На правах рукописи

ИВАНОВА Марина Викторовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ С ДЕТОНАЦИОННЫМИ

НАНОАЛМАЗНЫМИ МАТЕРИАЛАМИ И КОМПОЗИТАМИ

НА ОСНОВЕ ПОЛИАНИЛИНА

03.02.02 – вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва–2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна

Официальные оппоненты:

Маркушин Станислав Георгиевич, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией генетики РНК-содержащих вирусов ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова», РАМН Москва Кордюкова Лариса Валентиновна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела хроматографического анализа «НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова», Москва

Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации», г. Санкт -Петербург

Защита диссертации состоится «_» 2014 года в часов на заседании Диссертационного cовета Д 208.131.01 в ФГБУ «НИИ вирусологии им.

Д.И. Ивановского» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России

Автореферат разослан «» _ 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Елена Ивановна Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Циркуляция в биосфере патогенных микроорганизмов среди восприимчивых организмов (человека, млекопитающих, птиц ) определяет актуальность разработки средств и методов их дезактивации и удаления из среды. Распространение вирусных инфекций может осуществляться несколькими путями, среди которых наибольшую опасность по масштабности вовлечения в эпидпроцесс представляют воздушно-капельный и водный (Львов Д.К., 2008). Водная среда поддерживает жизнеспособность в природе энтеровирусов, вирусов гепатита А, аденовирусов, а также вирусов гриппа птиц.

Инфицирование в начале ХХI века людей и животных вирусами гриппа птиц А(H5N1), А(H7N7), А(H7N3), А(H9N2), а с 2013 года — А(H7N9) представляет риск формирования нового пандемического варианта (WER 2002, 2003, 2004, 2009, WHO 2014). Одним из примеров стало появление в апреле 2009 года вируса гриппа свиней — тройного реассортанта А(H1N1)pdm 09 вирусов гриппа птиц, свиней и человека.

Его широкое распространение среди людей вынудило ВОЗ объявить уже в июне 2009 года 6-ую фазу пандемии (WER 2009, Львов Д.К., 2009). Ежегодно в мире регистрируют от 500 до 2000 заболеваний полиомиелитом у людей, что обуславливает присутствие вакцинного штамма вируса полиомиелита Сэбина типа 1 в списке вирусов, обязательных при исследовании эффективности вирулицидного действия дезинфицирующих средств (Носик Н.Н., Носик Д.Н., 2006). Удаление биологических патогенов из водных растворов может быть осуществлено с помощью фильтров, содержащих материалы, способных адсорбировать микроорганизмы.

Состояние научной разработанности проблемы. В научной литературе приводятся данные о взаимодействии вирусов с сорбентами. В России для вирусов гриппа были предложены: силикатные пористые сорбенты, соли BaSO 4, анионообменные смолы, макропористое стекло, модифицированный графит (Железнова Н.В. и др., 1975; Закстельская Л.Я., Шендерович С.Ф., 1979; Рыбинская Л.Н. и др., 1982; Чубарова Н.И. и др., 1997; Иванова В.Т., Курочкина Я.Е. и др., 2008). Успехи нанотехнологии в открытии и синтезе наноразмерных материалов, обладающих физико-химическими свойствами, отличными от своих макроскопических аналогов (Рамбиди Н.Г., Березкин А.В., 2009), позволяют рассматривать их в качестве возможных высокоэффективных сорбентов для вирусов. Открытые в России в 60-е годы XX века детонационные наноалмазы (ДНА) и их аналоги представляют интерес для биологов за счет наличия на их поверхности радикалов, содержащих атомы неуглеродной природы (О, Н, N, S), обуславливающих способность сорбировать биологические объекты (Schrand A.M.

et al., 2009). К началу наших исследований была известна только одна работа по сорбции белков вируса ВИЧ через конковалин А на ДНА (Fujimura Т. et al., 2009).

