На правах рукописи

ИГНАТОВА

Инна Евгеньевна

ВОЗДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ ДОЗ ГАММА-ОБЛУЧЕНИЯ

НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ В МОДЕЛЬНОМ

ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА ПРИМАТАХ

03.01.01 - Радиобиология

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Обнинск - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии РАМН»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Коноплянников Анатолий Георгиевич, доктор медицинских наук Агрба Виолета Засимовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Вайнсон Адольф Адольфович, доктор медицинских наук Попучиев Виктор Васильевич Ведущее учреждение: ФГУ «Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» Федерального медико-биологического агентства России.

Защита состоится 28 февраля 2012 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.132.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медицинский радиологический научный центр»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 249036, г. Обнинск Калужской области, ул. Королева, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_»_201 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Палыга Г.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Успехи научно-технического прогресса способствовали освоению околоземного космического пространства. Человек стал подвергаться воздействию экстремальных условий окружающей среды: измененного барометрического давления, повышенного радиационного фона, гипоксии, температуры и других. Проблемы обеспечения оптимальной жизнедеятельности людей в этих условиях, а также поддержание у них высокой работоспособности, стимулировали проведение многосторонних исследований функционального состояния организма человека. Особенно важное значение эти исследования приобретают в условиях реального космического полета (КП) [Покровский В.И.,2004].

Проблема радиации решается в ходе модельных экспериментов на животных. Ранее использовались мыши, крысы, собаки. Начиная с 1948 г. для решения задач космической физиологии использовались обезьяны – как «лабораторный двойник» человека [Лапин Б.А., Джикидзе Э.К., Фридман, 1987;

Баркая В.С., Тесленко В.М., Бокк М.И., 1997; Ильин А.Е., 2000]. Хорошо изучено влияние ионизирующего излучения (ИИ) на нервную, мочеполовую, мышечную, кроветворную, эндокринную и другие системы приматов. И вместе с тем, совокупных сведений о влиянии ИИ на иммунную систему нет [Манина А.А., 1961; Гордеев Ю.В., Бритван И.И., 1987; Федоров Б.А., Хоравиди Е.М., 1987; Козловская И.Б., Лапин Б.А., Ильин Е.А. и др., 2004].

Оценка радиационной опасности в Космосе представляет собой многоплановую задачу. Трудности ее решения определяются не только специфическими условиями космического пространства, но и материальнотехническими возможностями. Сложный состав космического излучения, широкий энергетический спектр входящих в него частиц, возможная модифицирующая роль других факторов КП (невесомости, перегрузки и др.) затрудняют адекватную оценку радиационной опасности космического излучения [Федоренко Б.С.,1991].

Учитывая источники излучения во время межпланетных экспедиций для здоровья космонавтов будут представлять опасность как «малые», так и высокие дозы радиации [Дудкин В.Е., Ковалев Е.Е., Кузнецов В.Г., Смиренный Л.Н., 1967].

В настоящее время достаточно хорошо изучены в клинике и эксперименте эффекты воздействия высоких доз ИИ, проявляющиеся в виде острой или хронической лучевой болезни, либо в виде местных лучевых реакций. Вместе с тем, значительную актуальность представляет проблема оценки эффектов длительного воздействия ИИ в диапазоне «малых» доз, поскольку существует множество неопределенностей относительно направленности и выраженности медико-биологических последствий подобного воздействия. На данном этапе все эффекты «малых» доз рассматриваются как стохастические, которые могут реализовываться либо в виде онкологических заболеваний, либо в виде генетических нарушений.

Однако это далеко не все эффекты, которые можно наблюдать у лиц, подвергающихся воздействию «малых» доз ИИ. К их числу можно отнести описываемый рядом авторов эффект раннего старения, различные метаболические нарушения, заболевания дыхательной системы и т.д.

[Лютых В.П., Долгих А.П., 1998; Ставицкий Р.В., Гуслистый В.П., Ковальчук И.В. и др., 1999; Ставицкий Р.В., Лебедев Л.А., Мехеечев А.В. и др., 2003; Карпов А.Б., Тахауов Р.М., Удут В.В., Семенова Ю.В., Шерстобоев Е.Ю.

и др., 2005; Pearce L.L., Epperly M.W., Greenberger J.S. et al., 2001].

В связи с этим особую актуальность представляют исследования по выявлению нарушений со стороны иммунной системы на доклиническом этапе, определяющие закономерности формирования иммуно-патологических процессов и основных заболеваний у персонала, подвергающегося длительному воздействию ИИ.

