[
На правах рукописи
ВОЛКОВ
Юрий Олегович
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ
ПРИМЕНЕНИЯ ОКСИТОЦИНА ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ РЕПАРАТИВНЫХ
ГИСТОГЕНЕЗОВ ПРИ КОСТНОЙ АУТОПЛАСТИКЕ ДЕФЕКТОВ НИЖНЕЙ
ЧЕЛЮСТИ
(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ)
03.03.04. –клеточная биология, цитология, гистология 14.01.14. – стоматологияАВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Оренбург –
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Стадников Александр Абрамович заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор Матчин Александр Артемьевич
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Брюхин Геннадий Васильевич – заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет»
Минздрава России доктор медицинских наук, профессор Зотов Валентин Михайлович – профессор кафедры ортопедической стоматологии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»
Минздрава России
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова»
Минздрава России.
Защита состоится «_» декабря 2013 г. в _00 часов на заседании диссертационного совета Д 208. 066. 04 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний Учного совета, официальный сайт: http://orgma.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России (460000, г.Оренбург, Парковый проспект д. 7).
Автореферат разослан «_» ноября 2013г., автореферат и текст объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Шевлюк Н. Н.
Общая характеристика работы
Актуальность.
Совершенствование методов лечения и реабилитации больных с дефектами костей лица продолжает оставаться актуальной проблемой челюстно-лицевой хирургии (Петренко В.А., 2007; Герасимов А.С., 2011).
Отсутствие челюсти или ее фрагмента нередко приводит к изменению внешнего вида больного, сопровождается тяжелыми нарушениями артикуляции нижней челюсти, вызывает нарушения акта жевания, глотания, звукопроизношения и речевой ритмики и другие расстройства, приводящие к существенному изменению жизненно важных функций и эстетики лица (Рапекта С.И., 2008). Вс это приводит к тяжелым нарушениям психосоматического состояния больных (Дударева А.П., 2009; Лежава Н.П., 2010).
Значимость этой проблемы возрастает в связи с увеличением количества пациентов, перенесших оперативные вмешательства по поводу новообразований (Дробышев А.Ю., 2007; Жулев Е. Н. с соавт., 2008; Кулаков А.А. с соавт., 2009; Boffano P. et al., 2012; De Melo W. M. et al., 2012), производственного и бытового травматизма (Нестеров А.В., 2011;
Tepper O. M. et al., 2011; Chrcanovic B.R., 2012).
Успешное замещение дефекта нижней челюсти костным трансплантатом во многом определяют процессы репаративной регенерации в зоне пересаженного костного аутотрансплантата. Возможности традиционных методов пластики имеют границы, а такие недостатки, как многоэтапность, ограниченность пластического материала, малая устойчивость лоскутов и трансплантатов к инфекции, зависимость результата операции от состояния кровоснабжения тканей в зоне дефекта, делают восстановительное лечение малоэффективным, а порой и безрезультатным (Неробеев А.И., 1988; Перлухин М.Л., Сысолятин П.Г. с соавт., 2009).
2009;
По данным литературы (Калакуцкий Н.В., 2004; Gonzalez-Garsia R. et al., 2009), остеопластика нижней челюсти нередко сопровождается воспалительными осложнениями. Гнойно-воспалительные процессы в ране могут вести к расхождению краев раны, некрозу перемещенных лоскутов слизистой оболочки и кожи. Это приводит к отторжению пересаженных костных аутотрансплантатов, ведет к образованию свищей, оростом, к вторичным деформациям челюстно-лицевой области и шеи, требующим повторных восстановительных и реконструктивных операций. Кроме того, костная ткань челюстно-лицевой области обладает низкими потенциями к регенерации вследствие малого содержания кроветворного костного мозга (Перова М.Д., 2005). Поэтому даже частичное восстановление костной ткани в области послеоперационных дефектов является весьма сложным (Безруков В.М. и соавт., 2002; Дробышев А.Ю. и соавт., 2002).
При планировании костно-пластических операций большое значение имеет выбор пластического материала. Продолжается поиск новых материалов и препаратов, способствующих ликвидации воспаления и восстановлению структурных элементов костной ткани (Бельченко В.А., 2002; Топольницкий О.З., 2002; Шишацкая Е.И., 2009;
Яременко А.И. с соавт., 2011 ).
гипоталамических нейропептидов, в частности окситоцина, на репаративные процессы тканей различного генеза (Поленов А.П., 1994; Стадников А.А., 1999, 2001; Барков В.Н., 2004; Гречихина С.В. и соавт., 2007; Матчин А.А. и соавт., 2008; Стадников А.А., О.В.
Бухарин, 2012). Исследованиями (Курлаев П.П., 1986, 2001; Сивожелезов К.Г., 2005;
Вахитов Э.М., 2013). Показана целесообразность местного применения окситоцина, позитивно влияющего на репарацию тканей при лечении ряда заболеваний, в том числе воспалительного характера.
Получены новые сведения в том, что окситоцин обеспечивает условия для развития репаративных потенций клеточных элементов, стимулирует дентиногенез, оптимизирует и коррегирует процессы репаративной регенерации в тканях периодонта, цементе зуба и в альвеолярной кости (Безносик В.Н., 2010).
Доказано положительное влияние местного применения окситоцина в эксперименте при создании модели сквозной раны щеки у крыс, проявляющееся в уменьшении воспаления и оптимизации репаративных гистогенезов, обусловленных стимулирующим воздействием на пролиферативную активность эндотелиоцитов, фибробластов, эпителиоцитов слизистой и кожной части щеки, миосимпластов, на функциональную деятельность макрофагов. Это способствует заживлению раны в целом (Кочкина Н.Н., 2010; Безносик В.Н. с соавт., 2012).
Однако роль гипоталамической нейросекреции в оптимизации репаративных гистогенезов костной ткани челюстно-лицевой области в условиях замещения дефектов нижней челюсти скелетными аутотрансплантатами изучена недостаточно.
