На правах рукописи

Асташева

Елена Валериевна

ОСЦИЛЛЯТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ

И МЕЖСТРУКТУРНЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ

В ЗДОРОВОМ И ЭПИЛЕПТИЧЕСКОМ МОЗГЕ

03.03.01 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино – 2013

Работа выполнена в лаборатории Системной организации нейронов им. О.С. Виноградовой Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук и Пущинском государственном естественно-научном институте.

Научные руководители: доктор биологических наук Кичигина Валентина Федоровна кандидат биологических наук Асташев Максим Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Семёнова Татьяна Павловна в.н.с. лаб. механизмов природных гипометаболических состояний ИБК РАН доктор биологических наук, профессор Мошков Дмитрий Алексеевич зав. лаб. ультраструктуры нейрона ИТЭБ РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Защита состоится 26 июня 2013 г. в 12-00 на заседании Совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу:

142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу:

142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат диссертации разослан “ “ мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.ф.-м.н. Н.Ф. Ланина  

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Осцилляции в электроэнцефалограмме (ЭЭГ) возникают благодаря синхронной активности большого числа нервных клеток. Многими работами продемонстрирована важная роль ритмической активности всех диапазонов частот в обработке информации в нейронных сетях. Посредством отведений ЭЭГ от скальпа и внутримозговых регистраций достаточно детально исследованы осцилляции в различных кортикальных областях, имеющих слоистый тип организации. В отличие от этого, они практически не изучены в субкортикальных структурах ядерного типа, принимающих активное участие в обработке поступающих в мозг сигналов.

В последние годы большой интерес у нейрофизиологов вызывает выяснение роли осцилляторной активности во взаимоотношениях различных областей мозга, поскольку они играют важную роль в организации его функций, в частности, когнитивных. Предполагается, что для включения избирательного внимания, при обучении, запоминании, различных когнитивных задачах необходима гибкая и быстрая (в пределах сотен миллисекунд) перестройка коммуникаций разных нейронных ансамблей. Такие быстрые преобразования не могут осуществляться посредством анатомических связей. Согласно существующим гипотезам [Ливанов, 1989; Fries, 2005], субстратом таких перестроек может являться осцилляторная активность, синхронно возникающая в пространственно разделенных, но функционально связанных областях мозга. К настоящему времени экспериментально доказано, что осцилляции обеспечивают ритмическую модуляцию нейронной возбудимости, которая влияет на чувствительность синаптических входов и на вероятность генерации потенциалов действия [Fries, 2005; Anderson et al., 2010; Wang, 2010; Benchenane et al., 2011; Colgin, 2011]. Таким образом, ритмическое повышение нейронной возбудимости обеспечивает временные окна для коммуникаций и может динамически модулироваться когнитивными потребностями.

Несмотря на возрастание интереса к осцилляторным процессам, до настоящего времени остается неизвестным, могут ли разные типы осцилляций присутствовать в различных структурах (как кортикальных, так и субкортикальных) при одном и том же уровне активации мозга, какова степень их выраженности и, главное, как изменения ритмической активности отражаются во взаимодействиях разных областей мозга. Внесение ясности в эти вопросы важно для понимания механизмов работы мозга.

Малоизученным является и вопрос о том, каков характер изменений нейродегенеративных заболеваниях. Одним из широко распространенных заболеваний такого рода является височная эпилепсия (ВЭ). Эта патология представляет собой тяжелую трудноизлечимую форму фокальной эпилепсии, при которой повреждаются многие структуры мозга. Механизмы возникновения и развития ВЭ пока не ясны; возможно, что одной из причин этого является недостаточное внимание, уделяемое исследованию ритмов мозга при эпилептогенезе.

Практически не изученными являются нарушения осцилляций в субкортикальных ядрах при ВЭ, а также изменения степени синхронизации их активности с активностью неокортикальных областей.

В литературе есть указания на то, что при ВЭ у пациентов наблюдается нарушение обучения и памяти; аналогичные нарушения выявлены на моделях ВЭ у животных. В то же время известно, что ритмическая активность разных диапазонов участвует в когнитивной работе мозга; в частности, тета-осцилляции, пейсмекером которых является медиальная септальная область (МС), необходимы для включения внимания и дальнейшего запоминания поступающей в мозг информации [Vinogradova, 1995; Buzsaki, 2002]. Известно также, что МС играет ключевую роль в регуляции возбудимости и функционировании гиппокампальной системы, необходимой для формирования долговременной памяти и, в то же время, являющейся основным локусом повреждений при ВЭ. Эти факты подчеркивают необходимость особенно глубокого изучения роли МС в изменении осцилляций как в норме, так и при эпилептогенезе. Одной из наименее изученных отделов МС является глутаматергическая система, имеющая существенное значение в функционировании гиппокампа. Анализ изменений, возникающих при воздействиях на эту систему на экспериментальных моделях ВЭ, продвинут понимание причин развития эпилепсии.

