На правах рукописи

МЕЛЬНИК ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КОРЫ ТЕМЕННОЙ ДОЛИ БОЛЬШОГО МОЗГА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ СИНДРОМА РЕЙЕ И КОРРЕКЦИИ ЕГО

ГЕПАТОПРОТЕКТОРАМИ

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск – 2003 2

Работа выполнена в Сибирском государственном медицинском университете, г.

Томск Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Суходоло Ирина Владимировна доктор медицинских наук, профессор Венгеровский Александр Исаакович заслуженный работник высшей школы РФ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Байтингер Владимир Франциевич доктор медицинских наук, профессор Суслов Николай Иннокентиевич

Ведущая организация: Новосибирская государственная медицинская академия

Защита состоится «_»_2003 г. в _ч на заседании диссертационного совета Д 208.096. 03 при Сибирском государственном медицинском университете по адресу: 63450, г. Томск, Московский тракт, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в научной медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (634050, г. Томск, пр. Ленина, 107).

Автореферат разослан «_»2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Герасимов А.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Синдром Рейе развивается всвязи с применением у детей противовоспалительных и противогистаминных лекарственных средств на фоне вирусных инфекций и проявляется как острая энцефалопатия в сочетании с тяжелой жировой дегенерацией печени [Reye R. et al., 1963]. Летальность при этом заболевании достигает 85% [Casteels-Van Daele M. et al., 2000; Sutliff R. et al., 2000; Thabet F. et al., 2002]. В патогенезе синдрома Рейе ведущую роль играет нарушение митохондриального окисления среднецепочечных и длинноцепочечных жирных кислот в следствие недостатка карнитина в гепатоцитах [Kakuda T. N. et al., 2000; Szewczyk A. et al., 2002].

Наиболее близкой по структурно-метаболическим проявлениям к синдрому Рейе экспериментальной моделью данной патологии является поражение печени и головного мозга, вызванное 4-пентеноевой (аллилуксусной) кислотой [Glasgow A., Chase H., 1975]. Это токсическое вещество, связывая свободный карнитин в неактивный комплекс, нарушает утилизацию жирных кислот и вызывает метаболические растройства, характерные для синдрома Рейе [Sakaida N. et al., 1990; Sugimoto T. et al., 1990].

Недостаточная эффективность современных методов фармакотерапии синдрома Рейе и высокая летальность при этом заболевании определяют необходимость создания лекарственных препаратов, которые за счет нормализации функций печени и восстановления ее детоксицирующей активности сдерживали бы прогрессирование энцефалопатии.

На кафедрах фармакологии и фармацевтической технологии Сибирского государственного медицинского университета совместно с Томским институтом химии нефти СО РАН и Тихоокеанским институтом биоорганической химии ДВО РАН были созданы гепатопротекторы эплир (комплекс фосфолипидов, сульфолипидов, тиолов и каротиноидов илового осадка), лохеин (экстракт травы интродуцированного сибирского растения солянка холмовая, содержащий бетаин, флавоноиды, стерингликозиды и алкалоиды) и максар (полифенолы древесины дальневосточного растения маакия амурская), которые проявляют при токсическом гепатите более высокую терапевтическую эффективность, чем зарубежные гепатопротекторы эссенциале и легалон [Саратиков А. С., Венгеровский А. И., 1995].

Необходимо изучить влияние данных гепатопротекторов на течение экспериментального синдрома Рейе и выбрать препарат, способный наиболее эффективно нормализовать функции печени и предотвращать поражение эндогенными токсинами головного мозга.

Цель исследования.

Оценить морфофункциональное состояние коры теменной доли большого мозга крыс при моделировании синдрома Рейе и коррекции его гепатопротекторами эплиром, лохеином, максаром, эссенциале и легалоном.

Задачи исследования.

1. Изучить морфофункциональные нарушения в коре большого мозга крыс при двух моделях синдрома Рейе (интоксикация 4-пентеноевой кислотой и ацетилсалициловой кислотой на фоне действия пирогенала) с целью выбора модели, адекватной данной патологии.

2. Оценить терапевтическое действие лохеина, максара и легалона, введенных в течение 7, 14 и 30 дней после окончания интоксикации 4-пентеноевой кислотой, на морфофункциональное состояние кровеносного русла коры головного мозга крыс при экспериментальном синдроме Рейе.

3. Оценить терапевтическое действие эплира и эссенциале, введенных в течение 7, 14 и 30 дней после окончания интоксикации 4-пентеноевой кислотой, на морфофункциональное состояние кровеносного русла коры головного мозга крыс при экспериментальном синдроме Рейе.

4. Установить эффективность действия гепатопротективных средств на морфофункциональное состояние нейронов и нейроглии коры большого мозга крыс в условиях токсического воздействия 4-пентеноевой кислоты.