Целью настоящего исследования является экспериментально-гистологическое обоснование применения окситоцина для оптимизации заживления дефектов нижней челюсти при костной аутопластике на основе оценки состояния адаптивной роли гипоталамической нейросекреции.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
1. Разработать модель сквозного дефекта тела нижней челюсти, замещенного ауторебром, у экспериментальных животных.
2. Провести морфофункциональную оценку нонапептидергической гипоталамической нейросекреции в условиях раневого повреждения нижней челюсти у экспериментальных животных с последующим замещением моделируемых дефектов реберным аутотрансплантатом (в том числе в сочетании с антибиотиками).
морфофункциональных изменений в мягких тканях околочелюстной области, нижней челюсти, реберном аутотрансплантате и гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе (ГГНС).
4. В сравнительном аспекте проанализировать влияние цефтриабола, а также данного антибиотика и окситоцина на процесс репаративной регенерации сквозного дефекта костной ткани нижней челюсти в условиях замещения дефекта реберным аутотрансплантатом.
Установлено, что процессы экспериментально вызванного сквозного дефекта нижней челюсти в условиях аутотрансплантации ауторебра и местного введения окситоцина приводят к существенному повышению репаративных потенций костной ткани за счет остеоиндуктивной реализации гистоорганотипических свойств. Это позволило обосновать новый методический подход, позволяющий достичь жесткой фиксации реберного аутотрансплантата и тем самым обеспечить формирование органотепического регенерата. Впервые обоснованы общебиологические критерии оценки процессов репаративного остеогенеза костной раны в связи с регуляторным участием гипоталамических нейропептидов в оптимизации процессов заживления дефектов нижней челюсти в условиях их замещения реберным аутотрансплантатом, что доказывает целесообразность использования окситоцина для оптимизации репаративного остеогистогенеза при костной пластике дефектов лицевых костей.
Проведенные исследования расширяют представления о характере и динамике заживления сквозных костных дефектов нижней челюсти и обосновывают целесообразность применения одного из гипоталамических нейропептидов (окситоцина) для стимуляции репаративного гистогенеза при костной пластике дефектов лицевых костей.
Полученные новые сведения о роли и значимости окситоцина в оптимизации репаративных гистогенезов могут быть использованы в качестве методологической основы при разработке новых способов лечения больных с дефектами костей лицевого скелета.
Экспериментально разработанный и обоснованный новый способ лечения сквозных дефектов нижней челюсти дает возможность его клинической апробации после разрешения Минздрава России.
1. Замещение раневого дефекта нижней челюсти экспериментальных животных (крыс) реберным костным аутотрансплантатом сопровождается резорбцией аутотрансплантата а также альвеолярного отростка, с расхождением краев, в области морфофункциональной недостаточностью нонапептидэргической гипоталамогипофизарной нейросекреторной системы.
2. Регенерация костной ткани после моделирования сквозного дефекта нижней челюсти в существенной степени зависит от гипоталамических нейроэндокринных механизмов регуляции остеогенеза.
3. Местное применение окситоцина коррегирует процессы репаративного остеогенеза дефектов нижней челюсти экспериментальных животных, в том числе при использовании реберных аутотрансплантатов, приводя к формированию структурнофункционального полноценного регенерата.
Материалы диссертации внедрены в учебном процессе кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы военной и практической медицины» (Оренбург, 2011); XVII Международной конференции челюстно-лицевых хирургов «Новые технологии в стоматологии» (Санкт-Петербург, 2012 г); XI Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Самара, 2012); XVII Международной конференции челюстно-лицевых хирургов «Новые технологии в стоматологии» (СанктПетербург, 2013).
По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 в изданиях рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с описанием собственных исследований с тремя подглавами, главы обсуждения их результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 3 таблицы, 29 рисунков (фотографий, микрофотографий и электроннограмм).
Указатель содержит 256 источников, из которых 182 отечественных и 74 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Работа выполнена на 90 нелинейных белых половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 220-250 г (табл. 1). Все животные одного возраста, содержались в стандартных условиях вивария на полноценной диете.
Под эфирным рауш-наркозом у 75 животных формировали экспериментальную модель сквозного дефекта нижней челюсти. Для этого в асептических условиях, после осуществления типичного подчелюстного доступа, были скелетированы угол и тело нижней челюсти от мягких тканей и слизистой оболочки ротовой полости, с помощью бормашины и кусачек Люэра создавался сквозной костный дефект тела нижней челюсти размером 4 мм в пределах зубного ряда. Производился гемостаз. На мягкие ткани и слизистую оболочку ротовой полости производилось наложение швов викриловой нитью.
Группа из 15 животных (без каких-либо экспериментальных воздействий) была контрольной.
При выполнении исследований были соблюдены требования приказа МЗ СССР № 755 от 12.08 1977 « О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», приложения к приказу МЗ экспериментальных животных» и Федерального закона, принятого Государственной Думой 1.12.1999 «О защите животных от жестокого обращения».
вмешательств костной пластикой реберным аутотрансплантатом костной пластикой реберным аутотрансплантатом и инъекционным введением во время и на 1, 3, 5, 7 сутки после операции окситоцина в разовой дозе 1ЕД 1 раз в сутки в окружающие дефект мягкие ткани пластикой реберным аутотрансплантатом и внутримышечным введением раствор цефтриабола в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции один раз в сутки пластикой реберным аутотрансплантатом и введением во время и на 1, 3, 5, 7 сутки после операции, в окружающие дефект мягкие ткани, окситоцина один раз в сутки в разовой дозе 1ед и раствора цефтриабола внутримышечно в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции один раз в сутки Итого:
В 1-ой серии животные со сквозным дефектом нижней челюсти наблюдались без дополнительных вмешательств.