';

Цели и задачи исследования Цель работы состояла в исследовании ЭЭГ-активности кортикальных и субкортикальных структур мозга бодрствующих животных в норме и в моделях эпилепсии.

Основные задачи

:

1) Определить характеристики ЭЭГ-активности восьми структур мозга здоровых бодрствующих морских свинок в следующих частотных диапазонах: дельта, тета, альфа, гамма и рипплз;

активности при генерации судорожных разрядов, вызванных электрической (перфорирующего пути);

3) На модели электрического киндлинга перфорирующего пути выявить взаимодействиях во всех исследуемых диапазонах;

4) Изучить влияние активации глутаматергической системы медиальной септальной области (внутриструктурным введением L-глутамата) на осцилляторную активность других областей мозга.

Научная новизна В настоящем исследовании впервые осуществлена одновременная регистрация (энторинальной и фронтальной областей, гиппокампа, зубчатой фасции) так и септального ядра) у здоровых и эпилептических животных. Выявлены особенности ритмической активности этих областей мозга в основных частотных диапазонах:

дельта, тета, альфа, гамма и рипплз. Впервые показано, что у морских свинок, находящихся в состоянии спокойного бодрствования, в структурах «ядерного» типа, так же, как в кортикальных областях, отчетливо выражены осцилляции во всех полосах частот, от низкочастотных (дельта) до высокочастотных (рипплз).

Обнаружено, что корреляционные взаимодействия структур мозга в разных диапазонах в целом тем интенсивнее, чем отчетливее выражена осцилляторная активность в этих диапазонах, хотя это не являлось общим правилом.

Обнаружено, что во время генерации судорожных разрядов осцилляторная глутаматергической системы МС. При этом парадоксальным образом нарушается степень синхронизации активности различных структур: в целом, она возрастает в разнонаправленные сдвиги могут быть причиной разбалансировки и нарушения работы мозга, в том числе изменения когнитивных функций и потерю сознания при судорогах.

На модели электрического киндлинга и повторного введения L-глутамата в МС впервые описаны глобальные нарушения ритмической активности всех диапазонов и межструктурных отношений в этих частотных полосах в эпилептическом мозге.

Обнаруженные изменения осцилляций могут объяснять нарушения когнитивных функций мозга при эпилептогенезе. На модели височной эпилепсии выявлен существенный вклад активации глутаматергической системы МС в развитии эпилептического очага.

Показано, что наиболее ранним проявлением эпилептогенеза в моделях киндлинга является подавление рипплз-осцилляций в медиальной септальной области и миндалине: они ослабевают уже при неполной раскачке, когда нет явных признаков патологии.  Это свидетельствует о том, что высокочастотные осцилляции в МС и миндалине – наиболее уязвимый процесс при эксайтотоксических воздействиях, и их подавление можно рассматривать как маркер начала формирования патологического очага. При длительной электрической стимуляции перфорирующего пути (более 2-х месяцев), приводящей к появлению спонтанных судорожных припадков, в активности МС и гиппокампа выявлено постепенное ослабление тета-ритма и корреляционных взаимодействий этих структур; эти нарушения ускоряются при активации глутаматергической системы МС. Поскольку, как показано многими авторами, в нормальном мозге тета-ритм играет протекторную роль при неблагоприятных воздействиях на мозг, резкое ослабление тета-осцилляций и дезинтеграция работы септо-гиппокампального комплекса, по-видимому, являются одной из основных причин формирования височного эпилептического очага на поздних этапах киндлинга. Данные способствуют пониманию общих механизмов работы мозга и развития ВЭ.

Научно-практическая значимость работы Проведенная работа позволила выявить изменения, которые могут лежать в основе развития патологических процессов в эпилептическом мозге. Одновременная регистрация внутримозговой ЭЭГ из нескольких структур показала, что изменения ритмической активности при эпилетогенезе наблюдаются параллельно как в кортикальных, так и в субкортикальных областях, что существенно расширяет представления о механизмах развития височной эпилепсии.

Показанное в работе наиболее существенное возрастание осцилляций в гамма- и рипплз-диапазонах во время генерации судорог указывает на то, что высокочастотные осцилляции имеют решающее значение в формировании эпилептического очага.

