На правах рукописи

АБРАМОЧКИН ДЕНИС ВАЛЕРЬЕВИЧ

МИГРАЦИЯ ВОДИТЕЛЯ РИТМА В

СИНОАТРИАЛЬНОМ УЗЛЕ И ЕЕ МЕХАНИЗМЫ

03.00.13 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета Московского Государственного Университета им.М.В.Ломоносова (заведующий – д.б.н., профессор А.А.Каменский), в лаборатории электрофизиологии сердца Института Экспериментальной Кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий (заведующий – академик РАН и РАМН Л.В.Розенштраух), на Беломорской Биологической Станции им.

Н.А.Перцова МГУ (директор – д.б.н., профессор А.Б.Цетлин).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Галина Сергеевна Сухова

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор биологических наук, академик РАН, заведующий лабораторией электрофизиологии сердца НИИЭК ФГУ РКНПК Росмедтехнологий Леонид Валентинович Розенштраух

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины МГУ им.М.В.Ломоносова Владимир Борисович Кошелев;

доктор биологических наук, профессор кафедры нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета Разина Рамазановна Нигматуллина

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет Росздрава

Защита состоится _26_ октября 2009 года в 15ч 30мин на заседании диссертационного ученого совета Д 501.000.93 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991 Москва Ленинские горы, д.1. корп.12, биологический факультет, ауд.М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова

Автореферат разослан 26 сентября 2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Б.А.Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Проблема автоматии сердца является одной из наиболее актуальных для современной физиологии. В настоящее время все больше внимания уделяется вопросам генерации и регуляции сердечного ритма, что связано с возрастающим клиническим значением нарушений ритма, связанных с патологическими изменениями функционирования пейсмекера сердца.

Принято считать, что частота разрядов САУ, который выполняет функцию первичного водителя ритма в сердце млекопитающих, регулируется за счет изменения максимального диастолического потенциала и крутизны медленной диастолической деполяризации в клетках САУ. Однако, еще Гоффман и Крейнфилд предположили в 1960 году, что в правом предсердии существует несколько потенциальных центров автоматии, обладающих разной автоматической способностью, и переключение функции ведущего пейсмекера между этими центрами может служить дополнительным способом изменения сердечного ритма (Hoffman, Cranefield, 1960). Позднее, с развитием техники картирования, было выяснено, что эти центры автоматии могут находиться в пределах САУ (Mackaay et al., 1980a). Было высказано предположение, что передача функции ведущего водителя ритма между центрами внутри САУ обеспечивает изменения ритма в более широком диапазоне, чем вариация крутизны диастолической деполяризации. До недавнего времени этот вопрос был слабо изучен в связи с отсутствием методики, позволяющей непрерывно регистрировать последовательность активации САУ.

В данной работе мы исследуем явление миграции водителя ритма в САУ млекопитающего и его механизмы на примере сердца кролика. Под миграцией водителя ритма мы понимаем временное изменение местоположения точки ранней активации САУ, то есть точки, в которой происходит первичная генерация возбуждения. Другими словами, миграция водителя ритма подразумевает передачу функции ведущего пейсмекера от одной группы клеток в пределах САУ к другой. Известно, что миграция может происходить при различных воздействиях: холинергических, адренергических, изменении температуры и др. (Opthof, 1987). Для изучения этого феномена необходим метод, позволяющий непрерывно регистрировать электрическую активность во всех точках САУ и в результате анализа этих данных получать картину распространения возбуждения в САУ. Такую возможность дает метод высокоразрешающего оптического картирования - наиболее современная техника, применяемая для изучения распространения возбуждения в сердце.

Непрерывная регистрация изменений последовательности активации САУ, происходящих под действием холинергических, адренергических и других факторов, может помочь сопоставить миграцию пейсмекера с изменениями синусного ритма и таким образом, развить представления о роли миграции пейсмекера в регуляции синусного ритма.

В настоящее время механизмы миграции пейсмекера в САУ не ясны.

Тем не менее, результаты исследований механизмов холинергических эффектов в САУ кролика, проведенных с помощью внутриклеточной регистрации электрической активности (Виноградова и др., 1996, 1997, Vinogradova et al., 1998), позволяют предполагать, что АЦХ вызывает подавление электрической активности в центральной части САУ. Это явление названо холинергической невозбудимостью. Впервые феномен холинергической невозбудимости был обнаружен в предсердиях амфибий (Розенштраух и др., 1970). Можно предположить, что появление невозбудимой зоны на месте исходного расположения точки ранней активации САУ неизбежно приведет к миграции пейсмекера. Эта гипотеза относительно возможного механизма миграции водителя ритма при холинергических воздействиях нуждается в проверке с помощью оптического картирования.

