Федеральное государственное автономное учреждение высшего

профессионального образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

_

На правах рукописи

Галиуллина Лейсан Фаритовна

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПОНЕНТОВ

АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ БЛЯШКИ МЕТОДАМИ МАГНИТНОГО

РЕЗОНАНСА

Специальность 01.04.07 — физика конденсированного состояния

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Казань 2013

Работа выполнена на кафедре общей физики и на кафедре квантовой электроники и радиоспектроскопии Института физики ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научные руководители: доктор физико-математических наук, профессор Силкин Николай Иванович доктор химических наук профессор Аганов Альберт Вартанович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, доцент, профессор кафедры физики молекулярных систем института физики ФГАОУ ВПО КФУ Филиппов Андрей Васильевич доктор физико-математических наук, профессор, заведующий лабораторией биофизики транспортных процессов Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН Анисимов Александр Васильевич

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, г. Москва

Защита состоится «26» декабря 2013 года в «14» часов «40» минут на заседании диссертационного совета Д212.081.15 при Казанском Федеральном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.

Лобачевского при ФГАОУ ВПУ «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте Казанского (Приволжского) федерального университета http://www.kpfu.ru Автореферат разослан «»_2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук, профессор Еремин М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На протяжении десятилетий многие аспекты развития и совершенствования экспериментальной базы и методов ЯМР спектроскопии связывались с проблемами исследования структуры и свойств различных химических веществ. Разработка новых методик проведения экспериментов и обработки данных постоянно расширяла круг решаемых с применением ЯМР задач и позволяла исследовать все более сложные объекты.

Это способствовало успешному применению ЯМР для исследования структуры биомолекул и их функций в организме на уровне клеток и органов. В настоящее время современные методы спектроскопии ядерного магнитного резонанса достигли столь высокого уровня, что позволили вплотную приблизиться к детальному изучению биофизических процессов в медицине и биологии.

Следствием этого явилось появление крупных международных журналов, специализирующихся на тематиках, посвященных приложениям ЯМР в биологии и медицине - Journal of Biomolecular NMR, Magnetic Resonance in Medicine, NMR in Biomedicine и др. для более широкой и профессиональной ориентации в указанных областях.

Особенность метода ЯМР высокого разрешения (ВР), прежде всего, состоит в том, что по положению и мультиплетности резонансных линий в спектрах можно судить о взаимном расположении отдельных атомов или групп атомов в молекулах, причем с применением специальных методик это удается обнаружить даже для магнитно эквивалентных атомов. Этим ЯМР метод по своей информативности выгодно отличается от других аналитических методов, конкурирующих с ним.

В последнее время особую актуальность приобрели приложения ЯМР в медицинских исследованиях, в частности, для изучения молекулярных механизмов, имеющих место при сердечно-сосудистых заболеваниях (ССЗ).

ССЗ являются наиболее частой причиной инвалидизации и смертности взрослого населения в большинстве экономически развитых стран, включая РФ. Известно, что данное заболевание часто остается нераспознанным (плохо диагностируется) на ранних стадиях и, как правило, выявляется на заключительных стадиях так называемого сердечно-сосудистого континуума, когда речь идет уже о таких осложнениях, как острый коронарный синдром, инфаркт миокарда, мозговой инсульт [1]. Согласно доминирующей версии причиной приведенных осложнений ССЗ является атеросклероз, при котором холестерин и другие липиды, а также клеточные элементы и фибрин накапливаются в стенках артерий, формируя бляшки и, тем самым, ограничивая кровоток. В связи с этим в последнее время значительно возрос интерес к изучению развития, стабилизации и распада атеросклеротических бляшек с целью выявления механизмов, ответственных за их формирование и развитие.

Несмотря на большое количество исследований в этой области, проблема установления причин возникновения и развития атеросклероза до сих пор остается нерешенной. В большинстве случаев практически невозможно выделить какой-то ограниченный набор факторов, оказывающих влияние на развитие этого заболевания. Кроме того, возможно, что так называемые «факторы риска» оказывают влияние только на определенные формы атеросклероза [2]. Известно, что к ним относят не просто общее высокое общее содержание холестерина, а содержание «плохого» холестерина - липопротеинов низкой плотности. В то же время «хороший» холестерин - липопротеины высокой плотности, обладает антиатерогенными свойствами (так называемый «необходимый холестерин»). [3] Другой неразрешенной проблемой является стадия кальцификации бляшек. В процессе развития атеросклероза в организме происходит отложение кальциевого фосфата гидроксиапатита (кальцификация) в атеросклеротических образованиях, что приводит к увеличению прочности бляшки [4]. Однако неизвестно, влияет ли этот фактор на ее склонность к разрыву. Кроме того, в состав атеросклеротических бляшек входит коллаген – фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани организма и обеспечивающий ее прочность и эластичность. Содержание коллагена, возможно, является фактором, оказывающим влияние на склонность бляшек к разрыву [5]. Известно, что взаимодействие коллагена и гидроксиапатита в атеросклеротической бляшке имеет сходство с аналогичными процессами, имеющими место в костной ткани, механизмы же этого взаимодействия все еще однозначно не установлены. В связи с этим актуальным является исследование факторов, оказывающих влияние на кальцификацию бляшек и их склонность к разрыву.