5. Сравнить терапевтическую эффективность лохеина, максара, эплира, эссенциале и легалона при экспериментальном синдроме Рейе.

Научная новизна работы.

Впервые установлено, что в коре головного мозга крыс при интоксикации 4пентеноевой кислотой возникает комплекс морфофункциональных изменений, которые моделируют энцефалопатию, характерную для синдрома Рейе. Адекватной моделью синдрома Рейе является интоксикация 4-пентеноевой кислотой в дозе мг/кг при внутрибрюшинном введении в течение 7 дней. Изменения ангио- и цитоархитектоники в коре головного мозга крыс, возникающие при введении 4пентеноевой кислоты в дозе 50 мг/кг через 4 ч 10 раз или ацетилсалициловой кислоты на фоне инъекции бактериального липополисахарида пирогенала, в большей степени отличаются от морфофункциональных проявлений синдрома Рейе. В течение 30 дней после прекращения инъекций 4-пентеноевой кислоты не происходит спонтанного восстановления морфофункциональных показателей коры большого мозга.

Гепатопротекторы эплир, лохеин, максар, эссенциале и легалон проявляют высокую терапевтическую активность при экспериментальном синдроме Рейе. Терапия экспериментальных животных этими препаратами в течение 7, 14 и 30 дней, сопровождается регрессом морфофункциональных нарушений в коре большого мозга, вызванных интоксикацией 4-пентеноевой кислотой.

Эффект гепатопротекторов при экспериментальном синдроме Рейе зависит от продолжительности фармакотерапии: максимально выраженное лечебное действие регистрируется при введении гепатопротекторов в течение 30 дней. Максар в большей степени, чем другие гепатопротекторы, уменьшает морфофункциональные нарушения в коре большого мозга крыс при экспериментальном синдроме Рейе.

Практическая значимость работы.

Экспериментально обоснована целесообразность включение лохеина, максара, легалона, эплира и эссенциале в комплексную фармакотерапию синдрома Рейе. Гепатопротекторы, уменьшая нарушения метаболизма паренхимы печени, ослабляют симптомы токсической энцефалопатии при модели синдрома Рейе.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Внутрибрюшинное введение крысам 4-пентеноевой кислоты или инъекции ацетилсалициловой кислоты через 1 ч после введения пирогенала позволяют воспроизвести морфофункциональные нарушения в коре большого мозга, характерные для синдрома Рейе. Наиболее адекватной моделью синдрома Рейе является интоксикация 4-пентеноевой кислотой в дозе 20 мг/кг в течение 7 дней.

2. Гепатопротекторы лохеин, максар, легалон, эплир и эссенциале, вводимые животным в течение 7, 14 и 30 дней на фоне интоксикации 4-пентеноевой кислотой, стабилизируют функции печени и предохраняют головной мозг от развития токсической энцефалопатии.

3. Максар и эссенциале в большей степени, чем другие гепатопротекторы, оказывают положительное влияние на течение экспериментального синдрома Рейе у крыс (интоксикация 4-пентеноевой кислотой).

4. Лучшие результаты терапии модели синдрома Рейе у крыс достигаются при введении гепатопротекторов в течение 30 дней.

Апробация и публикации.

Материалы настоящего диссертационного исследования докладывались и обсуждались на конференции, посвященной 70-летию заслуженного деятеля науки РФ, профессора А.И. Рыжова (г. Томск, 1999), межрегиональной научной конференции Сибири и Дальнего Востока, посвященной 150-летию академика И.П. Павлова (г.

Томск, 1999). По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного строению коры большого мозга крыс в норме и при патологии, патогенезу и клинике синдрома Рейе, 4-х глав, отражающих результаты экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 158 с., иллюстрирована 36 таблицами, 18 фотографиями. Библиография включает 266 источников, из них – 121 зарубежный.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили в осенне-зимние сезоны на 480 белых беспородных крысах-самцах массой 200-220 г. Животные находились в стандартных условиях вивария, в параллельно исследуемых группах (по 20 крыс) имели одинаковую массу тела, контролируемую ежедневным взвешиванием для коррекции вводимой дозы препаратов. Все манипуляции (взвешивание, введение препаратов, умерщвление животных) осуществляли с 9 до 12 ч.

Исследовали две экспериментальные модели синдрома Рейе у крыс:

1) интоксикация 4-пентеноевой кислотой;

а) крысам вводили внутрибрюшинно 4-пентеноевую кислоту в дозе 20 мг/кг раз в сутки в течение 7 суток [Sakaida N. et al., 1990];

б) животным вводили внутрибрюшинно 4-пентеноевую кислоту в дозе мг/кг, 10 раз через 4 ч [Sugimoto T. et al., 1990];

2) интоксикация ацетилсалициловой кислотой на фоне действия бактериального липополисахарида пирогенала.