Способность некоторых полимеров, например, полианилина (ПАНИ) сорбировать вирусы (Иванова В.Т. и др., 2009) вызвала интерес к изучению ПАНИ композитов разной формы, в том числе с включением атомов серебра (Ag), поскольку присутствие Ag открывает возможность получения материалов, как с антивирусными, так и антибактериальными свойствами, присущими Ag (Щербаков Ф.Б. и др., 2006).

Цель исследования — изучить сорбционное взаимодействие вирусов гриппа человека и птиц, полиовируса (вакцинного штамма Сэбина типа 1), бычьего сывороточного альбумина, фрагментов ДНК с современными детонационными наноалмазными материалами и их модификациями, а также с полимерными композитами полианилина различной структуры, в т.ч. содержащими серебро, и произвести оценку этого взаимодействия по качественным и количественным показателям.

Задачи исследования 1. Изучить взаимодействие эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа человека и птиц с рядом новых материалов различной природы, состоящих из микро- и наноразмерных частиц на основе: 1) углеродных материалов в виде углеродных нанотрубок, наноалмазных частиц и их производных, 2) проводящих полимеров на основе ПАНИ нанотрубок, композитов — ПАНИ нанотрубок и ПАНИ гранул, содержащих серебро.

2. Исследовать влияние ряда физических (температуры и времени воздействия) и биологических (систем культивирования и степени очистки вирусов) факторов на эффективность сорбции вирусов гриппа на детонационные наноалмазные материалы и их модификации.

3. Изучить сорбцию фрагментов ДНК на различные наноалмазные и полимерные наносорбенты.

4. Исследовать взаимодействие вируса полиомиелита на модели вакцинного штамма Сэбина типа 1 с наноалмазными и полимерными наносорбентами.

5. Оценить возможность использования выбранных сорбентов для удаления из растворов белков невирусной природы — бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулинов из иммунных сывороток.

6. Рассмотреть влияние исследуемых сорбентов на биологические объекты in vivo и in vitro.

Объект исследования. Эталонные, эпидемические, пандемические штаммы вирусов гриппа А и В, циркулировавшие в России и в мире в период с 1999 по годы; вирусы гриппа птиц с гемагглютинином Н5( реассортанты А(Н5N1) и А(Н5N2)); полиовирус вакционного штамма Сэбина тип 1, фрагменты ДНК ( полученные в результате амплификации РНК вирусов гриппа), иммуноглобулины.

Предмет исследования. Изучение взаимодействия вирусов гриппа человека, птиц, реассортантов, полиовируса, иммуноглобулинов, фрагментов ДНК с современными наноразмерными сорбентами различной природы (наноалмазные материалами и полимерными композитами) в зависимости от различных факторов:

структуры вирусов, степени их очистки и методов культивирования, времени контакта вирусов с сорбентами, температуры среды, концентрации вирусов и сорбентов. Определение репродуктивной вирусной активности клеток и состояния животных после контакта с сорбентами.

Теоретические и методологические основы исследования. В основу научно-квалификационного исследования легли вопросы вирусологии, дезинфектологии. В работе применяли общенаучные и специальные методы исследования (методы культивирования вирусов и лабораторной медицинской диагностики, молекулярно-биологические методы изучения структуры и свойств вирионов).

Информационная база исследования. В качестве информационных источников использовали научные публикации российских и зарубежных исследователей, представленных в журналах и книгах, материалы конгрессов и конференций, состоявшихся в РФ и за рубежом, методические инструкции и указания, инструкции к использованным в работе тест системам.

Основные научные результаты исследования, полученные лично автором.