Выявление наиболее раннего проявления результатов киндлинга в виде подавления рипплз-осцилляций в медиальной септальной области и миндалине, служит основанием рассматривать эти изменения как маркер начавшегося эпилептогенеза.

Полученные экспериментальные данные могут помочь разработке новых подходов для терапии височной эпилепсии.

Апробация работы Основные результаты диссертации доложены на Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009, 2011, 2013), Международном симпозиуме «Гиппокамп и память» (Пущино, 2009, 2012), 4ом, 5ом, 6ом, 7ом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, 2008-2011 гг), конференции молодых ученых ИТЭБ РАН «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2009-2012), а также на школах: 1. Школа-конференция Нейротехнологии 2010 («Биоэкономика, основанная на знаниях: политика инновационного пути развития биотехнологии»), Россия, пос.

Бекасово, 2010; 2. Вторая всероссийская научная школа «Нейробиология и новые подходы к искусственному интеллекту и науке о мозге», Ростов-на-Дону, 2011;

3. Всероссийский конкурс научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области биологических наук в рамках всероссийского фестиваля науки. Ульяновск, 2011. По материалам диссертации опубликовано 4 работы: 3 статьи в отечественных рецензируемых журналах, включенных в список ВАК, и 1 статья в зарубежном рецензируемом журнале.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа изложена на 150 страницах, содержит 20 рисунков. Список литературы включает источников отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объекта исследования использовались морские свинки (самцы и самки, вес от 450 до 540 г, n=35). Все манипуляции проводили согласно международным нормам этического обращения с животными [Guide for the care and use of laboratory animals, 2010].

Модели эпилепсии 1. Электрический киндлинг (n=20). Модель создавалась путем повторяющейся электрической стимуляции перфорирующего пути (ПП, интенсивность стимула 100мкА, длительность – 0.3-0.8 мс, частота 10 Гц). В течение дня предъявлялись три серии стимуляций. Ежедневно на каждом животном проводили один эксперимент.

2. Введение фармакологических веществ в МС (n=15). Модель создавалась путем ежедневно повторяющегося введения в МС (в течение 35-46 дней, а в отдельных случаях до 92 дней) агониста глутаматных рецепторов L-глутамата (2.5 мкМ, «глутамат», n=5). Животным другой группы одновременно вводили L-глутамат в той же дозе, и антагонист ионотропных глутаматных рецепторов кинуреновую кислоту ( мкМ, «глут+кин», n=5), для проверки специфичности воздействий L-глутамата.

Животным контрольной группы вводили физиологический раствор («контроль», n=5).

Проведение электрофизиологических экспериментов. За неделю до начала экспериментов проводили хирургическую операцию: по рассчитанным координатам [Rapisarda, Bacchelli, 1977] под общим наркозом (золетил, 18 мг/кг; ксилазин, мг/кг) имплантировали монополярные микроэлектроды в энторинальную кору (ЭК, АР=4,6; L=5,5; Н=10,5), супрамамиллярное ядро (СМЯ, АР=7,8; L=1,5; Н=10,8; угол 15 град.), центральное ядро миндалины (Мин, АР=9,8; L=5,0; Н=10,7), медиальную септальную область (МС, АР=11,5; L=2,0; H=8; угол 15 град.), латеральное септальное ядро (ЛС, АР=11,5; L=2,0; H=6,6; угол 15 град.), зубчатую фасцию (ЗФ, АР=5,8; L=2,5; Н=4,9), поле СА1 гиппокампа (Гипп, АР=5,8; L=2,5; Н=4,5) и фронтальную кору (ФК, АР=16,2; L=2; Н=3). В перфорирующий путь (ПП, АР=4,6;

L=4,5; Н=4) имплантировали биполярные раздражающие электроды, используемые для вызова острой судорожной активности. Референтный электрод ввинчивали в затылочную кость. Над МС устанавливали направляющую канюлю по координатам АР=11,5; L=2,0; H=8,0 и уголом 14 градусов для дистанционного введения веществ.

Эксперименты проводились в стандартных условиях, в затемнённой, экранированной камере, после адаптации к ней животного в течение трёх дней.

Экспериментальная установка. Для регистрации внутримозговой ЭЭГ применялась 8-ми канальная установка, состоящая из: 1) персонального компьютера под управлением MS Windows XP, 2) универсальнаой платы ЦАП/АЦП сбора данных L791 (LCard, Москва, Россия), 3) программного пакета LGraph2 (LCard, Москва, Россия), 4) пакета драйверов LComp.

