На правах рукописи

Владыкин Александр Львович

РОЛЬ ХОЛИНЕРГИЧЕСКОЙ И ИММУННОЙ СИСТЕМ

В РЕГУЛЯЦИИ ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ

АНАФИЛАКТИЧЕСКОМ И ЭНДОТОКСИЧЕСКОМ

ШОКЕ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009 2

Работа выполнена в Отделе нейрофармакологии им. С.В. Аничкова Учреждения Российской академии медицинских наук Научноисследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН доктор биологических наук

Научный руководитель:

Нежинская Галина Ивановна член-корреспондент РАМН,

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Сапронов Николай Сергеевич академик РАМН,

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Игнатов Юрий Дмитриевич доктор биологических наук, профессор Сесь Татьяна Павловна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «Институт токсикологии» Федерального Медико-Биологического Агентства России

Защита состоится «_» _ 2009 г. в «_» часов на заседании диссертационного совета Д001.022.03 при НИИЭМ СЗО РАМН (197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12)

Автореферат разослан «_» _ 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Пучкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Включение шоковых состояний атопической (анафилактический шок) и неатопической (эндотоксический шок) природы в ряд наиболее тяжелых ургентных клинических состояний связано с быстрой генерализацией системной воспалительной реакции (Sampson et al., 2006).

Лекарственная терапия эндотоксического шока включает гемодинамические, антимикробные и дезинтоксикационные средства (Мальцева Л.А. и соавт., 2005; Hotchkiss, Karl, 2003), анафилактического шока – антигистаминные препараты, прессорные агенты, бронходилятаторы и системные глюкокортикоиды (Сумин С.А., 2006; Simons, Sheikh, 2007). Однако воздействие не только на эффекторные органы, но и на интегративные системы организма, в частности на нейроиммунные механизмы регуляции позволяет обеспечить как срочные, так и отсроченные адаптивные реакции при шоке (Мазуркевич Г.С., Багненко С.Ф., 2004). Вместе с тем известно, что в профилактике и интенсивной терапии шоковых состояний холинергические средства практически не используются (Tang, 2003), хотя дисфункция холинергической системы играет важную роль в патогенезе анафилактического и эндотоксического шока – поражении легких, сердца, кровеносных сосудов и др. (Pavlov et al., 2006; Gwilt et al., 2007). Попытка коррекции анафилактического и эндотоксического шока в эксперименте показала возможность модуляции активности М-холинорецепторов на уровне периферических эффектов, предупреждая таким образом развитие патохимической стадии анафилактического шока (Нежинская Г.И. и соавт., 2004), или стимуляцией эфферентов nervus vagus (n. vagus) при эндотоксическом шоке («холинергический противовоспалительный ответ») (Tracey, 2007).

Иммунный компонент в инициации шоковых состояний атопической и неатопической природы хорошо известен: продукция IgE, IgG1 при анафилактическом шоке (Finkelman, 2007); активация афферентов n. vagus медиаторами воспаления IL-1, TNF и др. (Pavlov et al., 2006). Однако роль иммунной системы в реализации проявлений шоковой реакции остается недостаточно изученной. Попытки десенсибилизации организма при анафилактическом шоке малоэффективны (Owen, 2007). Об иммунологической стадии эндотоксического шока известно, что в этот период усиливается продукция иммуноглобулина класса IgМ (Reid et al., 1997), а денервация селезенки, связанная с нарушением целостности n. vagus, приводит к увеличению продукции провоспалительных цитокинов и смертности животных от шока (Huston et al., 2006).

Целью работы явилось изучение участия холинергической и иммунной систем в регуляции воспаления при анафилактическом и эндотоксическом шоке.

Задачи исследования:

1. Оценка на моделях in vitro и in vivo иммунотропной активности холинергических препаратов центрального и периферического действия.

2. Исследование на модели гиперчувствительности замедленного типа с развитием реакции Артюса влияния холинергических препаратов на воспаление и уровень сенсибилизации организма к антигену.

3. Изучение влияния холинергических препаратов на анафилактический индекс реакции при их введении на иммунологической или патохимической стадии анафилактического шока.

4. Изучение влияния холинергических препаратов на изменение частоты сердечных сокращений, вызванное введением липополисахарида Salmonella typhi при индукции эндотоксического шока.

5. Исследование роли парасимпатической системы в развитии эндотоксического шока на модели денервированной селезенки, обусловленной пересечением абдоминальных ветвей n. vagus.

6. Изучение влияния холинергических препаратов на иммунный (уровень антителогенеза) и медиаторный (содержание серотонина) ответ интактной или денервированной селезенки.

