1

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НИИ НОРМАЛЬНОЙ ФИЗИОЛОГИИ ИМ. П.К. АНОХИНА РАМН

На правах рукописи

УДК 612.822.3+612.821.6

Солнцева

Светлана Вячеславовна

НЕЙРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И

НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ

КОНСОЛИДАЦИИ И РЕКОНСОЛИДАЦИИ

АССОЦИАТИВНОГО АВЕРСИВНОГО НАВЫКА НА

ПИЩУ У ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

03.03.01 – физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА –

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина в лаборатории функциональной нейрохимии (заведующий - доктор медицинских наук, профессор Владимир Вячеславович Шерстнев)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Владимир Павлович Никитин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Юрий Александрович Фадеев Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М. Сеченова доктор биологических наук Игорь Сергеевич Захаров Институт Биологии Развития им. Н.К.Кольцова РАН

Ведущая организация:

Биологический Факультет Московского Государственного Университета им.

М.В.Ломоносова

Защита состоится «10» ноября 2010 г. в 11 ч. на заседании Диссертационного Ученого Совета Д 001.008.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН Адрес: 125009, Москва, ул.Моховая, д.11, стр.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ НФ РАМН Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат медицинских наук В. А. Гуменюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Длительное время считалось, что сформировавшаяся долговременная память чрезвычайно устойчива к разнообразным воздействиям. Взгляд на обсуждаемую проблему стал меняться, когда были получены данные, свидетельствующие о возможности экспериментального нарушения памяти спустя значительный период времени после обучения. Было обнаружено, что после завершения периода консолидации долговременной памяти короткое предъявление животному одного из компонентов ситуации обучения может возвращать ее в состояние транзиторной пластичности, в котором она может быть модифицирована, изменена и даже стерта различными химическими или физическими воздействиями. (Misanin J.R., et al., 1968;

Lewis D.J., Bregman N.J., 1973; Nader K., 2003, 2007; Sara S.J., et al., 2000, 2006; Dudai Y., 2004;

Tronson C., et al., 2007). Процедура предъявления компонента обучения получила название «напоминание», а последующий процесс возврата долговременной памяти в лабильное состояние – реактивации и последующей реконсолидации памяти. Без процедуры напоминания реконсолидации памяти не происходило. Полагают, что реконсолидация служит в качестве адаптивного процесса, который позволяет к существующей памяти быстро добавлять новую информацию и ослаблять или усиливать определенные компоненты памяти (Sara S.J., 2000; Lee J.L., 2009).

В исследованиях, проведенных на различных видах животных, в том числе на моллюсках, с использованием разных форм обучения описан ряд особенностей динамики реконсолидации памяти, изучены некоторые поведенческие и нейрохимические механизмы, лежащие в основе этого процесса (Anokhin K.V., et al., 2002; Dudai Y., 2004; Sara S.J., 2006; Nader K., 2007). Выявлено, что реконсолидация памяти зависит от регуляторных внутриклеточных процессов (Izquierdo I., et al., 2002; Kelly A., et al., 2003); генетического аппарата нейронов (Bozon B., et al., 2003; Taubenfeld S.M., 2001; Da Silva W.C., et al., 2008); активности нейромедиаторных механизмов, и в частности, глутаматергической и моноаминоергической систем. Так, обнаружено, что рецепторы глутамата и моноаминов вовлечены в механизмы как консолидации так и реконсолидации различных видов памяти, в том числе и аверсивной вкусовой памяти (Pedreira M.E., et al., 2003; Summer M.J., et al., 2003; Suzuki A., et al., 2004; Cui Z., et al., 2005; Torras-Garcia M., et al., 2005; Akirav I., et al., 2006;

Fellini L., et al., 2009). Обращено внимание как на сходство некоторых механизмов реконсолидации памяти с механизмами ее первичной консолидации, так и на существенное различие этих процессов (Taubenfeld S.M., et al., 2001; Cammarota M., et al., 2004; Salinska E., et al., 2004; Tronel S., et al., 2005; Milekic M.H., et al., 2007).

Принципиально важным аспектом обсуждаемой проблемы является вопрос о механизмах амнезии, возникающей при нарушении реконсолидации памяти. В настоящее время не сложилось единого мнения о процессах забывания. Некоторые авторы полагают, что отсутствие поведенческого проявления навыка после обучения может быть следствием нарушения процессов воспроизведения и сохранная память перманентно или временно недоступна (Anokhin K.V., et al., 2002; Summer M.J., et al., 2003). Вторая возможная причина потери памяти заключается в том, что нарушение экспрессии памяти может отражать, скорее, ее отсутствие, чем недоступность (Nader K., et al., 2006).