Обработка и анализ данных в цифровой форме. Для сбора и анализа данных в цифровой форме был разработан специальный набор программ в среде программирования Delphi 7 (Borland Software Corporation). Записи анализировали offline с помощью быстрого преобразования Фурье для получения амплитудночастотных характеристик в заданных частотных диапазонах. Для получения информации о распределении мощности сигнала по частоте во времени использовано комплексное непрерывное Вейвлет-преобразование с материнской функцией Морле.

Гистологический контроль. По окончании экспериментов, для контроля локализации отводящих электродов производили электролитическую маркировку мест отведения активности и стимуляции путём пропускания в течение 20 с слабого тока (1 мА) через электроды. Для оценки состояния ткани гиппокампа, изменение которого является показателем эпилептогенеза, мозг фиксировали в 4 % растворе параформальдегида и затем окрашивали по методу Тимма.

Статистический анализ. При статистическом анализе исследуемых групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) в программе Origin7.0 SR (OriginLab Corporation, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Суммарная электрическая активность и корреляционные отношения исследуемых структур в здоровом мозге.

Анализ локальных полевых потенциалов (ЭЭГ) бодрствующих морских свинок (n = 15) был проведен в следующих диапазонах частот: дельта (полоса 0.5-4 Гц), тета (4-8 Гц), альфа (10-12 Гц), гамма (40-80 Гц) и рипплз (100-200 Гц) (Рис. 1.).

Вычисления спектральной мощности и частоты ритмической активности у здоровых животных показали, что в состоянии спокойного бодрствования осцилляции в низкочастотных дельта- и тета-диапазонах имели большую спектральную мощность, чем в высочастотных гамма- и рипплз-полосах. Дельтаосцилляции имели наибольшую мощность; при этом был сильнее всего они были выражены в ФК, СМЯ и ЭК, при незначительных различиях в его частоте; можно отметить лишь несколько большую частоту дельта-осцилляций в ЗФ по сравнению с другими областями. Тета-осцилляции во всех структурах имели значительно меньшую спектральную мощность, например в МС она была почти вдвое меньше, чем мощность дельта-осцилляций (8.7±1.5 и 16.7±3.3 отн. ед., соответственно), а в СМЯ – более чем в два раза (10.8±2.3 и 23.3±10.5 отн. ед.). Тета-ритм был сильнее всего выражен в Гипп, ЗФ и ЭК, не отличаясь существенно по частоте. Альфа осцилляции почти во всех структурах были вдвое слабее по мощности, чем тетаосцилляции; наиболее отчетливыми они были в Гипп и ЗФ, и практически не различались по частоте; в то же время в МС выраженность альфа-ритма была наименьшей. Гамма-осцилляции имели гораздо меньшую спектральную мощность во всех структурах; по сравнению с тета-ритмом их мощность была ниже в 5-10 раз; в разных областях мозга они почти не различались ни по мощности, ни по частоте;

можно лишь отметить несколько большую, по сравнению с другими структурами, их мощность в гиппокампе. Рипплз-осцилляции, чья спектральная мощность была такая же незначительная, как и гамма, в разных структурах существенно различались; при этом наибольшая мощность была в СМЯ, а наименьшая (в 2.1 раза) в ЛС; частота рипплз практически не различалась (Таблица 1).

Мощность, отн.ед.

 Рис. 1. Пример внутримозговой ЭЭГ-активности восьми структур мозга у бодрствующей морской свинки и ее обработка. А – активность в контроле (без каких-либо воздействий);

справа – обозначения структур: Б – график зависимости «пиковая частота-мощность» на данном отрезке записи; по оси ординат – мощность (отн.ед.), по оси абсцисс (логарифмическая шкала) – пиковая частота (Гц); можно видеть, что присутствует низкочастотная активность, заметны пики на дельта и альфа частотах. В – Вейвлет-спектры для данного отрезка активности, демонстрирующие особенности активности каждой из структур мозга.

Таблица 1. Осцилляторная активность разных диапазонов частот в исследуемых структурах мозга ФК мощность 24.25±7.54** 9.99±2.29 5.74±0.98* 3.19±0.57 3.69±1. частота 1.05±0.29 5.11±0.34**** 10.85±0.11 59.42±2.89 131.51±4. В таблице показаны мощность (отн. ед.) и частота (Гц) осцилляторной активности в исследуемых структурах у здорового животного. Максимальные значения мощности осцилляций в каждом диапазоне выделены жирным и подчеркиванием, а минимальные – жирным и курсивом. Достоверность отличий параметров одного и того же диапазона в