Научная новизна работы. Установлено, что препараты центрального действия: антагонист мускариновых рецепторов атропин, агонист мускариновых и никотиновых рецепторов холина альфосцерат и антихолинэстеразный препарат галантамин, а также антагонист периферических мускариновых рецепторов ипратропий иммунологически активны в течение 28 суток и более. Препараты способны модулировать продукцию провоспалительного цитокина IL-1, его рецепторного антагониста IL-1Ra, IL-4, инициирующего переключение Th1- на Th2-ответ, и влиять на реакцию гиперчувствительности замедленного типа, лежащую в основе развития воспаления.

Впервые доказана возможность предупреждения иммунологической стадии анафилактического шока с помощью атропина (0,08 мг/кг), ипратропия (6, мкг/кг) или его комбинации с неостигмином (0,04 мг/кг). Показано, что для купирования патохимической стадии анафилактического шока эффективно применение атропина (0,08 мг/кг) в комбинации с галантамином (0,4 мг/кг), что приводит к существенному снижению индекса анафилактической реакции.

Установлено, что эффекты периферического мускаринового антагониста метацина могут быть связаны с его фармакологически активным метаболитом холином или с эффектами альбумина, который существенно увеличивал антианафилактогенную активность препарата на иммунологической стадии и сам по себе снижал интенсивность патохимической стадии шока.

Впервые показано снижение тахикардии у крыс с эндотоксическим шоком, получивших за 30 мин до его индукции препараты центрального действия – агонист М- и Н-холинорецепторов холина альфосцерат (90 мг/кг) или антихолинэстеразный препарат галантамин (0,45 мг/кг).

Впервые показано, что, по сравнению с иннервированной селезенкой (интактные крысы), прерывание абдоминальных ветвей n. vagus на уровне пищевода не влияет на уровень антителогенеза, но снижает в ней содержание серотонина. При эндотоксическом шоке и денервации селезенки холина альфосцерат (90 мг/кг) или галантамин (0,45 мг/кг) снижают функциональную активность В-лимфоцитов, нормализуют содержание серотонина, что свидетельствует о важной роли ненервных эффектов препаратов в реализации шока.

Впервые показана возможность регуляции холинергическими препаратами системного иммунного (активность В-лимфоцитов) и медиаторного (содержание серотонина) ответа селезенки при анафилактическом и эндотоксическом шоке.

Научно-практическое значение работы. Изучение иммунотропной активности холинергических препаратов центрального действия показало наличие у них пролонгированного действия, что теоретически обосновывает возможность их применения в профилактике и лечении шоковых состояний атопической и неатопической природы. Установлена эффективность применения холинергических препаратов на иммунологической (атропин, ипратропий или его комбинация с неостигмином) и патохимической (атропин в комбинации с галантамином) стадии анафилактического шока, а также при эндотоксическом шоке (холина альфосцерат, галантамин), что может служить предпосылкой для поиска путей фармакологической инициации противовоспалительных механизмов с участием холинергической системы в клинической практике.

Подтверждена результативность применения реакции гиперчувствительности замедленного типа с развитием реакции Артюса для оценки влияния холинергических препаратов на воспаление и уровень сенсибилизации организма к антигену, что позволяет использовать ее для прогноза действия препаратов на иммунологическую стадию анафилактического шока. Показана эффективность модели денервации селезенки, обусловленной нарушением целостности n. vagus, для изучения ненервных эффектов холинергических препаратов. Установление структуры метаболитов метацина позволяет судить об их участии в терапевтических эффектах препарата, а также может иметь важное значение для теоретических и практических аспектов снижения числа побочных эффектов холинергических препаратов и повышения их безопасности.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Холинергические препараты центрального и периферического действия пролонгируют первичный иммунный ответ, модулируют продукцию цитокинов (IL-1, IL-1Ra, IL-4), иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) и влияют на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа и развитие реакции Артюса.

2. Формирование иммунологической стадии анафилактического шока можно предупреждать с помощью атропина, ипратропия и его комбинации с неостигмином, патохимической стадии анафилактического шока – введением атропина в комбинации с галантамином, а эндотоксического шока – применением холина альфосцерата или галантамина.

3. На антианафилактогенные эффекты мускаринового антагониста метацина могут влиять его фармакологически активный метаболит холин (метаболизм препарата может проходить по механизму гидролиза) и белки плазмы крови (альбумин, IgG).