Целью исследования явилась оценка степени воздействия различных вариантов «малых» доз гамма-облучения на иммунную систему приматов.

Задачи исследования:

1. Исследовать клеточное звено иммунитета клинически здоровых обезьян вида макака резус в зависимости от возраста, пола и установить показатели нормы, как вариант «иммунологической карты».

2. Подбор моноклональных антител для определения лимфоцитарных антигенов обезьян.

3. Изучить показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета у обезьян, подвергшихся хроническому фракционному (пролонгированному) гамма-облучению в «малых» дозах.

4. Оценить показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета у обезьян, подвергшихся хроническому фракционному (двукратному) гаммаоблучению в «малых» дозах.

5. Исследовать показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета у обезьян, подвергшихся острому гамма-облучению (имитация солнечной вспышки).

Научная новизна работы.

Впервые показаны особенности иммунного статуса у обезьян в зависимости от возраста и пола. Установлены нормы иммунного статуса клинически здоровых обезьян вида макака резус Адлерского питомника одного из ключевых параметров, определяющих эффективность иммунного ответа.

В ходе выполнения работы в рамках комплексного эксперимента по проекту «Гамма Бриз», у обезьян вида макака резус, подвергшихся острому и хроническому гамма-облучению в «малых» дозах, показаны особенности изменения иммунного статуса, которые определяют последующий запуск иммунологических реакций.

Практическая значимость работы.

Работа выполнена в рамках комплексного эксперимента по проекту «Гамма Бриз». Это исследование, предваряет большой, 500-суточный модельный наземный эксперимент (Марс 500).

Обезьяны, вследствие уникального биологического сходства с человеком и подчас абсолютной незаменимости, особенно для изучения различных патологических и иммунопатологических состояний человека, являются наиболее адекватными экспериментальными объектами для решения многочисленных задач в экспериментальной биологии и медицине.

Установление нормативных показателей иммунной системы обезьян открывает перспективы их использования для моделирования иммунопатологических состояний людей, а также возможность для апробации методов их иммунокоррекции и иммунотерапии. Установление параметров иммунного статуса у обезьян может быть рекомендовано для использования в зооветеринарной практике для выбора и определения тактики и оценки эффективности проводимой терапии. Выявленные изменения в иммунном статусе после воздействия гамма-облучения в «малых» дозах могут быть использованы в радиационной иммунологии с последующей экстраполяцией данных на космонавтов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Показатели иммунного статуса обезьян (клеточное звено иммунитета) близки к таковым у людей.

2. При воздействии хронического, фракционного (пролонгированного) гаммаоблучения в «малых» дозах у обезьян макака резус происходят изменения в клеточном и гуморальном звеньях иммунитета.

3. При воздействии хронического, фракционного (двукратного) гаммаоблучения в «малых» дозах у обезьян происходят изменения в иммунном статусе.

4. Острое гамма-облучение приматов в «малых» дозах оказывает существенное влияние на иммунный статус.

5. Обезьяна, как модель, может быть использована в космической медицине, для изучения радиационного иммунодефицита.

Апробация диссертации.

Материалы диссертации были доложены на I Всероссийской студенческой научно-практической конференции «Студенческие научные исследования в сфере туризма и курортного дела», г. Сочи, 2007; на V научнопрактической конференции молодых ученых и студентов юга России «Медицинская наука и здравоохранение», г. Анапа, 2007; на международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах», г. Сочи, 2007; на заседаниях межлабораторной конференции по проекту «Гамма-Бриз», г. Москва 2008, 2009; на 2-ой международной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской приматологии», г. Сочи, 2011.

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета Учреждения Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии РАМН» 27 мая 2011 г. (протокол № 6).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, статьи опубликованы в журнале, рекомендованном ВАК МОиН РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и указателя литературы, содержащего 91 отечественных и 44 зарубежных источника литературы. Работа иллюстрирована 22 рисунками, 26 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для установления нормативных показателей клеточного звена иммунитета были использованы 90 клинически здоровых обезьян вида макака резус (Macaca mulatta), разного возраста и пола (таблица 1).

Таблица 1. Общее количество обезьян, взятых в эксперимент.

Для изучения воздействия малых доз ИИ были отобраны 11 обезьян самцов вида макака резус 3,4-4,7 летнего возраста, массой тела 3-5 кг.

При осмотре и взятии материла у животных, использовали транквилизаторы (калипсол, кетамин), которые вводили внутримышечно из расчета 0,1 мг/кг массы тела животного.