Животным, не получавшим в течение 1 суток пищи, вводили внутрибрюшинно пирогенал в дозе 0,2 мг/кг и спустя 1 ч – ацетилсалициловую кислоту (аспизол, “Bayer”) в дозе 50 мг/кг однократно [Kilpatrick L. et al., 1989].

В результате проведенных исследований, была выбрана адекватная модель синдрома Рейе – интоксикация 4-пентеноевой (аллилуксусной) кислотой. Данная модель позволяет воспроизводить синдром Рейе, в том числе отдельные стадии патологических процессов, что подтверждается результатами морфологических и гистохимических исследований. Экспериментальный синдром Рейе можно использовать для оценки эффективности и установления механизма действия лекарственных средств, регулирующих функции печени.

Животные в течение 7 дней ежедневно получали внутрибрюшинные инъекции 0,5% водного раствора 4-пентеноевой кислоты в дозе 20 мг/кг. С 8-го дня после начала интоксикации крысам вводили в желудок ежедневно эплир (30 мг/кг), эссенциале (80 мг/кг), лохеин (5 мл/кг, что соответствует 160 мг/кг экстрактивных веществ), максар (200 мг/кг) или легалон (200 мг/кг). Дозы препаратов являются эффективными терапевтическими [Саратиков А.С. и соавт., 2001].

Продолжительность фармакотерапии составляла 7, 14 и 30 дней (табл. 1).

Легалон применяли в виде суспензии в 1% крахмальной слизи, эплир – в виде раствора в оливковом масле, эссенциале – в ампульном растворе, лохеин – в виде жидкого водно-спиртового экстракта. Навеску максара растворяли в небольшом количестве этилового спирта, затем добавлением воды создавали тонкую суспензию вещества.

Через сутки после последнего введения препаратов крыс декапитировали под легким эфирным наркозом. У животных вскрывали черепную коробку, осматривали и извлекали головной мозг. Большой мозг фиксировали в 10% нейтральном формалине, жидкости Карнуа и замораживали в жидком азоте. Выделяли теменную область коры большого мозга, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 5- мкм. Для оценки морфологических изменений в коре большого мозга на светооптическом уровне использовали следующие методы:

- общегистологический обзорный метод – окраска срезов гематоксилином и эозином;

- выявление хроматофильного вещества в перикарионах нейронов коры большого мозга толуидиновым синим no Nissl в соответствии с прописью НИИ мозга РАМН [Меркулов Г. А., 1969];

- дифференцированное выявление нейронов и глии на парафиновых срезах [Ромейс Б., 1954];

- определение элементов глии в коре большого мозга методом импрегнации по С. Бодиану [Ромейс Б., 1954];

Для анализа функциональных изменений в коре теменной доли применяли гистохимические методы. Внутриклеточную активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), NADH2- и NADPH2-тетразолийредуктаз, -оксибутиратдегидрогеназы (ОБДГ) выявляли тетразолиевым методом no S. Loyda. Активность кислой фосфатазы (КФ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли методом одновременного азосочетания по M. Burstone [Лойда З. и соавт., 1982].

Количественную оценку продуктов ферментативных реакций проводили одноволновым методом с помощью цитофотометра ЛЮМАМ-И-3 с объективом 40, размером зонда 0,1 мм в проходящем свете с длинной волны 576 нм. Все данные выражали в условных единицах оптической плотности [Журавлева Т. Б., Прочуханов Р. А., 1978]:

где А – оптическая плотность исследуемого поля, I" – интенсивность светового потока, проходящего через предметное и покровное стекла микропрепарата, минуя срез, I – интенсивность светового потока, проходящего через окрашенные участки цитоплазмы клеток.

На срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, с помощью окулярной линейки, откалиброванной объект-микрометром, измеряли диаметр просвета капилляров головного мозга, среднее количество нейронов, суммарной и перинейрональной глии.

Для оценки реактивных изменений нервных клеток коры большого мозга в слоях III, IV, V на парафиновых срезах, окрашенных толуидиновым синим, подсчитывали процент нейронов с очаговым, тотальным хроматолизом и пикноморфных нейронов на 500 нервных клеток каждого слоя от каждого животного. С помощью окулярного микрометра АМ-9-2 при 630-кратном увеличении микроскопа на срезах коры большого мозга, окрашенных 0,1% раствором толуидинового синего, оценивали объем ядра и цитоплазмы нервных клеток.

Дифференциальным методом для глиальных элементов определяли процентное отношение олигодендроцитов и астроцитов. Ha срезах, импрегнированных по С.

Бодиану, оценивали изменение цитоархитектоники слоёв III, IV, V коры большого мозга, а также характер пролиферации глиальных элементов.

Цифровой материал обрабатывали общепринятыми методами вариационной