Во 2-ой серии наблюдались крысы со стандартным дефектом нижней челюсти с первичной костной пластикой реберным аутотрансплантатом без медикаментозного В 3-ей серии подопытным животным с первичной костной пластикой реберным аутотрансплантатом вводился окситоцин (ГЕДЕОН РИХТЕР А. О. Будапешт-Венгрия) во время и на 1, 3, 5, 7 сутки после операции один раз в день в разовой дозе 1МЕ в окружающие дефект мягкие ткани.
В 4-ой серии экспериментальным животным с первичной костной пластикой реберным аутотрансплантатом внутримышечно вводился раствор цефтриабола (ООО «АБОЛмед», Россия) в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции один раз в день.
В 5-ой серии опытов экспериментальным животным с первичной костной пластикой реберным аутотрансплантатом на 1, 3, 5, 7 сутки после операции проводилось инъекционное введение окситоцина (в окружающие дефект мягкие ткани) один раз в день в разовой дозе 1МЕ и инъекционное введение раствора цефтриабола внутримышечно в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции один раз в день.
Животные выводились из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом на 1, 3, 5, 7, 15 сутки после операции, по 3 особи в каждой серии и в те же сроки в контрольной группе.
иммуноцитохимии и морфометрии исследованы фрагменты нижней челюсти в области костных ран с окружающими мягкими тканями и фрагменты гипоталамуса и нейрогипофиза с дальнейшим статистическим анализом количественных параметров.
Для светооптических исследований материал фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, спирт - формоле, затем проводили декальцинацию костных объектов в 4% растворе ЭДТА (трилона В) в течение 10 сут и дофиксировали вновь в 10% растворе нейтрального формалина. После фиксации материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в целлоидин - парафин. Приготовление серийных срезов толщиной 5-6 мкм осуществлялось на ротационном микротоме МПС-2.
Депарафинированные срезы были окрашены гематоксилином Майера и эозином. Для выявления гликогена и нейтральных мукополисахаридов (гликопротеидов) проведена перийодат-Шифф реакция по Мак-Манусу, для определения глюкозаминогликанов Гистохимические исследования осуществлялись с использованием энзиматических нейросекреторных клеток крупноклеточных ядер гипоталамуса применяли окраску гистологических срезов паральдегид-фуксином по Гомори-Габу, в модификации А.Л.
Поленова (1994) с оценкой экспрессии синтеза протеина р53 и антиапоптотического белка bсl-2. При этом объекты фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, обезвоживали и заливали в парафин. Гистологические срезы инкубировали с соответствующими моноклональными антителами (наборы «Kit» фирмы ДАКО, Дания) в рабочем разведении 1:50. Докрашивание ядер клеток проводили 0,5% раствором метиленового зеленого на 0,1 М ацетатном буфере. Для визуализации структур использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод (Киясов А.Л., 2001).
Подсчет окрашенных иммунопозитивных клеток (в %) осуществляли при просмотре не менее 1000 клеток в различных полях зрения микроскопа МБИ – 15, 25мм, ув. об 90, ок 10.
Для электронной микроскопии фиксация материала осуществлялась в растворе глютарового альдегида на S-коллединовом буфере (рН 7,2 - 7,4) и последующая постфиксация - по G. Millonig (1961). Материал был обезвожен при комнатной температуре в ацетоне возрастающей концентрации и помещн в смолу ЭПОН 812. С каждого блока на ультратоме LKВ-5 (Sweden-Bromma) были получены полутонкие (1мкм) и ультратонкие (40-60 нм) срезы. Полутонкие срезы окрашены метиленовым синим и основным фуксином по прописи Sato и Shamoto (1973). Полутонкие срезы использовались при подготовке блоков к заточке перед изготовлением ультратонких срезов, а также для анализа тканей и клеточной организации на световом уровне.
Ультратонкие срезы приготовлены с предварительным двойным контрастированием в насыщенном спиртовом растворе уранилацетата и цитрате свинца (Reynolds, 1963). Для изучения ультратонких срезов использован электронный микроскоп ЭМВ 100АК.
Фотографирование структур проводилось при увеличении от 5400 до 40000.
Морфометрия структур выполнена на препаратах и электронограммах с использованием стандартных окулярных сеток Г.Г. Автандилова (1999), а также винтового окулярмикрометра МОВ-1-15у 4.2.
Полученные количественные параметры обрабатывались с помощью компьютерной программы Statistika 6.0 и представлены в виде: среднее ± стандартная ошибка среднего. Сравнение между группами проводили с учетом характера распределения параметрических (t -критерий Cтьюдента) и непараметрических (u критерий - Манна-Уитни) методами. Достоверными считались отличия при p0,05(95%).
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Повреждение костной ткани всегда сопровождается не только местными, но и общими изменениями, регулируемые гипоталамическими нейроэндокринными механизмами, включающими включение адаптационных систем, мы провели оценку гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной нонапептидергической системы (ГГНС) экспериментальных животных, как известно играющей ведущую роль в компенсации нарушенного клеточного и тканевого гомеостаза. Изложение полученных результатов представлено в аспекте сформулированной цели диссертационного исследования, определяющей установление закономерностей гипоталамической нейроэндокринной регуляции репаративного остеогенеза нижней челюсти экспериментальных животных.Данный аспект явился ключевым, поскольку исследования адаптивной роли гипоталамической нонапептидергической нейросекреции на сегодняшний день являются приоритетными, связанными с широким диагностическим и особенно терапевтическим использованием нонапептидов (в частности, окситоцина), как важнейших регуляторов многих биологических процессов, включая репаративные гистогенезы (Поленов А.Л., 1994; Стадников А.А., Бухарин О.В., 2012).
Основной аспект был сделан на установлении адаптивной роли гипоталамического нонапептидергического пути в обеспечении процессов пролиферации, роста и морфогенетической перестройки, а также поддержании клеточного и тканевого гомеостаза.