Другими важными, однако, недостаточно исследованными проблемами реконсолидации следа памяти являются вопросы, касающиеся сходства и различия механизмов консолидации и реконсолидации определенных навыков, особенностей взаимоотношения сигнальной и обстановочной афферентации в процессе индукции реконсолидации, роли различных нейромедиаторных систем в механизмах реконсолидации. Практически не исследована динамика развития амнезии, возникающей при нарушении реконсолидации следа памяти.

Настоящая работа направлена на изучение этих принципиально важных вопросов обсуждаемой проблемы.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение нейрофизиологических и нейрохимических механизмов консолидации и реконсолидации долговременного навыка отвергания определенного вида пищи у виноградной улитки. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить зависимость реконсолидации долговременной ассоциативной памяти на пищу от выраженности и длительности подавления процессов трансляции.

2. Исследовать особенности участия рецепторов NMDA глутамата и рецепторов серотонина в механизмах реконсолидации аверсивного навыка на пищу.

3. Изучить роль активации синтеза белковых молекул, а также рецепторов NMDA глутамата и рецепторов серотонина в механизмах консолидации ассоциативного навыка отвергания определенного вида пищи у улиток.

4. Исследовать роль обстановочной афферентации в механизмах реконсолидации аверсивного навыка на пищу у виноградных улиток.

5. Исследовать динамику развития амнезии, вызванной нарушением реконсолидации памяти антагонистами рецепторов нейромедиаторов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Амнезия, возникающая при нарушении реконсолидации аверсивного навыка на пищу, является развивающимся во времени процессом, который характеризуется возможностью восстановления памяти при повторном обучении на ранней стадии (до 10 дней) и отсутствием чувствительности к повторному обучению на поздней стадии амнезии.

2. При одной и той же форме ассоциативного обучения – отвергания улитками определенного вида пищи – различные нейромедиаторные рецепторы играют специфическую роль в механизмах реконсолидации памяти и развития амнезии. Ингибирование рецепторов NMDA глутамата приводило к развитию необратимой амнезии, тогда как ингибирование рецепторов серотонина вызывало амнезию, обратимую при повторном обучении.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые обнаружено, что у улиток, обученных отверганию определенного вида пищи, нарушение реконсолидации долговременной памяти ингибиторами синтеза белка или антагонистами рецепторов нейромедиаторов приводит к развитию амнезии, сохраняющейся не менее 60 дней.

Впервые установлено, что амнезия, инициируемая нарушением реконсолидации долговременной памяти, является развивающимся во времени процессом, включающим две стадии.

Ранняя стадия, продолжительностью менее 10 дней, характеризовалась возможностью восстановления памяти при повторном обучении отвергания того же вида пищи, что и при первоначальном обучении. Поздняя стадия амнезии, продолжительностью 10 дней и более, характеризовалась утратой способности животных к восстановлению памяти при повтором обучении.

Получены результаты, свидетельствующие о специфичности вовлечения нейромедиаторных механизмов в процессы реконсолидации долговременной памяти. При одном и том же виде обучения нарушение реконсолидации памяти антагонистами рецепторов NMDA глутамата приводило к развитию амнезии нечувствительной к повторному обучению, тогда как реконсолидация памяти во время действия антагониста рецепторов серотонина вызывала амнезию, обратимую повторным обучением.

Выявлены особенности молекулярных механизмов консолидации и реконсолидации следа памяти. Обнаружено, что нарушение синтеза белка как во время консолидации, так и реконсолидации долговременной памяти приводило к развитию необратимой амнезии, а антагонисты рецепторов серотонина в обоих случаях индуцировали амнезию, обратимую повторным обучением. Первичная выработка ассоциативного навыка отвергания пищи в условиях действия антагонистов рецепторов NMDA вызывала развитие обратимой амнезии, тогда как реконсолидация памяти во время действия этих антагонистов вызывала амнезию необратимую повторным обучением.

Показано, что для индукции процессов воспроизведения и реконсолидации долговременной памяти у улиток необходима интеграция возбуждений, вызываемых условным стимулом и обстановочной афферентацией. При изолированном действии обстановки обучения память не реактивируется.