';

ЯМР исследования атеросклеротических образований в кровеносных сосудах человека появились еще в начале 1970-х годов, однако были ограничены, в основном, идентификацией и определением количества липидов в различных жидких фазах. Развитие методов ЯМР высокого разрешения в твердых телах с вращением под магическим углом 1Н и 31Р HR-MAS и 13С CPMAS (для наблюдения ЯМР с низким содержанием магнитных ядер), а также градиентных двумерных методов существенно расширили возможности ЯМР в изучении сложных молекулярных систем. Одно из ограничений в исследовании структуры и межмолекулярных взаимодействий компонентов атеросклеротических образований заключается в том, что время протонной релаксации для них в большинстве случаев мало в шкале ЯМР, что затрудняет такие исследования с помощью наиболее эффективной для подобных целей методики, основанной на использовании ядерного эффекта Оверхаузера.

Другим ограничением является плохая растворимость большинства компонентов атеросклеротических бляшек в органических растворителях и в воде. В связи с этим актуальными являются и разработки новых подходов ЯМР исследований компонентов атеросклеротических бляшек, и подбор модельных систем, адекватных целям и задачам исследования.

Целью диссертационной работы является установление структуры различных компонентов атеросклеротических образований методами ЯМР высокого разрешения в жидкости и ЯМР твердого тела с вращением под магическим углом. Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. изучение структуры комплекса холестерин+модель биологической мембраны (додецилсульфат натрия);

2. исследование мицеллообразования додецилсульфата натрия в растворе 3. исследование структурных свойств кальциевого фосфата гидроксиапатита в зависимости от степени карбонизации;

4. изучение взаимодействия коллагена и гидроксиапатита в образцах порошков и в суспензиях;

5. определение ЯМР спектральных характеристик атеросклеротических Методы исследования. При решении поставленных задач кроме различных методов ЯМР высокого разрешения в жидкости и ЯМР с вращением под магическим углом (1Н, 31Р, 13С MAS, 1Н HR-MAS, и 13С CP-MAS) использовались ЭПР, а также квантово-химические расчеты оптимальной геометрии молекул и химических сдвигов. В частности применялись методы одномерной ЯМР спектроскопии на ядрах 1Н, 31Р и 13С, двумерные гомо- и гетероядерные ЯМР импульсные последовательности [HetCOR, COSY, HSQC, HMBC и NOESY модификации], селективные 1D NOESY эксперименты и диффузионная DOSY спектроскопия. Часть этих методов применялась в сочетании с методиками подавлением сигнала протонов растворителя.

Эксперименты проводились с использованием ЯМР спектрометра «AVANCEII» фирмы «Bruker» (рабочая частота 500,13 МГц на ядрах 1Н, 125,758 МГц на ядрах 13С и 202,456 на ядрах 31Р). ЭПР эксперименты проведены на спектрометре W-диапазона (93,5 ГГц) Elexsys 680 фирмы «Bruker» с применением стационарного и импульсного режимов.

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах.

Научная новизна диссертации:

1. Впервые проведено прямое наблюдение образования комплекса холестерин + додецилсульфат натрия (модель биологической мембраны) и описана его пространственная структура.

2. Впервые определена зависимость структурных свойств кальциевого фосфата гидроксиапатита от степени его карбонизации.

3. Методами 1D и 2D ЯМР высокого разрешения в жидкости и в твердом теле исследован комплекс коллаген+гидроксиапатит. Впервые показано, что коллаген и гидроксиапатит образуют органо-минеральный комплекс за счет формирования Ван-дер-Ваальсовых связей между атомами кальция гидроксиапатита и аминокислотным остатком пролина в коллагене.

4. С помощью квантово-химических расчетов впервые исследован механизм взаимодействия кальция с фрагментами аминокислотной последовательности коллагена, и установлено, что ионы кальция образуют комплексы с аминокислотной последовательностью глицин-пролин-аланин.

5. На основании анализа ЯМР и ЭПР спектров атеросклеротической бляшки установлено образование в ней органо-минеральных комплексов с участием молекул гидроксиапатита.

Обоснованность и достоверность полученных результатов подтверждается их принципиальным согласием с данными аналогичных исследований, проводимыми с помощью других физических методов (ИКспектроскопия, ЭПР и рентгеноструктурный анализ), отсутствием противоречия с основными механизмами взаимодействия, имеющими место в биологических системах (взаимодействие холестерина с фосфолипидными бислойными мембранами), а также согласованностью экспериментальных данных с результатами моделирования на основе квантово-механических расчетов.

Научная и практическая значимость работы:

додецилсульфатом натрия, аналогичный комплексу холестерина в фосфолипидной мембране, следовательно, данный комплекс в взаимодействия холестерина и фосфолипидной мембраны.

2. Выявленная зависимость между структурными свойствами гидроксиапатита и его степенью карбонизации может быть использована для установления корреляций между степенью карбонизации гидроксиапатита в различных биологических тканях (кости, зубы, атеросклеротические образования, имплантаты и др.) и их биологическими свойствами.