Поскольку явление холинергической невозбудимости представляется важным для регуляции синусного ритма у теплокровных, представляется важным его изучение в сравнительно-физиологическом аспекте. Механизмы явления холинергической невозбудимости в настоящее время не выяснены и представляют особый интерес. При этом в качестве модели для изучения механизмов невозбудимости подходит не только САУ млекопитающего, но и предсердия низших позвоночных (Розенштраух и др., 1975).

Таким образом, исследование феномена миграции водителя ритма в САУ млекопитающих с помощью современного метода оптического картирования, роли миграции в осуществлении регуляции синусного ритма, а также раскрытие механизмов явления холинергической невозбудимости, необходимо для выяснения механизмов регуляции автоматической активности сердца.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследование феномена миграции водителя ритма САУ кролика при холинергических, адренергических и других воздействиях, а также явления холинергической невозбудимости в САУ кролика и предсердиях низших позвоночных.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:

1. Изучить изменения последовательности активации САУ кролика при действии стимуляции интрамуральных парасимпатических нервов, экзогенного АЦХ, а также эндогенного АЦХ, накапливающегося в препарате при ингибировании ацетилхолинэстеразы.

2. Исследовать изменения последовательности активации САУ при адренергических воздействиях: стимуляции интрамуральных симпатических нервов и -агониста изопротеренола.

3. Исследовать изменения хронотопографии возбуждения САУ при избирательном воздействии на крутизну МДД, достигаемом за счет блокады тока If.

4. Установить корреляцию между степенью изменения синусного ритма и миграцией пейсмекера.

5. Исследовать феномен холинергической невозбудимости, как один из вероятных механизмов миграции пейсмекера, в САУ кролика, а также в модельных экспериментах на предсердиях низших позвоночных.

6. Проверить гипотезу, согласно которой холинергическая невозбудимость обусловлена активацией калиевого ацетилхолинзависимого тока IKACh.

Научная новизна исследования.

Впервые определена корреляция между величиной изменения синусного ритма и миграцией пейсмекера в САУ при холинергических и адренергических воздействиях, а также при блокаде тока If. Показано, что лишь небольшое изменение ритма (до 10-12% от исходной длительности цикла) происходит в отсутствие миграции, большее изменение всегда сопровождается миграцией и может быть связано с ней.

Впервые показано, что экзогенный и эндогенный АЦХ вызывает образование невозбудимой области в пределах САУ кролика на том месте, где в норме располагается ведущий водитель ритма. Поэтому холинергическая невозбудимость может служить одним из механизмов возникновения миграции пейсмекера в САУ.

Впервые явление холинергической невозбудимости обнаружено в предсердном миокарде рыб. Впервые показано, что в развитии холинергической невозбудимости в САУ кролика и в предсердиях рыб и амфибий ключевую роль играет активация под действием АЦХ калиевого ацетилхолинзависимого тока IKACh.

Научное и практическое значение работы.

Полученные данные существенно расширяют наши представления о функциональной организации водителя ритма сердца, о явлении холинергической невозбудимости и его механизмах. Поскольку ранее в ряде работ предполагалась важная роль холинергической невозбудимости в развитии предсердных аритмий у амфибий (Розенштраух и др., 1975) и млекопитающих (Виноградова и др., 1997), подробное исследование этого феномена и раскрытие его механизмов должно внести существенный вклад в понимание мханизмов возникновения предсердных аритмий, являющихся одной из важных проблем современной кардиологии.

Положения, выносимые на защиту 1. Холинергические и адренергические воздействия, а также избирательная блокада тока If могут вызывать миграцию водителя ритма в пределах САУ кролика.

2. Существует корреляция между степенью изменения синусного ритма и наличием миграции водителя ритма. Малые изменения ритма не сопровождаются миграцией.

3. АЦХ может вызывать появление невозбудимой зоны в центральной части САУ кролика, что неизбежно приводит к миграции водителя ритма.

Таким образом, холинергическая невозбудимость является одним из механизмов миграции пейсмекера.

4. АЦХ может вызывать возникновение невозбудимых зон в предсердиях лягушки, карпа и трески.

5. Одним из механизмов развития холинергической невозбудимости является активация под действием АЦХ калиевого ацетилхолинзависимого тока IKACh.

Апробация диссертации.

