ходе исследования. В контрольной группе выявлен существенный рост концентрации гидрофильных и гидрофобных токсинов в плазме крови на уровне общего кровотока, что говорит о формировании синдрома эндогенной интоксикации. Так, в общем кровотоке показатели среднемолекулярных пептидов ( = 254 нм и = 280 нм) возрастали соответственно на 70,97– 132,26 и 48,57–111,43 % (р < 0,05) по сравнению с нормой (рис. 1).

Рис. 1. Показатели эндогенной интоксикации в системном кровотоке при остром перитоните (значения нормы приняты за 100 % ) Также регистрировалось снижение эффективной концентрации и резерва связывания альбумина на 43,22–52,75 и 37,84–56,76 % (р < 0,05) относительно первоначальных показателей, одновременно с повышением индекса токсичности плазмы на 251,52–545,45 % (р < 0,05).

По сравнению с системным кровотоком в локальном кровотоке исследуемые показатели претерпевали более значительные изменения: уровень молекул средней массы ( = 254 нм и = 280 нм) возрастал соответственно на 70,97–132,26 и 48,57– 111,43 % (р < 0,05) по отношению к исходным данным (рис. 2).

Рис. 2. Показатели эндогенной интоксикации в локальном кровотоке при остром перитоните (значения нормы приняты за 100 % ) Эффективная концентрация и резерв связывания альбумина, по сравнению с нормой, были снижены на 47,49–60,20 и 42,25–59,15 % (р < 0,05), также фиксировалось увеличение индекса токсичности плазмы на 220,45–456,81 % (р < 0,05). Приведенные данные демонстрируют развитие энтеральной недостаточности при остром перитоните.

Ряд исследований свидетельствует, что изменение липидного спектра при остром перитоните происходит за счет повышения активности процессов перекисного окисления липидов (Власов А.П. и др., 2004). Наиболее значимым патогенетическим аспектом энтеральной недостаточности является увеличение интенсивности и дисбаланс липопероксидации и системы собственной антиоксидантной защиты. Дефицит кислорода и энергетических субстратов способствует накоплению недоокисленных метаболитов, ацидозу и интенсификации свободнорадикального окисления, что в дальнейшем разрушает липидный бислой клеток различных органов и тканей, в том числе кишечника (Ермолов А.С., 2005).

Исследования, проведенные в контрольной группе, обнаружили существенное увеличение активности процессов перекисного окисления липидов при остром перитоните. Отмечался рост концентрации ДК, ТК и МДА относительно нормы в серозно-мышечном слое тонкой кишки на 85,71–133,33; 169,23– и 85,27–180,86 % (p < 0,05) соответственно (рис. 3).

I II I II I II I II

ДК МДА ФЛА2 СОД

Рис. 3. Динамика показателей ПОЛ, активности ФЛА2, каталазы и СОД в серозномышечном (I) и слизистом (II) слоях тонкой кишки при остром экспериментальном перитоните В слизистом слое тонкой кишки также регистрировалось увеличение содержания ДК, ТК и МДА сравнительно с первоначальными показателями соответственно на 68,18–77,27; 78,57–85,71 и 37,88–70,99 % (p < 0,05).

Увеличение активности фосфолипазы А2 может служить другим источником повреждения клеточных мембран. Зафиксирована связь между активацией фосфолипазы А2 и процессами перекисного окисления липидов. Липиды, содержащие гидропероксидные группировки, активируют липолитический фермент – фосфолипазу А2, активная фосфолипаза также ускоряет липопероксидацию (Литвинко Н.М., Кисель М.А., 1991; Губергриц Н.Б. и др., 2000). Результаты нашего исследования позволяют заключить, что активность фосфолипазы А увеличивается при остром экспериментальном перитоните по сравнению с первоначальными показателями в серозно-мышечном и слизистом слоях тонкой кишки на 97,90–138,46 и 59,57–124,82 % (p < 0,05). Вместе с тем отмечалось ингибирование ферментативной способности супероксиддисмутазы и каталазы в серозно-мышечном слое на 54,47–67,32 и 52,07–76,35 % (p < 0,05), в слизистой оболочке тонкой кишки снижение составило 32,55–57,65 и 27,83–66,25 % (p < 0,05) соответственно.

Доказанным является факт модификации липидного спектра клеточных структур кишечника при синдроме энтеральной недостаточности. Изменение метаболизма липидов в тканях кишечника являются патоморфологическими компонентами острого перитонита, что может содействовать прогрессированию нарушения функции органов, расстройству перистальтики кишечника и увеличивать насыщение организма кишечными эндотоксинами (Власов А.П. и др., 2004).

В результате исследований, проведенных в контрольной группе животных, обнаружена модификация липидного спектра биомембран как в серозномышечном, так и в слизистом слое тонкой кишки, причем изменения липидного состава были различными. Так, в серозно-мышечном слое на начальных этапах эксперимента отмечалось уменьшение доли суммарных фосфолипидов на 27,97 %, эфиров холестерола – на 16,82, параллельно с увеличением холестеро-