Морфофункциональная оценка реорганизации нонапептидергических гипоталамических нейросекреторных центров в условиях моделирования сквозного дефекта нижней челюсти крыс, в том числе при замещении дефектов реберным В этом разделе диссертационного исследования мы приводим данные о структурнофункциональной реорганизации нейросекреторных клеток (НСК) супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса у экспериментальных животных с моделированием сквозного дефекта нижней челюсти, включая серии опытов с замещением дефектов реберным аутотрансплантатом, в том числе при местном применении окситоцина. Следует заметить, что морфофункциональные изменения НСК соответствующих ядер гипоталамуса, носили в основном однотипный характер (по срокам наблюдений), имея отличия в серии опытов с использованием окситоцина.
Результаты наших исследований (во всех сериях экспериментов) позволили установить интенсивное (гиперсекреция) функционирование НСК изученных ядер гипоталамуса.
Основная группа клеток («светлые-Гомори позитивные»), имели ядра, богатыми эухроматином и ядрышки нуклеолонемного характера (на стадиях 3-5 сут эксперимента).
Их гранулярная эндоплазматическая сеть представлена широкими канальцами. Цистерны пластинчатого комплекса Гольджи расширены, митохондрии аксонов НСК крупные со светлым матриксом. При этом указанные НСК характеризуются усилением выведения секреторных гранул из перикарионов. Последние и все их ультраструктурные компартменты увеличены в размерах. Рыхлые ядрышки зачастую занимают положение возле кариолеммы.
Мы показали, что через 3-7 суток после моделирования костного дефекта в нижней челюсти крысы в составе крупноклеточных ядер гипоталамуса (супраоптических и паравентрикулярных) появляются светлоокрашиваемые по Гомори – Габу нейросекреторные клетки. Для них характерна гипертрофия перикарионов, ядер, ядрышек и шероховатого эндоплазматического ретикулума. Хроматин ядер деконденсирован, ядрышки рыхлые, а иногда вакуолизированы; пластинчатый комплекс Гольджи занимает значительный объем цитоплазмы. Секреторных гранул в перикарионах и аксонах мало, так как они быстро высвобождаются в гемокапилляры нейрогипофиза и срединного возвышения.
Следует отметить, что через 14 суток экспериментов (1-я и 2-я серии) отмечены нейросекреторные клетки «длительной гиперсекреции и истощения». Эти клетки имеют сильно гипертрофированные светлые, «набухшие» перикарионы и округлые ядра, бедные хроматином.
Канальцы эндоплазматического ретикулума, теряя рибосомы, трансформируются в вакуоли диаметром 300-900 нм. В подобных клетках мало свободных рибосом, а также нарушена ультраструктура митохондрий и аппарата Гольджи. Наиболее характерным для этих нейросекреторных клеток является присутствие значительного числа лизосом, аутофагических вакуолей и мультиламелярных телец.
В эти же сроки в составе супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса увеличивается содержание пикноморфных нейросекреторных клеток с признаками «физиологической дегенерации». Они имеют угловатую, различной степени сжатости форму тела и пикнотические ядра. Канальцы шероховатого эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи расширены, митохондрии набухшие, рибосом крайне мало. Надо полагать, что данные клетки являют собой терминальное состояние нейросекреторных элементов нонапептидергических ядер гипоталамуса.
В сроки 3-7 сутки экспериментов на уровне нейрогипофиза отмечаются ультраструктурные признаки, свидетельствующие об активном высвобождении нейросекреторных гранул в общий кровоток. Это подтверждается увеличением количества гранул и синаптических пузырьков, концентрирующихся в активных зонах, нарастанием размеров митохондрий и снижением электронной плотности их матрикса.
экспериментальных животных мы отметили изменения нейросекреторных клеток супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса, свидетельствующие об «истощении» клеточных элементов и в ряде случаев феномен накопления и депонирования нейрогормональных субстратов на уровне аксовазальных контактов в нейрогипофизе и зоне срединного возвышения (рис 1).
При этом в НСК депонирование секреторных гранул сопровождается наличием единичных синаптических пузырьков и мелких митохондрий с уплотненным матриксом, имеющих признаки деструктивных изменений. Терминали аксонов подобных клеток, элементам, но и дегенирирующим функционально активным клеткам. В ряде случаев НСК апоптозного характера (рис 2).
Рис. 1 Терминали аксонов нейросекреторных клеток крупноклеточных ядер гипоталамуса (переполнены секреторными гранулами).
Стадии: 14 сут (замещение сквозного дефекта нижней челюсти реберным аутотрансплантатом). Электронограмма Ув. х Рис.2 Апоптозно измененное ядро нейросекреторной клетки супраоптического ядра гипоталамуса крысы. Стадия: 14 сут (замещение сквозного дефекта нижней челюсти реберным аутотрансплантатом). Электронограмма Ув. х В более поздние сроки эксперимента (15 сут) НСК крупноклеточных ядер гипоталамуса имели сильно гипертрофические и набухшие перикарионы также округлые пузыревидные ядра, бедные хроматином. Канальцы эндоплазматичекого ретикулума, теряя рибосомы, превращались в вакуолеподобные ультраструктуры диаметром 900 нм. В таких клетках мало свободных рибосом (полисом) и существенно нарушена структура аппарата Гольджи и митохондрий. Наиболее характерным для данных клеток супраоптических паравентрикулярных ядер гипоталамуса является большое количество значительно возрастает численность пикноморфных НСК. Вместе с тем, на уровне нейрогипофиза и срединного возвышения подбугорья возрастает число аксонов НСК, переполненных секреторными гранулами. Данное обстоятельство, несомненно, свидетельствует о «депонировании» нейросекрета вследствие торможения экструкции нонапептидов на уровне терминалей аксонов.