Автором разработан метод удаления вирусов из водных растворов с помощью детонационных наноаламазных материалов. Проведена оценка влияния температурных, временных, количественных параметров, состава среды и антигенных свойств вирусов гриппа на сорбционное взаимодействие вирусов с изучаемыми сорбентами, проведена модификация наноалмазов (хлорирование, графитизация), изучено взаимодействие наноматериалов с вирусом полиомиелита, изучено влияние присутствия Ag в ПАНИ нанотрубках на сорбцию вирусов гриппа, полиомиелита, фрагментов ДНК. Проведена иммунизация животных, рассмотрено влияние исследуемых наноматериалов на культуру клеток тканей МDСК и гемопоэз лабраторных животных. Впервые установлена способность детонационных наноматериалов и их модификаций, композитов ПАНИнанотрубок и гранул, содержащих Ag и без него, сорбировать вирусы гриппа А и В из растворов (физиологического раствора, раствора культуральной питательный среды Игла МЕМ, аллантоисной жидкости куриных эмбрионов), фрагменты ДНК из ФР.

Впервые выявлена способность детонационных наноматериалов, ПАНИ нанотрубок и гранул, содержащих и не содержащих Ag, сорбировать полиовирус из раствора культуральной питательной среды Игла МЕМ.

Впервые установлено, что введение частиц Ag в структуру ПАНИ нанотрубок и гранул повышает их адсорбционную способность относительно вирусов гриппа А и В, фрагментов ДНК, полиовируса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вирусы гриппа и фрагменты ДНК ( полученные в результате амплификации участков РНК вируса гриппа) активно сорбируются из растворов на ДНА содержащие наноматериалы.

2. Параметры эксперимента – температура и время взаимодействия не оказывают влияния (после 15 минут контакта) на эффективность взаимодействия вирусов гриппа с исследуемыми наноматериалами.

3. Вирусы гриппа и фрагменты ДНК способны сорбироваться из растворов на полианилиновые нанотрубки, содержащие серебро и без серебра. Присутствие серебра увеличивает сорбционное взаимодействие.

4. Вирус полиомиелита (вакцинный штамм Сэбина тип 1) способен сорбироваться из растворов на наноматериалы на основе полианилиновых нанотрубок с серебром и без него, а также на модифицированные наноалмазы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты по изучению взаимодействия вирусов гриппа А и В, фрагментов ДНК, полученных при амплификации РНК вирусов гриппа, с детонационными наноматериалами (шихтой, наноалмазами и их аналогами с модифицированной поверхностью составили предмет заявки: ” Сорбенты - наноалмазсодержащие материалы, полученные в результате детонационного синтеза и модифицированные с помощью химических реагентов; способ получения иммуносорбента на его основе; способ иммобилизации специфических антител” на изобретение № 2013117675 от 17.04.2013г. Изложенный в заявке метод может быть рекомендован для деконтаминации растворов, содержащих вирусы гриппа А и В, в том числе пандемических штаммов А(H1N1)pdm09, вирусов гриппа птиц из водных резервуаров в среде их обитания, фрагментов ДНК. Важно отметить, что ДНА материалы способны удалять из растворов вирус полиомиелита (вакцинный штамм Сэбина тип 1), внесенный в список вирусов обязательных для исследования антивирусных дезинфекционных средств (Носик Н.Н., Носик Д.Н., 2006).

Расширен спектр адсорбционных свойств ПАНИ материалов при добавлении в их состав серебра. Наряду с ранее установленными антибактериальным свойствами Ag содержащих материалов данные композиты обладают антивирусной активностью и могут использоваться как материал для водных фильтров, обладающими как антивирусным, так и антибактериальным действием, имеющим практическое применение в медицине и быту.