Полученные нами результаты можно использовать при клиническом анализе механизмов амнезии, возникающей, в частности, при «острой» потере памяти различного генеза. Тактика коррекции нарушенной памяти терапевтическими процедурами или фармакологическими препаратами может иметь существенные особенности в зависимости от вида амнезии (обратимая, необратимая) и стадий амнезии, вовлекающих различные молекулярные и клеточные механизмы.

Апробация диссертации. Основные материалы диссертационной работы доложены на итоговых конференциях НИИ Нормальной физиологии им. П.К.Анохина, РАМН (Москва 2005гг), I съезде физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 2005), научной конференции «Нейрохимия:

фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), международном симпозиуме «Механизмы адаптивного поведения» (Санкт-Петербург, Колтуши, 2005), VIII и IХ региональных конференциях Международного общества нейробиологии беспозвоночных «Простые нервные системы» (Казань, 2006; Санкт-Петербург, 2009), ХХ съезде физиологического общества им.

И.П.Павлова (Москва, 2007), FENS (Geneva 2008), «Neuroscience» (Chicago 2009).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 7 – статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 151 страница состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками. Список цитируемой литературы включает 323 источника.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на взрослых виноградных улитках Helix lucorum, крымской популяции. Животных содержали в холодильнике при температуре +6 С. Не менее чем за две недели до экспериментов улиток «активировали». Животных содержали в «домашних» боксах при комнатной температуре в условиях высокой влажности. Кормили улиток ежедневно сырой морковью. За 3 дня до обучения или тестирования навыков животных лишали пищи, доступ к воде не ограничивали.

Обучение отверганию определенного вида пищи. Процедуру обучения отверганию определенного вида пищи проводили по ранее разработанной методике (Максимова О.А., Балабан П.М., 1983). Улиток фиксировали за раковину к кронштейну таким образом, что животное могло относительно «свободно» перемещаться по пластиковому шару, плавающему в воде. В качестве условного стимула в большинстве экспериментов использовали банан, а в некоторых опытах свежий огурец. В качестве дифференцировочного стимула применяли вареную морковь. Кусочек пищи (2-3 г), прикрепленный к одному из электродов, располагали на расстоянии 0,5 см от ротовой полости животного. Второй электрод находился в воде, омывающей шар. Подкрепляющим стимулом служило воздействие переменным электрическим током (50 Гц, 300 мс, 1,2 мА). Ток пропускали через пищу и тело улитки в момент первых консумматорных пищевых реакций (скребковое движение радулой по пище). Латентные периоды начала пищевых реакций регистрировали с помощью вебкамеры и компьютера. Если животные в течение 120 с не начинали поедать пищу тест прекращали. Предъявление пищи осуществляли через каждые 15-20 мин.

Условный стимул предъявляли 14-16 раз, дифференцировочный 8-10 раз. Проводили три сеанса обучения улиток - ежедневно, в течение 3-х дней. Латентные периоды консумматорных реакций на 3-й день обучения в ответ на последнее предъявление условного стимула составляли, как правило, более 100 с.

Процедура напоминания. Через 24 ч после обучения улиткам однократно инъецировали растворы исследуемых веществ и через 15-20 мин производили процедуру напоминания. Для этого животных помещали на пластиковые шары и предъявляли 3 раза условный стимул с интервалом 10-15 мин без подкрепления током. Продолжительность предъявления условного стимула ограничивали 120 с. Через 1 ч после предъявления первого напоминающего стимула улиток перемещали с шаров в «домашние» боксы.

Тестирование. Для тестирования навыка животных помещали в обстановку обучения и предъявляли условный и дифференцировочный стимулы с интервалом 10-15 мин и в течение 120 с измеряли латентные периоды консумматорных реакций. При тестировании подкрепляющий стимул не применяли.

Повторное обучение. Одним из экспериментальных «инструментов» исследования механизмов амнезии и, в частности, определения степени сохранности нарушенного памятного следа и доступности его для воспроизведения, является повторное обучение. При нарушении выработанного навыка отвергания пищи и развитии амнезии, у улиток проводили повторное обучение отвергания того же вида пищи, что и при первоначальном обучении. Навык вырабатывали в течение 1-3 дней, используя те же методы, что и при первичном обучении.

Обучение прекращали, если латентные периоды консумматорных реакций достигали 100 с и более и эти же значения латентных периодов регистрировали на следующий день при первом предъявлении условного стимула.