В своей совокупности мы сделали заключении о том, что при моделировании сквозного дефекта нижней челюсти крысы, в том числе и при замещении дефекта аутокостным трансплантатом, на уровне нонапептидергических нейросекреторных центров гипоталамуса возникает состояние «длительной гиперсекреции и истощения», что описано ранее при оценке ГГНС в условиях чрезвычайного напряжения организма (Поленов А.Л., 1994; Стадников А.А., 2001).
Особо следует сделать акцент на том, что описанные изменения НСК укладываются в морфологическую картину «физиологический дегенерации», что подтверждается в наших экспериментах резким возрастанием пикноморфных клеток. Возможно, что часть подобных клеток находится в обратимом состоянии (паранекрозе).
аутотрансплантатом, включая местное применение окситоцина (в том числе в сочетании с антибиотиком) мы отметили иной характер структурно-функциональной реорганизации крупноклеточных ядер гипоталамуса. Так, на фоне гипертрофических и гиперпластических проявлений НСК, мы установили ультраструктурные признаки «репарации» мембранных компартментов данных клеток. При этом главным признаком НСК супраоптических и паравентрикулярных ядер являлись исключительное обилие свободных рибосом (полисом), адекватное состояние гранулярной эндоплазматической сети, аппарата Гольджи и митохондрий. Все это свидетельствовало об интенсивном синтезе структурных протеинов, крайне необходимых для внутриклеточной репарации и адекватности нейросекреции.
Репаративный остеогенез в нижней челюсти экспериментальных животных при Создание нами экспериментальной модели сквозного дефекта нижней челюсти крыс была продиктована необходимостью дальнейшего исследования регенерационного остеогенеза в аспекте его гипоталамической нонапептидергической регуляции дифферонной и гистионной структурно-функциональной организации, что является актуальным для современной гистологии, клеточной биологии и биотехнологии (Данилов Р.К. с соавт., 2008; Деев Р.В., 2008).
Прежде, чем приступить к описанию фактического материала по изучению репаративного остеогенеза в условиях замещения дефектов нижней челюсти реберным аутотрансплантатом (в том числе и при местном введении окситоцина), мы сочли необходимым представить сведения о гистологической характеристике раневого процесса в моделируемых условиях без лечебной коррекции.
Данная серия в наших исследованиях явилась контрольной. При этом мы преследовали цель установления гистологических критериев репаративного остеогенеза, в аспекте их дальнейшего сопоставления аналогичными данными, полученными в последующих вариантах эксперимента. Совокупность полученных результатов и их морфофункциональный анализ позволили сделать заключение об этапности репаративной регенерации костных структур нижней челюсти крыс.
Первый этап – 1-3 сутки после моделирования дефекта. В это время развивается острое воспаление в тканях и выраженная резорбция в резецированных зонах костных фрагментов нижней челюсти, за счет активизации остеокластов. В динамике стадии альтерации вследствие повреждения костных структур нарастают морфологические изменения в виде дистрофий, а затем некроза костных балок, надкостницы, костномозговых элементов. Продукты, накапливающиеся в зоне местного нарушения гомеостаза, приводят к существенным изменениям проницаемости стенок сосудов микроциркуляторного русла и экстравазации плазмы и форменных элементов крови (плазматическая экссудация и клеточная инфильтрация). К нейтрофильной инфильтрации вскоре присоединяется макрофагальная (моноцитарного генеза), что характеризует собой начало отграничения некротических участков от жизнеспособных тканей.
Второй этап репаративного остеогенеза – 3-7 сутки с момента моделирования сквозного дефекта нижней челюсти. В этот период дегенеративно-воспалительные процессы сменяются продуктивной (пролиферативной) фазой воспаления. Между участками резецированной кости, в том числе и в области возникшей гематомы, происходит врастание малодифференцированной ткани (грануляционной).
соединительнотканной мозолью» (Струков А.И., 1983). Для нее характерно наличие гемокапиллярных петель, окруженных фибробластами, макрофагами, лимфоцитами и плазмацитами.
Следует особо подчеркнуть то обстоятельство, что формирующаяся грануляционная ткань не уменьшает резорбцию костной ткани в зоне дефекта нижней челюсти, что очевидно связано с активной деятельностью макрофагальных элементов.
Третий этап – 7-14 суток после формирования сквозного дефекта формируется пул остеобластов вокруг микроциркуляторной сети сосудов нижней челюсти. Вдоль них образуются первичные костные балочки, характерные для ретикулофиброзной костной ткани. Формирующаяся сеть трабекул была связана с краями костной раны и включала в свой состав 8,3 ± 0,6% остеобластов, 5,7 ± 0,7% остеоцитов, 3,9 ± 0,5% остеокластов.
Таким образом, между структурами резецированной кости образуется предварительная костная мозоль без признаков ее трансформации в пластинчатую костную ткань. При этом значительная часть остеобластов подвергается атрофии и постепенно исчезает из зоны повреждения нижней челюсти.
Через 7-14 сут эксперимента у животных отмечены (в области дефекта) значительно расширенные гаверсовы каналы без четко идентифицированных кровеносных сосудов.
Иногда каналы остеонов были заполнены небольшим количеством рыхлой соединительной ткани с признаками полиморфноклеточной инфильтрации с преобладанием нейтрофилов и эозинофилов. Здесь же присутствовали остеокласты, резорбирующие костные структуры.
Со стороны периоста преобладали разрастания плотной волокнистой соединительной ткани, колллагеновые волокна которой не имели упорядочной ориентации. Артериолы в регенерате имели утолщенную стенку за счет фиброзных изменений их средней оболочки. Формирующаяся ретикулофиброзная костная ткань образует разрозненные островки, зачастую окружая некротизированные костные фрагменты. Последние подвергались лизированию со стороны остеокластов. Признаков органотипического остеогенеза не обнаружено. В краевых участках поврежденной нижней челюсти сохранялись признаки выраженного остеопороза (на стадиях 7-14 сут эксперимента).
Особенно эти явления наблюдались в кортикальной пластинке, которая резко истончилась. Надкостница в данных участках была утолщена в основном за счет фиброзного слоя, тогда как сосудистый ее слой был слабо выражен.