представлены на международных симпозиумах, конференциях и выставках: VII Московском международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития», 21-25 марта 2011; German-Russian Young Researchers Workshop on “Methods to study Influenza virus”, Berlin Germany 20–23.-09. 2011;

IV Nanotechnology International Forum, Rusnanotech 26–28 октября 2011; 6th Nanosmat conference, Krakov, Poland, 17-20th October 2011; XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии 25–30 сентября 2011года, Волгоград; IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 26- марта 2012 г.; The Materials Research Society (MRS) Spring Meeting, Materials Research Society. Symp. 2012 April 9-13, San Francisco, California, USA;

Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», Москва 20–22 марта 2012 г.; Юбилейной Всероссийской научной конференции “Отечественная эпидемиология в XXI веке:

приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека’’ Санкт-Петербург”. 19–20 апреля, 2012;

Conference “Colloids and Nanomedicine 2012” 15–17 July 2012 г., Amsterdam,The Netherlands; International conference “Options for the Control of Influenza VIII”. Cape Town, South Africa, 5–10 September 2013; 8-м Международном симпозиуме «Молекулярный Порядок и Подвижность в Полимерных Системах», 2–6 июня г., Санкт-Петербург, XII “International Conference on Nanostructured Materials”, Moscow, 13–18 July, 2014; на XII международной специализированной выставке «Мир биотехнологии – 2014», Москва, 2014 г., работа была отмечена дипломом и медалью.

опубликовано 20 научных работ, в том числе 4 статьи в реферируемых и рекомендованных ВАК российских научных журналах, 2 статьи в американском и английском журналах, также 12 публикаций по материалам докладов в сборниках российских и международных конгрессов, и конференций. Оформлена 1 заявка на изобретение № 2013117675 от 17.04. 2013 РФ.

Структура и содержание диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 4 глав собственных исследований, их обсуждения и выводов. Список литературы включает 85 отечественных и 104 зарубежных источников. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включая 24 таблицы и 26 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы и методы исследования Вирусы. Использовано 15 эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа типов А(Н1N1), (Н3N2) и В двух эволюционных линий В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88- подобных, циркулировавших в России и в мире в период с по 2013г.; и в том числе пандемические штаммы А(Н1N1)pdm 09. Вирусы получены из Государственной коллекции вирусов, из коллекции вирусов ЦЭЭГ, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ, а также из справочных центров ВОЗ;

реассортанты вирусов гриппа А(H5N1), А(H5N2) любезно предоставлены сотрудниками лаборатории физиологии ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.

Ивановского МЗ РФ ( заведующий лабораторией д.м.н., проф. Каверин НВ); вирус полиомиелита — сотрудниками лаборатории онтогенеза ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ ( заведующий лабораторий д.м.н. проф. Носик Н.Н.) Клеточные линии: клетки культуры ткани MDCK предоставлены Международным центром по гриппу, сотрудничающим с ВОЗ, Центров по контролю за заболеваемостью и профилактике (CDC&P) г. Атланта, США. Клетки культуры ткани Vero получена из коллекции клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ.

развивающихся куриных эмбрионах (КЭ) и на клетках культуры ткани MDCK по методу (Davies H.W. et al., 1978г.; Бурцева Е.И., 2002).

Гемагглютинирующую активность вирусов гриппа определяли в реакции гемагглютинации (РГА) по общепринятой методике, рекомендованной ВОЗ, с использованием 0,75% взвеси эритроцитов 0(I) группы крови человека.

Определение инфекционного титра вирусов гриппа проводили на 9– дневных эмбрионах и клетках культуры ткани MDCK, используя 10 кратные разведения в ФР вируссодержащей жидкости до и после взаимодействия с сорбентом. Расчет инфекционных титров проводили по методу Рида и Менча.

Концентрированные и очищенные препараты вирусов гриппа получали дифференциальным центрифугированием в ультрацентрифуге фирмы Бекман L5v=25000 об./мин., t=1час.

Культивирование вируса полиомиелита (вакцинный штамм Сэбина тип 1) проводили в культуре клеток Vero при 34оС в течение 48-72 часов. Для индикации вируса в растворе использовали титрование его в 96 луночных панелях, содержащих клетки Vero и выявление по полному цитопатическому действию.

Электрофорез белков до и после сорбции на сорбенты проводили в 12% ПААГе в по методу Laemmli U.K. (1976).