4. Купирование холинергическими препаратами анафилактического и эндотоксического шока сопровождается нормализацией антитело- и серотонинпродуцирующей активности спленоцитов. Прерывание парасимпатической иннервации селезенки при эндотоксическом шоке приводит к усилению ненервных эффектов холинергических препаратов, связанных с их действием на спленоциты, модулируя иммунный и медиаторный ответ селезенки.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе статей в центральных журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

Личный вклад диссертанта заключается в самостоятельном проведении большинства экспериментальных исследований, включая работу с лабораторными животными, проведение лабораторных тестов, статистическую обработку и интерпретацию полученных результатов. Электрокардиографические исследования и операция ваготомии проводились совместно с к.б.н. Н.Р. Евдокимовой (отдел нейрофармакологии им. С.В. Аничкова НИИЭМ СЗО РАМН), которой автор выражает искреннюю благодарность.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 4-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006);

на 2-м Международном симпозиуме по ненейрональному ацетилхолину (Майнц, Германия, 2006), на III съезде фармакологов России «Фармакология – практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007), на ХV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), на 3-м Китайско-Российском международном симпозиуме по фармакологии (Харбин, 2008), на заседании общества фармакологов (Санкт-Петербург, 2009), на заседании отдела нейрофармакологии НИИЭМ СЗО РАМН (2007 - 2009).

Структура и объем работы. Работа изложена на 138 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения и выводов.

Работа иллюстрирована 35 таблицами и 8 рисунками. Библиографический указатель содержит 228 источников, из которых 27 отечественных и зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на самцах мышей-гибридов линий (CBAC57BL/6)F1 массой 18-20 г (n=570), на крысахсамцах линии Вистар массой 180-200 г (n=435); на цветных морских свинках самцах массой 320-370 г (n=270), полученных из питомника «Рапполово»

РАМН. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе со свободным доступом к воде при 12 часовом световом режиме.

В работе использовали холинергические препараты центрального и периферического действия (табл. 1).

Таблица 1. Дозы холинергических препаратов для человека и животных.

(мускариновый антагонист) Холина альфосцерат (мускариновый 14,3 80,0 90,0 130, и никотиновый агонист) (ингибитор ацетилхолинэстеразы) (мускариновый антагонист) (мускариновый антагонист) (никотиновый антагонист) (ингибитор ацетилхолинэстеразы) Примечание. Препараты применяли в терапевтических дозах для человека (Машковский М.Д., 2007), пересчитанных для конкретного вида животных (мыши, крысы, морские свинки) (Волчегорский И.А. и соавт., 2000).

Из белков плазмы крови в исследование были взяты альбумин человека в дозе 800 мг/кг – для мышей, 500 мг/кг - для морских свинок (Meziani et al., 2007) и нормальный донорский -глобулин (98% IgG) (Машковский М.Д., 2007) в дозе 1, мг/кг – для мышей, 1 мг/кг – для морских свинок. В качестве белка сравнения использовали С-реактивный белок человека (CRP) (Нежинская Г.И. и соавт., 2004).

На моделях in vivo оценивали влияние препаратов на первичный иммунный ответ на эритроциты барана (ЭБ), связанный с антителопродуцирующей активностью клеток (АОК/106 спленоцитов) у мышей-гибридов линий (СВАхC57BL/6)F1 (1х106 клеток/животное), крыс Вистар (1х108 клеток/животное), морских свинок (1х109 клеток/животное) (Jerne et al., 1974). Динамику АОК определяли в течение 28 суток у мышей после иммунизации ЭБ и введения им препаратов (атропин, холина альфосцерат, галантамин, ипратропий).

Содержание серотонина в селезенке морских свинок и крыс определяли в депротеинизированных образцах ткани органа (Rogausch et al., 2004) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе «Beckman System Gold» (США), оснащенным колонкой SphereClone 5 ODS (250х4,60 мм) с предколонкой SecurityGuard (ODS 4x3,0 мм) и электрохимическим детектором LC-4C. Идентификацию и количественную оценку медиатора осуществляли в сравнении с внешним стандартом серотонина. Концентрацию серотонина выражали в нг на 1 мг белка в ткани селезенки. Содержание белка определяли по методу Лоури (Досон Р. и соавт, 1991) На моделях in vitro оценивали продукцию цитокинов (IL-1, IL-1Ra, IL-4) и иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека с помощью соответствующих коммерческих наборов («Вектор-Бест», Россия), согласно прилагаемой инструкции.

Измерение оптической плотности проводили на микропланшетном ридере Synergy 2 (BioTek, США).

Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), лежащую в основе развития реакции Артюса, моделировали подкожной инъекцией в основание хвоста мышей-гибридов линий (СВАхC57BL/6)F1 сенсибилизирующей дозы (0,02 мл) полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) (Sigma, Германия) (Медуницин Н.В., 1983).

Холинергические препараты – атропин, галантамин, холина альфосцерат, метацин, ипратропий, гексаметоний, неостигмин вводили внутрибрюшинно одновременно с сенсибилизирующей дозой ПАФ. Комбинацию атропина с галантамином вводили за 30 и 15 мин соответственно, ипратропия с неостигмином - за 40 и 15 мин соответственно до инициации ГЗТ. Развитие реакции ГЗТ оценивали по отеку хвоста через 30 мин, 3, 6 и 24 ч после введения ПАФ и препаратов (Jacysyn еt al., 2001).