В описанных зонах определены участки гиалиновой хрящевой ткани со слабо выраженными участками эндохондрального окостенения. Количество остеобластов было не велико. Напротив остеокласты продолжали быть активными, формируя обширные резорбционные лакуны, в том числе и в кортикальной пластинке нижней челюсти экспериментальных животных.
Таким образом, большая часть раневого дефекта к 15 сут была заполнена плотной волокнистой соединительной тканью с элементами гиалинового хряща.
иммуноцитохимических исследований показала, что восстановление целостности резецированной кости нижней челюсти происходит путем пролиферации клеток камбиального (остеобластического) слоя надкостницы и малодифференцированных плюрипотентных костномозговых клеток. Вместе с тем, в данном процессе участвуют адвентициальные (периваскулярные) клетки врастающих кровеносных сосудов. С другой стороны в зоне раневого дефекта часто регистрируются кровеносные сосуды с признаками тромбоза.
Следует особо отметить то обстоятельство, что остеогенез (в условиях отсутствия в раневом ложе аутокости) протекал по десмальному типу, то есть с формированием к 3- суткам эксперимента волокнистой соединительной ткани, трансформирующуюся затем к 10-14 суткам в плотную соединительную ткань, не обеспечивающую эффективную (механическую) фиксацию в зоне дефекта кости нижней челюсти.
В таком сформированном рубцовом соединительнотканном регенерате идентифицированы функционально специализированные фибробласты, а также фиброциты, лимфоциты, жировые клетки в окружении многочисленных гемокапилляров, проявляющих признаки васкулогенеза. При этом клетки фибробластического дифферона и эндотелиоциты микроциркуляторного русла демонстрировали признаки апоптоза. Так уровень экспрессии синтеза протеина р53 и каспазы 9 был в 2,5 – 3,7 раза выше чем у интактных (контрольных) животных.
Эти факты, несомненно, свидетельствуют о том, что раневое повреждение костной ткани у экспериментальных животных, безусловно, сопровождается общими и специфическими особенностями адаптационно-компенсаторных процессов, направленных на выравнивание клеточного и тканевого гомеостаза поврежденной костной ткани.
Описывая морфологические процессы в раневой области, мы сделали особый акцент на оценке: 1) катаболизма тканевых структур, дифференцировке и пролиферации клеточных элементов, 2) васкулогенеза, 3) новообразовании клеток, 4) минерализации и трансформации первичного регенерата.
В серии экспериментов с дефектами нижней челюсти без аутотрансплантации при близком сопоставлении костных фрагментов в зоне дефекта наблюдаются их первично либо вторично задержанные сращения. При этом на них отмечается формирование хрящевой ткани без образования костных балок.
сопровождается образованием минимального количества первичных клеточных структур.
Тем более что при наличии щели между прочно фиксированными неподвижными костными участками резецированной нижней челюсти имеет место частичное сращение в зоне сосудистых структур. Данное обстоятельство приводит к лимитированию образования периостальной костной мозоли, что необходимо для обездвиживания сегментов нижней челюсти и их последующего сращения.
В наших исследованиях мы использовали костный аутотрансплантат для целей репаративного остеогенеза в зоне сквозного дефекта нижней челюсти экспериментальных животных.
При этом мы, прежде всего, исходили из того, что в формировании клеточного регенерата (костной мозоли) большое значение имеет соблюдение механических факторов точного сопоставления. Данные условия были реализованы нами в эксперименте, за счет фиксации на стыке резецированных отделов нижней челюсти.
В случае использования реберного аутотрансплантата мы отметили интенсивное врастание микроциркуляторного русла в краевую зону костного дефекта, что привносило в раневую область периваскулярные камбиальные клетки.
Нами было показано, что в зоне оперативного вмешательства развивается (через 1суток эксперимента) выраженная эндостальная реакция. Одновременно имеет место активизация остеокластов, осуществляющих резорбцию костных структур.
Резорбционные полости заполняются рыхлой соединительной тканью, постепенно превращающейся в фиброзную ткань. При выраженной подвижности резецированных участков может образоваться ложный сустав с тканевыми элементами хрящевой ткани.
В наблюдаемых случаях, как правило, диастаз ложного сустава заполняется волокнистой соединительной тканью, образующейся в условиях пролиферации стромы красного костного мозга. Новообразованные костные балки имеют признаки выраженной лакунарной резорбции.
Имплантированная аутокость ребра инициирует развитие соединительной ткани в области трансплантационного ложа. При этом он претерпевает существенную структурную реорганизицию. Хондроциты, хондробласты демонстрируют признаки апоптоза. Данные клетки характеризуются кариопикнозом и локальным кариорексисом и плазморексисом. При этом происходит дискомплексация хондромукоидных и хондроитиновых волокон.
В этой связи мы обратили внимание на то, что повреждение костной ткани, в том числе при замещении дефекта нижней челюсти реберным аутотрансплантатом, сопровождается морфогенетическими процессами, не всегда реализующими адаптационные и компенсаторные потенции тканей челюстно-лицевой области.
Так, в моделируемых экспериментальных условиях не наблюдалось надежного и постоянного обездвиживания в зоне дефекта нижней челюсти, в том числе при сохранении источников репаративного остеогенеза. Надо полагать, что регенерация костной ткани, а также сращение костных фрагментов происходило без формирования органотипической хрящевой и костной ткани (без формирования костных балок и периостальной мозоли).
Тем не менее, мы отмечаем то обстоятельство, что замещение костного дефекта нижней челюсти реберным трансплантатом существенно минимизирует размер щели в зоне дефекта между прочно фиксированными неподвижными костными фрагментами.
