На правах рукописи

Катушкина Анастасия Анатольевна

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ЛЕЙКОПЛАКИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ РТА

14.03.02 – патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва, 2011 1

Работа выполнена на кафедре патологической анатомии медицинского факультета ГОУ ВПО Российского университета дружбы народов.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Игорь Иванович Бабиченко

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Аркадий Сергеевич Ягубов доктор медицинских наук, профессор Людмила Михайловна Михалева

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится «16» февраля 2011 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.06 в ГОУ ВПО Российском университете дружбы народов по адресу: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО Российского университета дружбы народов.

Автореферат разослан «14» января 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Галина Александровна Дроздова

I.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лейкоплакия заболевание, (ЛП) – характеризующееся патологическим ороговением слизистой оболочки рта (СОР) или красной каймы губ, возникающее в ответ на хроническое экзо- и эндогенное раздражение (Рабинович И.М. и др., 2007). Наряду с эритроплакией, красным плоским лишаем, дискоидной красной волчанкой лейкоплакия СОР рассматривается как предраковое заболевание (Neville B.W.

et al., 2002; Thomas G. et al., 2003; Santos-Garcia A. et al., 2005). Определенные виды ЛП могут трансформироваться в плоскоклеточный рак СОР (Rosin M.P. et al., 2000). Злокачественная трансформация отмечается от 2% до 36% случаев в зависимости от гистологического строения ЛП СОР (Зиновьев А.С. и др., 1999;

Lee J.J. et al., 2000; Kim J. et al., 2001; Santos-Garcia A. et al., 2005).

Существует несколько классификаций лейкоплакии СОР, в основе которых лежат клинико-морфологические особенности. Общепринятой является классификация А.Л. Машкилейсона (1970), согласно данной классификации выделяют простую, веррукозную (бляшковидную и бородавчатую) и эрозивноязвенную формы. В 2005 г. ВОЗ была принята новая классификация заболеваний головы и шеи, в которой вводится понятие «эпителиальный предрак» (Warnakulasuriya S. et al., 2007), к нему относятся лейкоплакия и эритроплакия СОР. Гистологически ЛП СОР была разделена на следующие виды: плоскоклеточная гиперплазия (ЛП без атипии), низкая степень дисплазии, средняя степень дисплазии и высокая степень дисплазии. Для внутриэпителиальная неоплазия (Squamous Intraepithelial Neoplasia – SIN) от до 3 в зависимости от тяжести дисплазии (Barnes L. et al., 2005).

В обеих классификациях достаточно четко отображены особенности каждого этапа злокачественной трансформации эпителия СОР. Однако даже при наличии клинических и гистологических данных оценить стадию малигнизации практически бывает сложно (Явишева Т.М., Ягубов А.С., 2000;

Bouquot J. E. et al., 2006). Поэтому необходимо найти дополнительные диагностические критерии, позволяющие более точно определить степень дисплазии эпителия при лейкоплакии СОР.

Для ранней диагностики предраковых состояний в настоящее время можно использовать иммуногистохимические маркеры. К их числу относятся: маркер пролиферации клеток Ki-67, белок Р53, белки клеточной адгезии и опорные белки клеток, однако диагностические критерии экспрессии подобных белков при лейкоплакии СОР мало изучены. Наиболее часто с этой целью используются белки Ki-67 и Р53. При увеличении степени дисплазии их количество в эпителии СОР возрастает (Kushner J. et al., 1997), однако данных для диагностики вида лейкоплакии бывает не достаточно. Особое внимание следует уделить белкам клеточной адгезии в опухолевом развитии и прогрессировании (Hirohashi S., Kanai Y., 2003). Имеются данные об изменении экспрессии этих белков при ПР СОР (Thomas G.J., Speight P.M., 2001), но их значение в процессе неопластической трансформации СОР остается недостаточно изученным.