Материалы работы были представлены на II Конгрессе Сербского физиологического общества с международным участием (Крагуевац, Сербия, 2009), XXXV Международном Электрокардиологическом Конгрессе (СанктПетербург, 2008), Съезде Скандинавского физиологического общества (Оулу, Финляндия, 2008), Конференции, посвященной 70-летию ББС МГУ (ББС МГУ, 2008), Международных научных конференциях «Ломоносов-2007» и «Ломоносов-2008» (Москва, 2007, 2008), IV школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2008), I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008), V Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007) и других научных конференциях. Диссертационная работа апробирована на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова 14 сентября 2009 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 статей, из которых 11 - в журналах, рекомендованных ВАК, а также 13 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, объектов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 158 листах, содержит 42 рисунка.

Список литературы включает 315 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Все эксперименты на САУ кролика, а также все эксперименты с оптическим картированием проводились на базе лаборатории электрофизиологии сердца ИЭК ФГУ РКНПК Росмедтехнологий.

Эксперименты на треске проводились на базе Беломорской биологической станции им. Н.А.Перцова МГУ им. М.В.Ломоносова, остальные эксперименты – на базе кафедры физиологии человека и животных МГУ.

В работе было использовано 65 кроликов (Oryctolagus cuniculus), лягушек (Rana temporaria), 20 особей трески (Gadus morhua marisalbi), карпов (Cyprinus carpio), 7 прытких ящериц (Lacerta agilis) и 2 обыкновенных ужа (Natrix natrix). Кроликов усыпляли внутривенной инъекцией уретана (1, г/кг), лягушек перед началом препаровки обездвиживали, прочих животных декапитировали.

Все эксперименты проводились на изолированных препаратах миокарда, для перфузии использовали физиологические растворы следующего состава (ммоль/л): кролик - NaCl 130, KCl 4, NaH2PO4•2H2O 1,1, NaHCO3 24, MgCl2 1, CaCl2•2H2O 1,8, глюкоза 5,6; лягушка - NaCl 111, KCl 1,9, NaHCO3 2,4, CaCl2•2H2O 1,7; треска - NaCl 150, KCl 5,14, NaH2PO4•2H2O 1, NaHCO3 25, MgSO4•7H2O 1,8, CaCl2•2H2O 1,25, глюкоза 5 (Hoglund et al., 1987); карп NaCl 127, KCl 5,1, NaHCO3 12, MgSO4•7H2O 0,93, CaCl2•2H2O 1,6, глюкоза 5,55 (Coyne et al., 2000); ящерица и уж - NaCl 110, KCl 4, NaH2PO4•2H2O 2,7, NaHCO3 23,8, MgSO4•7H2O 1,3, CaCl2•2H2O 2, глюкоза 10 (Franklin et al., 1994). Все растворы насыщали карбогеном (95% O2 - 5% CO2), рН составлял 7,2-7,6. Температуру раствора в перфузионной камере поддерживали с помощью термостата с функцией охлаждения, для препаратов миокарда кролика она составляла 37С, для трески - 10С, для прочих животных - 20С.

Скорость протока раствора равнялась 3 объемам камеры в минуту.

Для изучения миграции водителя ритма в САУ кролика выделяли препарат миокарда правого предсердия, включающий межвенную область и пограничный гребешок. Для изучения феномена невозбудимости в миокарде низших позвоночных выделяли препарат предсердного миокарда. В случае лягушки он состоял из обоих вскрытых предсердий и работал в навязанном ритме (0,5 Гц), у рыб препарат включал синоатриальный клапан, в котором расположен пейсмекер, в части экспериментов на треске клапан удаляли и стимулировали препарат с частотой 1 Гц, у рептилий препарат включал оба предсердия, венозный синус и работал в собственном ритме. Все препараты закрепляли в камере эндокардиальной стороной вверх.

1. Внутриклеточная регистрация биоэлектрической активности ПД регистрировали с помощью стандартной микроэлектродной методики, использовали стеклянные микроэлектроды с сопротивлением 10- М, заполненные 3М раствором KCl. Микроэлектроды подключались к усилителю KS-700 (WPInstruments, США) (на базе ИЭК) или к усилителю конструкции ведущего инженера кафедры физиологии человека и животных Л.И.Чудакова (на базе МГУ). Сигнал с усилителя подавался на осциллограф 5103N (Tektronix, США) (на базе ИЭК) или С-1-68 (на базе МГУ) для обеспечения визуального контроля, а также на АЦП E14-140 (L-card, Россия), подключенный к ноутбуку. Регистрация проводилась в программе L-graph 1. (L-card, Россия), а обработка – в программе MiniAnalysis 3.0.1 (Synaptosoft, США). В ходе обработки ПД САУ измеряли длительность цикла (расстояние между пиковыми точками двух последовательных ПД), длительность ПД на уровне 50% реполяризации (ДПД50), амплитуду ПД. При обработке ПД предсердного миокарда измеряли длительность цикла, длительность ПД на уровне 50% и 90% реполяризации (ДПД90), амплитуду ПД, в ряде случаев – скорость нарастания переднего фронта ПД (максимальное значение dV/dt).