При выполнении исследования руководствовались «Правилами гуманного обращения с лабораторными животными» [Бургасов П.Н.

«Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 6.04.1973, № 1045-73, приложение 8].

Методы.

В ходе исследования использованы: иммунологические методы - метод проточной цитофлуориметрии, метод радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини и гематологические методы.

Метод проточной цитометрии. Забор крови для иммунофенотипирования осуществлялся утром, натощак. Для иммунофенотипирования использовали моноклональные антитела (МаТ) (производство фирмы «Becton Dickinson», США), в стандартной комбинации.

К 100 мкл цельной, гепаринизированной крови добавляли 20 мкл МаТ.

Инкубировали в течение 20 минут в темноте при комнатной температуре.

Реакция проводилась в строгом соответствии с рекомендациями фирмы производителя («Becton Dickinson»). Образцы анализировали на проточном цитометре Epics XL-MCL («Beckman Coulter», США) и на проточном цитометре Becton Dickinson FACSCalibur («Becton Dickinson», США) в тот же день. На клетках, исследовали уровни экспрессии молекул CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD45 RA, HLA-DR.

Определение количества IgA, IgG, IgM в сыворотке методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини. Использовали стандартный набор реактивов («Институт иммунологии», Москва) для определения иммуноглобулинов А, G, М человека. Подготовка реагентов, проведения метода и учет результатов производили по инструкции производителя.

Общий анализ крови. Для изучения структуры клеток, определения лейкоцитарной формулы делали мазок крови по стандартной методике.

Модель облучения.

Облучение проводилось на базе Государственного научного центра «Институт медико-биологических проблем РАН».

Воздействие радиации на обезьян проводилось в наземных условиях и осуществлялось в соответствии с режимом радиационного воздействия, типичным для условий межпланетных полетов. Этот режим был сформирован с помощью разработанных математических программ, учитывающих наиболее вероятные сценарии радиационного воздействия, и реализовывался с использованием гамма-установок. Облучение проводилось на установке УПГД 2М с источником излучения цезий Cs137. Активность источника 7,4х1012Бк, или 200 Кюри.

Обезьяны облучались тотально и равномерно. Обезьяны первой группы («Гамма 25») находились на расстоянии 5 метров от источника излучения.

Обезьяны второй группы («Гамма 66») на расстоянии 1,5 метров от источника.

Схема облучения подразумевала два этапа:

Первый этап:

Группа 1 ("Гамма 25") – хроническое, фракционное (пролонгированное) облучение: пять облучений по 25 сГр, перерыв два дня и еще пять облучений по 25 сГр.

Группа 2 ("Гамма 66") – хроническое фракционное (двукратное) облучение:

одно облучение в дозе 66 сГр, перерыв шесть дней и еще одно облучение - сГр.

Группа 3 – контрольная, не подвергавшаяся облучению.

Второй этап облучения проводился через три месяца однократно в дозе сГр. (имитация солнечной вспышки) для обеих групп.

Методы статистической обработки данных.

Для статистической обработки данных проводили анализ доступных сведений литературы об иммунологических показателях. Также был проведен анализ нормальности распределения по Колмогорову-Смирнову и ШапироУилку.

Для сравнения значений иммунологических показателей 3 групп между собой использовался однофакторный дисперсионный анализ. Значимыми считались различия между группами при уровне значимости (p) не превышавшем 0,05.

Для оценки динамики между иммунологическими показателями в одной группе использовался парный t-критерий Стьюдента.

Проведен анализ как преобразованных, так и не преобразованных данных.

Для преобразования использовалось логарифмирование по основанию 10.

Для статистического анализа использовался пакет прикладных программ SPSS/PASW Statistics 18.0.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Предварительно, до начала исследования клеточного звена иммунитета у обезьян вида макака резус, была подобрана панель МаТ к дифференцировочным антигенам лейкоцитов обезьян («Becton Dickinson»).

Иммунный статус клинически здоровых обезьян вида макака резус.

В качестве объекта исследований была отобрана группа макак резус разного возраста (подростковый, юношеский, зрелый) и пола [Чалян В.Г., Мейшвили Н.В., 1989] с целью оценки влияния возрастного и полового фактора на показатели клеточного звена иммунитета.

При анализе данных (таблица 2) привлекает внимание весьма широкий диапазон разбросов каждого из изученных показателей иммунограммы.