Одной из характеристик злокачественных эпителиальных опухолей СОР является инфильтрирующий рост (Takes R.P. et al., 2002), однако при лейкоплакии, как при любом хроническом процессе СОР, также отмечается инфильтрация эпителиальными тяжами подслизистой оболочки рта (Зиновьев А.С. и др., 1999; Михалева Л.М. и др., 2004), что существенно затрудняет диагностику. Изучение молекулярных механизмов этих процессов позволит более точно проводить подобную дифференциальную диагностику.

Таким образом, актуальность темы диссертации обусловлена высокой распространенностью лейкоплакии слизистой оболочки рта и сложностью диагностики различных ее видов на основании клинических и гистологических данных.

Целью настоящего исследования является поиск молекулярных критериев для дифференциальной диагностики различных видов лейкоплакии и плоскоклеточного рака СОР.

Задачи исследования.

1. Изучить особенности процессов пролиферации и апоптоза по показателям экспрессии белка Ki-67 и белка Р53.

2. Изучить особенности строения промежуточных филаментов клетки по экспрессии белка СК8.

3. Исследовать белки межклеточных плотных контактов - клаудинов 1, 2, 3, 4. Исследовать особенности экспрессии белков клеточной адгезии Екадгерина и бета-катенина.

5. Изучить распределение коллагена IV типа в базальной мембране эпителия СОР и экспрессию матриксной металлопротеиназы-9 при лейкоплакии с акантозом и при плоскоклеточном раке СОР.

6. Оценить корреляции между пролиферацией, апоптозом, экспрессией внутриклеточных промежуточных филаментов, белков плотных контактов, белков клеточной адгезии и степенью выраженности неопластической трансформации клеток.

Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное иммуногистохимическое изучение процессов пролиферации, апоптоза, экспрессии белков промежуточных филаментов, плотных контактов и клеточной адгезии при лейкоплакии и плоскоклеточном раке СОР. Показано, что основным критерием определения вида лейкоплакии СОР является соотношение распределения Ki-67 иммунопозитивных клеток в базальном и парабазальном слоях эпителия. Установлено увеличение экспрессии СК8 по мере формирования неопластических процессов в эпителии СОР. Впервые установлено, что клаудин-1 может служить критерием опухолевой трансформации эпителия, при этом показана обратная взаимосвязь между его экспрессией и пролиферативной активностью клеток при лейкоплакии и плоскоклеточном раке СОР. Выявлен механизм инфильтрирующего роста эпителия при лейкоплакии с акантозом и плоскоклеточном раке СОР.

Теоретическая и практическая значимость. В проведенном исследовании установлены особенности экспрессии белков пролиферации KiР53, СК8, белка плотных контактов клаудина-1 и белков клеточной адгезии Е-кадгерина и бета-катенина характерные для различных видов лейкоплакии и плоскоклеточного рака СОР. Определены ИГХ критерии, которые необходимо учитывать для дифференциальной диагностики между лейкоплакией и плоскоклеточным раком СОР и для определения стадии злокачественной трансформации эпителия от SIN1 к SIN3. Изучен молекулярный механизм инфильтрирующего роста в СОР при лейкоплакии с акантозом и плоскоклеточном раке.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иммуногистохимические методы позволяют провести более точную иммуногистохимических маркеров возможна также диагностика различных видов лейкоплакии СОР.

2. Основным критерием определения вида лейкоплакии СОР является соотношение распределения Ki-67 иммунопозитивных клеток в базальном и парабазальном слоях эпителия.

3. Увеличение экспрессии СК8 происходит по мере нарастания неопластических процессов в эпителии СОР, что может быть использовано для диагностики видов лейкоплакии.

4. Клаудин-1 может служить критерием опухолевой трансформации эпителия, особенности его экспрессии позволяют проводить дифференциальную диагностику между разными видами лейкоплакии 5. Значительное уменьшение экспрессии Е-кадгерина и бета-катенина на мембранах эпителиоцитов при плоскоклеточном раке СОР является критерием для дифференциальной диагностики между лейкоплакией и плоскоклеточным раком СОР.