Экспериментально-гистологическая оценка структурно-функциональных изменений при сквозном дефекте нижней челюсти животных с замещением дефектов реберным аутотрансплантатом в условиях лечебной коррекции (местное применение В регуляции репаративной регенерации после моделирования сквозных дефектов нижней челюсти существенное значение имеют нейроэндокринные факторы, которые на клеточном и тканевом уровнях реализуют механизмы элементарных процессов остеогенеза (регуляции камбиальности и дифференцировки остеобластов, остеокластов, их взаимоотношений с фибробластическим диффероном и кровеносными сосудами, оценка апоптоза). При нарушениях данных регуляторных факторов происходит неадекватное ремоделирование костной ткани с формированием функционально неполноценного регенерата.
В наших исследованиях мы сделали акцент на установлении роли и значимости одного из важных адаптогенных гипоталамических нонапептидов (окситоцина) на процессы репаративного остеогенеза резецированных структур нижней челюсти крыс в условиях замещения дефектов аутореберным трансплантатом. Для сравнения были использованы объекты (фрагменты костной ткани экспериментальных животных контрольной серии, а также серий опытов с применением антибиотика).
Нами было показано, что местное применение окситоцина (без замещения костного дефекта использованным трансплантатом) оптимизировало стадии репаративного остеогенеза. Он включал в себя скопления остеогенных элементов – остеобластов и костных трабекул, ориентированных вдоль пучков коллагеновых волокон (рис 3).
Формирующаяся ретикуло-фиброзная костная ткань состоит из первичных костных регенерата регистрируются хондробласты и малодифференцированные хондроциты. К суткам эксперимента в этих участках формируются типичные изогенные группы хондроцитов, продуцирующие межклеточный матрикс и выступающие за край костного дефекта нижней челюсти (рис 4).
В этой связи, можно предположить, что окситоцин, вероятно, создает условия для реализации в зоне раневого дефекта эволюционно более древних свойств репарации неблагоприятный момент, который может привести к образованию механической несостоятельности регенерата.
Полученные нами данные, безусловно, свидетельствуют о фазном характере пролиферативного и апоптотического потенциалов остеобластов в регенерате, а также о коррегирующем влиянии окситоцина на соотношение числа камбиальных клеток с апоптозной доминантой.
Мы обратили также внимание на оценку состояния гистологических структур нижней челюсти в области пограничной с зоной ее дефекта. Так введение окситоцина ремоделирования остеокластической резорбции. При этом отсутствовали резорбционные лакуны, как показатели выраженного остеопороза и деминерализации (рис 6).
Рис. 3. Фрагмент остеорегенерата (7 сут эксперимента с введением окситоцина). Фиксация: 10% раствор нейтрального формалина. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. об. 40. ок. Рис. 4. Участок хондрогенеза в зоне остеорегенерации через 14 сут эксперимента. Фиксация: спиртформол. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. об. 40, ок. Рис. 5. Участок остеорегенерата через 14 сут эксперимента с введением окситоцина. Фиксация:
спирт-формол. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. об. 20, ок. Рис. 6. Структура остеорегенерата через 14 сут эксперимента с введением окситоцина. Фиксация:
10% раствор нейтрального формалина Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. об. 40, ок следующие результаты (табл. 2,3).
Иммуноцитохимическая характеристика остеобластов в регенерате нижней челюсти (% иммунопозитивных клеток), 3 сут эксперимента Создание сквозного дефекта нижней челюсти с последующей 1,1±0,07 0,8 ±0,02 1,7±0,13 0,9±0, первичной костной пластикой рберным аутотрансплантатом и внутримышечным введением раствор цефтриабола в разовой дозе мг во время и ежедневно после операции один раз в сутки Создание сквозного дефекта нижней челюсти с последующей 0,8±0,01 2,2±0,07 0,9±0,06 8,1±0, первичной костной пластикой рберным аутотрансплантатом и инъекционным введением во время и на 1,3, 5, 7 сутки после операции окситоцина в разовой дозе 1ЕД 1 раз в сутки в окружающие мягкие ткани Создание сквозного дефекта нижней челюсти с последующей 0,7±0,03 3,4±0,13 0,6±0,02 9,8±1, первичной костной пластикой рберным аутотрансплантатом и введением во время и на 1, 3, 5, 7 сутки после операции, в окружающие дефект мягкие ткани, окситоцина один раз в сутки, в разовой дозе 1ед, и раствор цефтриабола внутримышечно в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции один раз в сутки Иммуноцитохимическая характеристика остеобластов в регенерате нижней челюсти крыс в условиях замещения дефектов реберным аутотрансплантатом (% Создание сквозного дефекта нижней челюсти с последующей 0,6±0,02 0,3±0,01 0,8±0,04 0,4±0, первичной костной пластикой рберным аутотрансплантатом и внутримышечным введением раствор цефтриабола в разовой дозе мг во время и ежедневно после операции один раз в сутки Создание сквозного дефекта нижней челюсти с последующей 0,4±0,01 2,2±0,04 0,2±0,01 12,9±1, первичной костной пластикой рберным аутотрансплантатом и инъекционным введением во время и на 1,3, 5, 7 сутки после операции окситоцина в разовой дозе 1ЕД 1 раз в сутки в окружающие мягкие ткани Создание сквозного дефекта нижней челюсти с последующей 0,2±0,01 3,0±0,07 0,1±0,01 21,6±1, первичной костной пластикой рберным аутотрансплантатом и введением во время и на 1, 3, 5, 7 сутки после операции, в окружающие дефект мягкие ткани, окситоцина один раз в сутки, в разовой дозе 1ед, и раствор цефтриабола внутримышечно в разовой дозе 15 мг во время и ежедневно после операции один раз в сутки В своей совокупности, полученные, нами данные свидетельствуют о том, что включение в комплекс лечебных мероприятий окситоцина оказывает существенное оптимизирующее воздействие на репаративный остеогенез. И механизм этого влияния определяется коррекцией элементарных процессов гистогенеза на уровне экспрессии прои антиапоптотических генов клеток костной ткани.