Минимальные и максимальные значения показателей у отдельных особей в группах могут существенно различаться, что, по-видимому, отражает индивидуальные особенности каждого животного. Отмечено, что число CD3+ клеток не претерпевает существенных изменений с возрастом и не зависит от пола исследованных обезьян. В популяции клеток, экспрессирующих CD4+ у самцов и самок, не было отмечено существенных колебаний данного показателя. Вместе с тем у всех животных с возрастом наблюдается тенденция к увеличению CD8+ - клеток. Эта тенденция у самцов выражена больше, чем у самок. В содержании CD20+ - клеток наблюдается обратная тенденция, к 9- годам показатели несколько снижаются, причем содержание CD20+ - клеток у самок выше, чем у самцов. Что касается CD16+ - клеток, то этот показатель не претерпевает существенных изменений и не зависит ни от пола, ни от возраста.

Таблица 2. Содержание лимфоцитов с разными мембранными маркерами в периферической крови клинически здоровых обезьян.

Таким образом, проведенные исследования иммунного статуса клинически здоровых обезьян вида макака резус позволило сделать вывод, что иммунный статус этих животных приближен к таковому у клинически здоровых людей (таблица 3). Полученные результаты подтверждают возможность использования обезьян в качестве модели для адекватного моделирования на них различных иммунопатологических состояний людей.

Таблица 3. Содержание лимфоцитов с разными мембранными маркерами в периферической крови клинически здоровых людей.

Иммунный статус обезьян, подвергшихся воздействию Проведенное исследование было разделено на три этапа. Первый этап – изучение иммунного статуса до облучения. Было проведено три обследования.

Второй этап – изучение иммунного статуса обезьян после хронического облучения (пролонгированного и двукратного) в течение трех месяцев. Третий этап – изучение иммунного статуса в течение шести месяцев, после острого облучения (имитация солнечной вспышки).

Первостепенную практическую значимость в иммунограмме имеют относительные показатели популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток (ИКК), а не их абсолютные значения, в силу существенного колебания последних, что совпадает с данными других авторов [Лебедев К.О., 1990].

Первый этап – иммунный статус до облучения.

Таблица 4. Содержание лимфоцитов в периферической крови обезьян до облучения.

1-я 41,9-74,3 20,0-45,6 16,0-32,0 0,9-2,1 3,0-25,5 12,5-48, группа 56,5±8,8 32,4±7,3 22,7±4,6 1,5±0,4 10,6±8,9 30,3±11, 2-я 45,4-70,1 26,9-36,0 15,5-44,0 0,6-1,9 2,0-12,0 18,0-49, группа 55,4±8,1 29,6±2,8 23,6±8,3 1,3±0,4 7,5±3,1 35,1±8, 3-я 54,9-79,9 31,0-55,0 19,0-30,0 1,1-2,3 3,0-15,0 11,0-32, группа 66,8±8,9 41,0±9,1 23,8±3,6 1,7±0,5 10,2±4,2 21,5±6, В таблице 4 приведены полученные результаты до облучения по группам.

Во всех группах отмечался широкий разброс полученных показателей иммунограммы. Поэтому в дальнейшем все показатели будут представлены как среднестатистические величины. Оценивая иммунологический статус групп, было отмечено, что все показатели соответствуют нормам, установленным ранее. Так же отмечалось, что данные первой и второй экспериментальных групп максимально соответствуют друг другу. Что же касалось третьей – контрольной группы, - то показатели: CD3 и CD4 – несколько завышены, по CD20, наоборот, занижены, в сравнении с данными экспериментальных групп.

Второй этап – изучение иммунного статуса при первом облучении, когда для групп использовались разные программы. Для первой группы – фракционное, пролонгированное, для второй группы – фракционное, двукратное облучения.

Для анализа иммунного статуса были определены критические точки после облучения – 4 день, 24 день, 50 день, 85 день после облучения.

Третий этап. На 90 сутки после хронического облучения был проведен следующий этап эксперимента – острое облучение, имитация солнечной вспышки. Обе экспериментальные группы получили одинаковую дозу облучения, однократно в дозе 120 сГр. Анализ проводился на 8 (98)-, 57 (147)-, 85 (175) дни и через 180 (270) дней после второго облучения.

На рисунке 1 показана динамика количества В-лимфоцитов до и после облучений. Было отмечено снижение как относительного, так и абсолютного количества В-лимфоцитов во всех экспериментальных группах.

Рис. 1. Количество В-лимфоцитов (CD 20) до и после облучений.

Примечание: * - Р < 0,05 по отношению к фоновым показателям ** - Р < 0,01 по отношению к фоновым показателям.

*** - Р < 0,001 по отношению к фоновым показателям.

Так, через 4 дня (острый период) после облучения отмечается резкое