6. Основу инфильтрирующего роста эпителиоцитов при лейкоплакии и плоскоклеточном раке СОР составляет разрушение коллагена 4 типа в базальной мембране. Расплавление базальной мембраны происходит за счет синтеза ММР-9 клетками воспаления при лейкоплакии с акантозом и анапластическими эпителиальными клетками при плоскоклеточном раке Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены и обсуждены на совместной конференции сотрудников кафедры патологической анатомии медицинского факультета Российского университета дружбы народов и врачей патологоанатомического отделения Госпиталя для ветеранов войн №2 г. Москвы (2010 г.). Результаты работы, отражающие основные положения диссертации были доложены на научных конференциях:

X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке «Инновационные технологии в биологии и медицине»» (Москва, 2009); XVII Российском национальном конгрессе «ЧЕЛОВЕК И ЛЕКАРСТВО» (Москва, 2010); VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); II Международной студенческой научной конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 – статьи в журналах, рекомендуемых ВАК Минобразования и науки РФ.

Связь диссертации с планом научных исследований. Диссертация выполнена в рамках реализации федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 гг.

Постановление Правительства Российской Федерации от 28 июля 2008г. № 568.

молекулярных изменений в клетках в процессе онкогенеза и механизмов функционирования "биологических часов" организма с целью разработки макета информационного окружения морфологических и физиологических экспериментов". Номер гос. регистрации 2009-1.1-000-080.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах и состоит из введения, главы обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных результатов, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций; библиография включает 228 работ 14 источников отечественной и 214 иностранной литературы.

Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 36 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

В работе использован операционный и архивный материал лаборатории патологической анатомии ФГУ «ЦНИИС и ЧЛХ Росмедтехнологий» за период с января 2007 по январь 2010 г (заведующий д.м.н. проф А.С. Григорьян). Были исследованы биоптаты слизистых оболочек рта 160 пациентов, в том числе женщины и 76 мужчин. Средний возраст больных составил 62 года.

Гистологическая оценка биопсийного материала была выполнена согласно двум классификациям. В соответствии с клинической классификацией А.Л.

Машкилейсона (1970). Был выявлен 61 (38%) случай простой лейкоплакии, (24%)– веррукозной лейкоплакии, 29 (18%) – эрозивно-язвенной лейкоплакии и 22 (14%) случая плоскоклеточного рака. При оценке материала по классификации ВОЗ (2005) установлены 27 (17%) случаев лейкоплакии без атипии, 37 (23%) случаев лейкоплакии SIN1, 40 (25%) случаев лейкоплакии SIN2, 24 (15%) случая лейкоплакии SIN3 и 22 (14%) случая плоскоклеточного рака.

Иммуногистохимическое исследование биопсийного материала пациентов (10 – неизмененный эпителий, 10 – лейкоплакия без атипии, 14 – лейкоплакия SIN1, 15 – лейкоплакия SIN2, 10 – лейкоплакия SIN3, 13 – плоскоклеточный рак СОР) проводилось в соответствии со стандартным протоколом.

Выявление иммунных комплексов проводили при помощи безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена (BioGenex, США).

В работе использовали следующие антитела к антигенам человека:

1. Моноклональные мышиные антитела к Ki-67 (MM1, Diagnostic Biosystems, 1:200).

2. Моноклональные мышиные антитела к Р53 (DO-7, Dako Cytomation, 3. Моноклональные мышиные антитела к цитокератину 8 (TS1, Thermoscientific, 1:100).

4. Очищенные антитела кроличьей антисыворотки к цитокератину (поликлональные, Thermoscientific, 1:100).

5. Очищенные антитела кроличьей антисыворотки к бета-катенину (поликлональные, Thermoscientific, 1:100).