2. Оптическое картирование миокарда Высокоскоростное высокоразрешающее оптическое картирование использовали для изучения хронотопографии возбуждения в САУ кролика.

Метод основан на применении потенциал-чувствительного красителя di-4ANNEPS. Молекула красителя имеет в своем составе несколько липо- и гидрофильных групп, при этом они располагаются на противоположных концах молекулы. Благодаря наличию липофильных углеводородных звеньев молекула встраивается в мембрану кардиомиоцитов (Ефимов и др., 2000), а гидрофильная отрицательно заряженная сульфонильная группа ориентирует молекулу в водном экстраклеточном пространстве. При облучении молекул красителя светом определенной длины волны (в нашем случае - 530+/-20 нм) они переходят из основного квантового состояния в нестабильное состояние с более высокой энергией. Затем молекулы спонтанно переходят обратно на промежуточный, более низкий энергетический уровень с выделением энергии в виде фотона более низкой энергии, чем возбуждающий фотон, при этом излучаемый свет имеет длину волны 710+/-50 нм. Регистрируемый флуоресцентный сигнал приближается по своей конфигурации к ПД, зарегистрированному с помощью микроэлектродов.

В использованной нами установке флуоресцентное излучение регистрировалось с помощью фоторегистрирующего блока на основе фотодиодной матрицы в составе комплекса H469V-012(WuTech Instruments, США). При этом препарат облучался возбуждающим светом с помощью сверхярких светодиодов с длиной волны 520 нм. Матрица состоит из фотодиодов. Перед световым входом фотодиодной матрицы располагается светофильтр (нижняя граница пропускания – 610 нм), благодаря которому регистрируется только флуоресцентное излучение. Сигналы от всех фотодиодов поступали на АЦП комплекса H469V-012 (WuTech Instruments, США), в оцифрованном виде они регистрировались и обрабатывались в программе Сardioplex v.8.2.1 (RedShirtImaging, США), которая генерировала анимированную картину распространения возбуждения в препарате, использовавшуюся в дальнейшем для построения изохронных карт активации препарата. Частота регистрации кадров с помощью фотодиодной матрицы составляла 1,6 кадра/мс.

После 40-50 минут адаптации препарат прокрашивали красителем di-4ANNEPS (5 мкМ) в течение 5-10 минут. После этого в течение около 1-1, часов можно было стабильно регистрировать оптический сигнал от препарата.

Эксперименты проводили в присутствие разобщителя электромеханического сопряжения бутандион моноксима (1,5 мМ) для устранения артефакта от сокращения препарата. В экспериментах на САУ кролика параллельно с записью оптического сигнала проводили биполярную регистрацию электрограммы пограничного гребешка с помощью дифференциального усилителя DL-304 (Нейробиолаб, Россия).

3. Методика стимуляции интрамуральных нервов Стимуляцию интрамуральных нервов осуществляли с помощью методики, описанной Винченци и Вестом (Vincenzi et al., 1963). Два стимулирующих электрода диаметром около 0,5 мм с расстоянием 2-3 мм между собой располагались непосредственно на эндокардиальной поверхности верхней области САУ. Стимуляцию нервов производили с помощью линейного изолятора стимула DL-360 (Нейробиолаб, Россия), управляемого программой Digiscope (Нейробиолаб, Россия) короткими (25мс) сериями импульсов (длительность импульса – 80 мкс, частота – Гц, амплитуда – от 5 до 15 В). За счет маленькой длительности эти стимулы не возбуждают миокардиальные компоненты препарата, зато их достаточно для активации постганглионарных нервов (Vincenzi et al., 1963). При этом активируются и парасимпатические и симпатические волокна. Для изучения эффекта раздражения парасимпатических волокон симпатические влияния блокировали пропранололом (1 мкМ), использование этого вещества допустимо, поскольку симпатические эффекты в САУ опосредованы именно -адренорецепторами. Стимуляцию в присутствии пропранолола мы будем называть парасимпатической нервной стимуляцией (ПНС). Стимуляцию нервов в присутствие атропина (1 мкМ) мы будем называть симпатической нервной стимуляцией (СНС).

Ацетилхолин, изопротеренол, пропранолол, атропин, бутандион моноксим, уретан, хлорид бария были заказаны в компании Sigma (США), блокатор каналов тока If ивабрадин – в Servier (Франция), краситель di-4ANNEPS – Molecular Probes (США).

5. Статистическая обработка результатов Достоверность различий между количественными параметрами в контроле и при действии того или иного вещества выявлялась с помощью