3. Результаты исследования взаимодействия коллагена и гидроксипатита кальцификации атеросклеротических образований и аналогичных процессов, имеющих место в костных тканях.

Личный вклад автора:

1. Участие в определении целей и задач исследования.

2. Проведение ЯМР экспериментов по изучению компонентов атеросклеротических образований.

3. Проведение квантово-химических расчетов и обработка их 4. Обработка, анализ и интерпретация полученных ЯМР и ЭПР экспериментальных результатов.

5. Полное написание статей [А1,А3,А4], а также участие в создании статей [А2,А5,А6].

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на следующих семинарах и конференциях: Международная молодежная научная школа «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений»

(Казань, 2009), Международный симпозиум «Современное развитие магнитного резонанса» (Казань, 2010), Международный симпозиум и летняя школа «Ядерный Магнитный Резонанс в конденсированных средах» (СанктПетербург, 2010), Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола, 2009), Всероссийская конференция «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» (Казань, 2011), Международная молодежная научная школа «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его приложений» (Казань, 2012).

Диссертационная работа выполнена в лаборатории ЯМР спектроскопии биологических систем при кафедре общей физики и при кафедре квантовой электроники и радиоспектроскопии Института физики в рамках междисциплинарного ОНН КФУ «Биомедицинская радиоспектроскопия и оптика».

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 6 статей в рецензируемых изданиях, 2 в сборниках статей, 5 – тезисы докладов.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы и авторского списка литературы. Работа изложена на 131 страницах, содержит 60 рисунков и 12 таблиц. Список цитированной литературы содержит 131 наименование.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследуемой проблемы, сформулированы цель и задачи диссертационной работы, основные результаты, их практическая и научная ценность, представлены положения, выносимые на защиту, и описана структура диссертации.

В первой главе изложены общие принципы методов ЯМР высокого разрешения в жидкости и в твердых телах, использованных в этой работе.

Описаны основы одномерной ЯМР спектроскопии: 1D 1H, 31P, 13C в жидкости и H, 31P, 13C MAS (Magic Angle Spinning), 13С CP MAS (cross polarization MAS) и Н HR-MAS (High Resolution MAS) в твердом теле с вращением под магическим углом, приведены общие положения двумерной корреляционной спектроскопии: 1H-1H COSY (Correlated Spectroscopy), 1H-13C HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), 1H-13C HMBC (Heteronuclear MultiBond Correlation), 1H-13C и 1H-31Р HetCor (Heteronuclear Correlation) приведены также описание и возможности инверсных и градиентных ЯМР методов. Более детально рассмотрена спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера NOE (Nuclear Overhauser Effect) и, в частности, эксперименты 2D NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) и 1D селективный NOESY.

Ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО) основан на изменении поляризации, наблюдаемой в спиновой системе при условии изменения населенности одной или нескольких подсистем. В спектре ЯМР это проявляется как изменение интенсивности одного сигнала за счет насыщения соответствующих резонансных переходов, формирующих другие сигналы. Так как дипольдипольное взаимодействие, определяющее изменение заселенностей, зависит от расстояния между взаимодействующими спинами, то величина ЯЭО также зависит от расстояния между ними [14,15].

Вероятности переходов для продольной релаксации в случае двухспиновой системы будут пропорциональны коэффиценту qAB, который пропорционален интенсивности диполь-дипольного взаимодействия:

где 0 – магнитная проницаемость вакуума, rAB – расстояние между спинами А и В, ядер А и В.

Соответствующая функция спектральной плотности имеет вид:

где rot – вращательное время корреляции, зависящее от размеров молекул или надмолекулярной структуры.

Селективный метод NOESY представляет собой метод наблюдения ЯЭО с использованием градиентных импульсов магнитного поля, не требующий получения разностного спектра, и позволяющий, таким образом, получить спектр без артефактов вычитания. Как результат, становится возможным наблюдение с высокой степенью достоверности очень малых ЯЭО.

В базисном эксперименте селективного 1D NOESY используется следующая импульсная последовательность:

В конце главы приводится описание методов ЯМР высокого разрешения в твердых телах: 1H, 31P, 13C MAS, 13С CP MAS и 1Н HR-MAS.

Вторая глава посвящена описанию объектов исследования, техники и методики проведения экспериментов и условия записи спектров ЯМР.

Характерным видом атеросклеротических отложений в сосуде является фиброзная бляшка (рис. 1), состоящая из покрышки, включающей гладкомышечные клетки и фиброзную ткань, представленную, главным образом, коллагеном, и ядра, содержащего желтоватые жиры, а также холестерин (рис. 2).

Количество холестерина в разных его фракциях рассматривается как фактор риска в развитии атеросклероза (холестериновая теория атеросклероза) и, в целом, ССЗ [6].

Несмотря на то, что ЯМР спектроскопия достаточно часто используется для определения содержания липидных компонентов в биологических мембранах, возможности современных методик ЯМР спектроскопии для исследования структуры и межмолекулярных взаимодействий внутри фосфолипидных мембран все еще сильно ограничены. Причин тому несколько.