6. Моноклональные антитела к Е-кадгерину (SPM471, Thermoscientific, 7. Очищенные антитела кроличьей антисыворотки к клаудину- (поликлональные, Thermoscientific, 1:200).

8. Очищенные антитела кроличьей антисыворотки к клаудину- (поликлональные, Thermoscientific, 1:1).

9. Очищенные антитела кроличьей антисыворотки к клаудину- (поликлональные, Thermoscientific, 1:100).

10. Очищенные антитела кроличьей антисыворотки к клаудину- (поликлональные, Thermoscientific, 1:1).

11. Очищенные антитела кроличьей антисыворотки к матриксной металлопротеиназе-9 (поликлональные, Thermoscientific, 1:400).

12. Моноклональные мышиные антитела к коллагену IV типа (PHM- +CIV22, Thermoscientific, 1:100).

В настоящем исследовании иммуногистохимические маркеры определяли в 400 клетках четырех рядов: первом (базальном), в котором клетки, непосредственно прилегают к базальной мембране и трех последующих рядах клеток. При оценке пролиферативной активности эпителиоцитов СОР объединяли второй и третий ряды клеток в один слой – парабазальный. При плоскоклеточном раке практически невозможно выделить клеточные ряды, поэтому исследовали 4 зоны распределения 400 клеток от базально расположенных клеток до середины толщины эпителия. Подсчет клеток производили при увеличении х400.

В качестве индикатора пролиферативной активности использован индекс пролиферации Ki-67 (ИП Ki-67), который определялся в каждом ряду клеток долей окрашенных ядер, выраженной в %. Помимо послойного ИП Ki-67, определяли индекс распределения пролиферирующих клеток Ki-67 (ИР Ki-67) в различных слоях, выраженный в %. Для этого, за 100% принималось общее количество пролиферирующих клеток во всех слоях, а ИР Ki-67 соответствовал % подобных клеток в каждом из слоев по отношению к общему количеству только пролиферирующих клеток.

Индекс иммунореактивности Р53 (ИИ Р53) вычислялся отношением числа клеток с окрашенными ядрами, содержащих продукт ДАБ-реакции, к общему числу клеток, не содержащих ДАБ, выраженному в %. Так же определяли индекс распределения иммунореактивных клеток Р53 (ИР Р53) в различных слоях, выраженный в %. За 100% принималось общее количество иммунореактивных клеток во всех слоях, а ИР Р53 соответствовал % подобных клеток в каждом из слоев по отношению к общему количеству только Р иммунореактивных клеток.

Оценку интенсивности иммуногистохимической реакции с маркерами клеточной адгезии Е-кадгерина, бета-катенина и клаудина-1 осуществляли по критерию H-score:

0 – мембранное окрашивание отсутствует, 1 – окрашивание менее 1/3 периметра мембраны, 2 – окрашивание от 1/3 до 2/3 периметра мембраны, 3 – окрашивание более 2/3 периметра мембраны.

Реакция с СК8 оценивалась по интенсивности цитоплазматического окрашивания по критерию H-score:

0 – отсутствие цитоплазматического окрашивания, 1 – слабое окрашивание цитоплазмы клетки, 2 – окрашивание цитоплазмы средней интенсивности, 3 – интенсивное окрашивание цитоплазмы.

Экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) оценивалась по наличию (1) и отсутствию (0) коричневых гранул в цитоплазме эпителиальных клеток. Выявление коллагена IV типа (Col IV) осуществлялась по распределению темнокоричневой линии в области базальной мембраны (БМ).

Положительным контролем экспрессии Col IV служило окрашивание стенок кровеносных сосудов, также содержащих коллаген IV типа.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA 6.0. Учитывая ненормальное распределение полученных статистических показателей, сравнение двух независимых групп осуществляли непараметрическим методом при помощи U-критерия МаннаУитни. В работе приведены средние значения М+s, где s-среднее квадратическое отклонение. Достоверным, считали различия средних при