Контрольные группы животных. Контрольных животных обучали навыку отвергания определенного вида пищи, используя вышеописанную методику. В большинстве экспериментов улиткам через 24 часа после процедуры обучения инъецировали исследуемые вещества, помещали в обстановку обучения на 1 час и не предъявляли напоминающих условных пищевых стимулов. В ряде опытов животным инъецировали физиологический раствор, помещали в обстановку обучения и предъявляли напоминающие стимулы.

Использованные растворы и вещества. Животным инъецировали растворы веществ в полость тела с помощью шприца через кожу средней части ноги. Используемые в экспериментах вещества разводили в физиологическом растворе для моллюсков в объеме 0,5 мл на улитку, следующего состава NaCl - 80 mM, CaCl(2H2O) - 7 mM, КСl - 5 mM, MgCl2(6H2O) - 5 mM, TrisCl mM; pH - 7,6-7,8. Для подавления процессов трансляции использовали циклогексимид (cycloheximide), и анизомицин (anisomycin). Циклогексимид инъецировали улиткам в дозах 30 и 100 мг/кг веса, анизомицин - 20 и 60 мг/кг веса. В исследованиях, проведенных на разных видах животных, в том числе и на моллюсках, указанные ингибиторы синтеза белка использовали в широком диапазоне доз от 20 до 210 мг/кг веса, в которых они подавляли синтез белка на 60-98% и влияли на процессы консолидации и реконсолидации памяти (Squire L.R., 1984; Montarolo P.G., et al., 1986; Child F.M., et al., 2003; Lаttal K., et al., 2004; Gainutdinova T.H., et al., 2006).

Для изучения роли рецепторов серотонина в механизмах консолидации и реконсолидации памяти использовали неселективный антагонист метиотепин (methiothepin mesylate salt) в дозе мг/кг веса. Метиотепин у моллюсков более эффективно влиял на различные нейрофизиологические процессы, чем другие антагонисты серотониновых рецепторов (Пивоваров А.С., и др., 2003; Barbas D., et al., 2003).

Для ингибирования активности рецепторов NMDA глутамата использовали специфический неконкурентный антагонист МК-801 (dizocilpine maleate) и конкурентный антагонист 2-амино5фосфовалериат (APV). МК-801 инъецировали в дозе 0,20 мг/кг веса, а APV - 15 мг/кг веса. В указанных дозах эти вещества эффективно влияли на многие поведенческие навыки у млекопитающих и беспозвоночных (Литвин О.О., и др., 1998; Sara S. J., 2000; Pedreira M.E., et al., 2002).

Статистическая обработка данных. Экспериментальные данные усредняли и вычисляли стандартную ошибку средней. Сравнивали латентные периоды консумматорных реакций на предъявление условного и дифференцировочного пищевых стимулов, а также латентные периоды на условный стимул у животных контрольных и экспериментальных групп. Для оценки уровня достоверности различий использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) c последующим апостериорным анализом по методу Тьюки для неравных групп (Tukey HSD for unequal N).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Действие ингибиторов синтеза белка перед процедурой напоминания вызывает транзиторную и устойчивую амнезию. Принципиально важной проблемой реконсолидации памяти является вопрос о продолжительности и устойчивости амнезии, возникающей при нарушении реконсолидации – является ли она транзиторной или происходит полное «стирание»

памятного «следа»? Для решения этой проблемы необходимо исследовать молекулярные события, вовлекаемые в обеспечение процессов реконсолидации. Мы изучили особенности действия на эти процессы разных доз ингибиторов синтеза белка, а так же однократных или повторных их инъекций, вызывающих различное по выраженности и продолжительности подавление процессов трансляции (Davis H.P., Squire L.R., 1984).

1.1 Влияние однократного введения блокаторов синтеза белка циклогексимида или анизомицина в «низкой» дозе на механизмы реконсолидации аверсивного условного рефлекса на пищу. Первой группе контрольных обученных животных (n=8) инъецировали по 0,5 мл физраствора, помещали в обстановку обучения и предъявляли 3 напоминающих стимула (банан).

Вторую и третью группы контрольных животных после инъекции анизомицина (20 мг/кг) (n=11) или циклогексимида (30 мг/кг) (n=18) помещали в обстановку обучения, но не предъявляли напоминающих стимулов. Тестировали сохранность условной реакции через каждый час в течение 6-8 ч. У всех групп контрольных животных латентные периоды первых жевательных движений на банан сохранялись на уровне свыше 100 сек в течение всего опыта (рис. 1) и они значительно