Следует особо подчеркнуть то обстоятельство, что сочетанное применение окситоцина и антибиотика (цефтриабола) приводило к потенцированию эффекта оптимизации фаз воспалительного процесса в зоне аутотрансплантата. Это проявилось в экспрессии синтеза протеина р53, подавлении ферментного каскада, реализации программированной гибели этих клеток (по показателю экспрессии белка caspasa 3).
Одновременно в регенерате возрастала активность антиапоптотического гена bcl-2 и гена Ki-67, определяющего пролиферативный компонент репаративного остеогенеза.
ВЫВОДЫ
1. Оптимизация регенерации костной ткани при моделировании дефекта нижней челюсти крыс коррелирует с морфофункциональным состоянием крупноклеточных ядер гипоталамуса.2. Замещение сквозного дефекта нижней челюсти экспериментальных животных реберным костным аутотрансплантатом в большинстве случаев сопровождается резорбцией костных структур, заполнением зоны трансплантации фиброзной тканью без выраженной остеорегенерации. Эти процессы происходят на фоне длительной гиперсекреции и истощения нонапептидергической ГГНС.
показателями экспрессии про- и антиапоптотического генов клеток являются одним из доказательств оценки эффективности репаративного остеогенеза.
4. Сочетанное применение окситоцина и антибиотика оптимизирует фазы воспалительного процесса в зоне аутотрансплантата, что проявилось в понижении апоптозной доминанты остеобластов и возрастании активности антиапоптотического гена bcl-2 и гена Ki-67, определяющего пролиферативный компонент репаративного остеогенеза.
5. В условиях сквозного дефекта нижней челюсти у экспериментальных животных с последующим замещением моделируемых дефектов реберным аутотрансплантатом местное применение окситоцина, в том числе с антибиотиком, коррегирует процессы репаративного остеогенеза, оказывает существенное оптимизирующее воздействие на репаративный остеогенез.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Полученные экспериментально-гистологические данные обосновывают целесообразность разработки и внедрения в практику клинической стоматологии нового способа лечения костных дефектов челюстных костей, включающего местное применение гипоталамического нонапептида окситоцина.Морфологические и ультраструктурные данные об изменениях, выявленных в области сквозного дефекта нижней челюсти (с последующим замещением реберным аутотрансплантатом) и ГГНС углубляют знания о репаративных остеогенезах, роли и значимости гипоталамической нейросекреции, что следует учитывать при лечении пациентов с дефектами нижней челюсти.
Полученные результаты, обосновывающие новый эффективный способ оптимизации репаративных гистогенезов в области сквозных дефектов нижней челюсти дает возможность его доклинической апробации.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.Волков, Ю. О. Особенности репаративных гистогенезов при костной аутопластике дефектов нижней челюсти в эксперименте / Ю. О. Волков, А. А. Стадников, А. А.Матчин // Информационный архив. - 2011. - Т. 5. - №4. - С. 49 – 52.
2.Матчин, А. А. Клиническое и экспериментально-морфологическое обоснование новых медицинских технологий в челюстно-лицевой хирургии / А. А. Матчин, А. А. Стадников, Ю. О. Волков, И. А. Михайлова, С. Х. Кириакиди // Информационный архив. - 2011. - Т. 5.
- №4. - С. 71 – 76.
3.Волков, Ю. О. Применение окситоцина для оптимизации репаративных гистогенезов при травматических повреждениях нижней челюсти крыс / Ю. О.
Волков, С. Х. Кириакиди // Морфология. – 2012. – Т. 141. - №3. - С. 39.
4.Волков, Ю. О. Оптимизация репаративных гистогенезов челюстно-лицевой области (ЧЛО) в аспекте гипоталамической нейроэндокринной регуляции / Ю. О. Волков, И. А.
Михайлова, В. Л. Петренко, С. Х. Кириакиди, А. А. Матчин, А. А. Стадников // Медицинский журнал Западного Казахстана. - 2012. - №3. (35). - С. 45.
5.Волков, Ю. О. Исследования репаративных процессов при сквозных дефектах нижней челюсти с местным применением окситоцина / Ю. О. Волков, А. А. Матчин, А. А.
Стадников, С. Х. Кириакиди, Информационный архив. - 2012. - Т. 6. - № 4. - С. 21-23.
6.Волков, Ю. О. Экспериментально-морфологическое обоснование применения гипоталамических нейропептидов для оптимизации репаративных гистогенезов при травмах и дефектах нижней челюсти / Ю. О. Волков, В. Н. Барков, С. Х. Кириакиди, А. А.
Матчин, И. А.Михайлова // XVII Международная конференция челюстно-лицевых хирургов «Новые технологии в стоматологии». - СПб., 2012. - С. 40 - 41.
7.Волков, Ю. О. Экспериментально-гистологические исследования репаративных процессов при повреждениях челюстно-лицевой области в условиях инфицирования (нейробиологические аспекты) / Ю. О. Волков, А. А. Матчин, А. А. Стадников, И. А.
государственного университета. - 2012. - №1. (137) – С. 181-184.
8.Матчин, А. А. Опыт лечения осложнения после пластики послеоперационного дефекта нижней челюсти титановой пластиной, А. А. Матчин, Б. А. Исайчев, В. Н.
Барков, Ю. О. Волков // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. Т. 5. - №3. – С. 589-592.
9.Матчин, окситоцина в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии / А. А. Матчин, А. А.
Стадников, И. А. Михайлова, В. Л. Петренко, Ю. О. Волков, С. Б. Северинова, С. В.
Гречихина // XVIII Международная конференция челюстно-лицевых хирургов «Новые технологии в стоматологии». – СПб., 2013. – С. 111- 112.
посттравматической регенерации нижней челюсти при местном применении окситоцина / А. А. Матчин, Ю. О. Волков, С. Х. Кириакиди // Морфология. – 2013. – Т. 144. - №5. - С. 94 - 95.
«