Определение антител в иммунных сыворотках до и после их контакта с сорбентами и их комплексам с вирусами гриппа проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) согласно ВОЗ.

Ампликоны — фрагменты ДНК, полученные при амплификации РНК вирусов гриппа Аи В в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тестсистемы «ДНК технология».

Электрофорез фрагментов ДНК до и после сорбции на сорбенты проводили в 2% агарозном геле (Остерман Л.А.,1981).

Изменения в клетках культуры ткани МDСК in vitro после внесения кратных разведений суспензий сорбентов определяли по состоянию монослоя с помощью микроскопа и по ГА активности вируса гриппа в лунках микропанели в РГА.

Влияние сорбентов на гемопоэз изучали на лабораторных животных —белых крысах. Препарат вводили трижды внутрибрюшинно по 3 мг/ животное с интервалом три недели. Формулу крови до и после введения препаратов животным определяли используя атлас клеток (Козинц Г.И. 1998).

Электронную микроскопию выполняли совместно с д.б.н., проф. Маныкиным А.А. (НИИ вирусологии МЗ РФ) и к.х.н., ст.н.с. Сапуриной И.Ю. (Институт высокомолекулярных соединений РАН, СПб), Статистическую обработку результатов проводили стандартным методом Стьюдента, который включал вычисление средних квадратичных отклонений согласно Белякову В.Д. и др. (1981).

Сорбенты. Всего в работе было исследовано 17 сорбентов, детонационные наноалмазсодержащие материал: шихта и модифицированые наноалмазы (ДНА), и композиты ДНА с (ПАНИ), получены от предприятия «Синта» (Минск, Беларусь), модифицированы в Институте физической химии и электрохимии им. А.Н.

Фрумкина РАН, Москва, д.х.н. Спицыным Б.В., углеродные нанотрубки (УНТ) из фирмы «Таунит», г. Тамбов; органические — ПАНИ композиты с содержанием Ag и без него приготовлены в Институте высокомолекулярных соединений РАН, СПб — в.н.с., к.х.н. Сапуриной И. Ю.

Взаимодействие вирусов гриппа и фрагментов ДНК с наноалмазными и полимерными материалами Факторами, обусловливающими выбор наноразмерных материалов и композитов на их основе, были их размеры, структура (углеродсодержащие и полимерные материалы), структура поверхностного слоя адсорбентов, форма, включение ионов металла. Из результатов электронно-микроскопического анализа сорбентов, представленных на рис. 1, следует, что в водной суспензии ДНА и шихта представляют набор различной формы агрегатов — кластеров в размере от 10 до 300 нм. Их поверхность имеет вид зернистой структуры. Композиты ДНА с ПАНИ, нанотрубки ПАНИ имеют форму хаотично переплетенных толстых гладких нитей с разным диаметром, нанотрубки ПАНИ с 30%Ag имеют шероховатую поверхность, композиты ПАНИ с 70%Ag находятся в гранулярной форме с варьируемыми размерами диаметра от 50 и до 100 нм.

Рис. 1. Электронная микроскопия: а) наноалмазов, б) шихты, в) композитов ПАНИ с ДНА, ПАНИ нанотрубок без Ag (г) и с Ag (д), е) ПАНИ гранул с Ag Результаты адсорбционной активности представителей оболочечных вирусов- вирусов гриппа А и В с вышеуказанными материалами представлены в табл. 1, 2, 3. Анализ полученных данных показывает, что после контакта с сорбентами регистрировали уменьшение ГА титра от 8 и до 2000 раз. Сорбционную активность наблюдали у вирусов гриппа с разными подтипами HA и NA, то есть она не зависела от антигенной формулы вирусов.

Взаимодействие вирусов гриппа А и В с ДНА содержащими сорбентами при 22 °С A/Новая Каледония/20/99 (Н1N1) очищ,конц.