Содержание АОК в ответ на введение сенсибилизирующей дозы ПАФ (0, мл) определяли на уровне локального (5 сутки) и системного (14 сутки) иммунного ответа.

Реакцию Артюса, позволяющую оценивать влияние препаратов на развитие воспаления, и являющуюся моделью иммунологической стадии анафилактического шока, инициировали через 2 недели после сенсибилизации мышей путем введения им в основание хвоста разрешающей дозы ПАФ (подкожно 0,02 мл) (Медуницин Н.В., 1983). Интенсивность воспаления оценивали по степени повреждения кожных покровов (сроки появления язв, характер и площадь поражений) ежедневно в течение 21 суток после введения разрешающей дозы ПАФ.

Анафилактический шок вызывали у морских свинок, предварительно сенсибилизированных подкожным введением 0,1 мл нормальной лошадиной сыворотки (ЛС) («Микроген», Россия), которым через 14 дней внутрисердечно вводили разрешающую дозу ЛС (0,5 мл). Анафилактический индекс (АИ) развития шока оценивали по четырехплюсовой системе Weigle через 1-3 мин после введения разрешающей дозы (Хаитов Р.М. и соавт., 2005).

Холинергические препараты - атропин, галантамин, холина альфосцерат, ипратропий, гексаметоний, неостигмин, или белки плазмы крови – альбумин или IgG вводили внутрибрюшинно одновременно с сенсибилизирующей дозой ЛС (оценка влияния препаратов на иммунологическую стадию шока) или за мин до индукции шока (оценка влияния препаратов на патохимическую стадию шока). Комбинацию атропина с галантамином вводили за 30 и 15 мин соответственно, а ипратропия с неостигмином - за 40 и 15 мин соответственно, метацина с альбумином или IgG – за 40 мин до инъекции разрешающей дозы ЛС. Через 24 часа после перенесенного шока у морских свинок (получили разрешающую дозу ЛС в объеме 0,3 мл) определяли количество АОК и содержание серотонина в селезенке.

Эндотоксический шок воспроизводили у крыс линии Вистар путем внутрибрюшинного введения в сублетальной дозе (20 мг/кг в 0,5 мл физиологического раствора) липополисахарида Salmonella typhi (S. typhi) штамм ty-4441 (ЛПС) (НИИ вакцин и сывороток, Россия) (Strunk et al., 2001). Атропин, галантамин, холина альфосцерат или ипратропий инъецировали внутрибрюшинно за 30 мин до индукции шока. Оценку действия препаратов на течение шока проводили через 2 часа после их введения по характеру изменения частоты сердечных сокращений (ЧСС) на электрокардиограмме (ЭКГ) (Wu et al., 1998), которую регистрировали во втором стандартном отведении на приборе ЭК1Т-03М2. Количество АОК и содержание серотонина в селезенке крыс также определяли через 24 часа после перенесенного ими шока.

Субдиафрагмальную ваготомию, связанную с пересечением дорсальной и вентральной ветвей n. vagus, идущих вдоль пищевода (Huston et al., 2006), проводили с целью выяснения роли селезенки, основного защитного органа иммунной системы (Rogausch et al., 2004), в развитии эндотоксического шока (регистрация ЧСС) и реализации ненервных эффектов холинергических препаратов (оценка антитело- и серотонинпродуцирующей функций спленоцитов). Пересечение n. vagus, иннервирующего селезенку проводили за 24 часа до введения крысам сублетальной дозы ЛПС. За 30 мин до введения ЛПС крысы также получали атропин, галантамин, холина альфосцерат или ипратропий внутрибрюшинно. Через 24 часа у крыс определяли содержание серотонина в селезенке, а через 5 суток – количество АОК.

Идентификацию метаболитов метацина проводили через 30, 60, 90, 120 и мин после внутрибрюшинной инъекции препарата в дозе 0,18 мг/кг.

Гепаринизированную кровь центрифугировали при 200g в течение 10 мин, отделяли плазму. Наличие метаболита 2-гидрокси-2,2-дифенилуксусной кислоты в плазме определяли хромато-масс-спектрометрическим методом (Mass spectrometry…, 2007) на установке Agilent 6890N (США) (температура источника 230° С, энергия ионизации - 70 эВ). Определение метацина в плазме крови осуществляли методом ВЭЖХ с использованием подвижной фазы ацетонитрил:фосфатный буфер (рН 3,5) в соотношении 55:45, колонки Nucleosil C18 (150х4,6 мм, зернение 5мкм) на хроматографе «Shimadzu-10A» (Shimadzu, Япония), при длине волны УФ-детектора 252, 258 и 264 нм (Poole, 2003).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в пакете программ Statistica 6.0 (StatSoft, США) с помощью t-критерия Стьюдента.

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Различия