На правах рукописи

Гуляев Иван Владимирович

Анализ фармацевтических веществ методами газовой хроматомасс-спектрометрии и капиллярной хромадистилляции - массспектрометрии

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва - 2012

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Ревельский Игорь Александрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Буряк Алексей Константинович доктор химических наук, профессор Яшин Яков Иванович

Ведущая организация:

Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева РАН, г. Москва

Защита состоится 30 мая 2012 года в 15 ч. 00 мин. в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д.501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им.

М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Торочешникова И.И.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Одним из важнейших показателей качества фармсубстанции и фармпрепарата на ее основе является состав (качественный и количественный) входящих в него примесей. Во-первых, знание о составе примесей необходимо для обеспечения безопасности – многие примеси могут быть токсичны. В некоторых случаях высокотоксичные примеси даже на уровне 10-3 - 10-4 % могут оказывать пагубное влияние на здоровье пациента. В то же время, согласно существующим фармакопейным методикам любые примеси с концентрацией ниже 0,1% считаются допустимыми, они не идентифицируются, и определяется лишь их общее содержание. Во-вторых, состав примесей является показателем качества и подлинности фармпрепарата. В общем случае число и состав примесей, входящих в состав фармсубстанций - чистых органических веществ никогда не бывает заранее и полностью известен.

При определении состава неизвестных примесей в чистых органических веществах, к которым относятся и фармсубстанции, прежде всего необходимо обнаружение числа примесей, присутствующих в образце, затем должна быть проведена их идентификация и только потом - их количественное определение. Очевидно, что правильность анализа определяется в первую очередь числом обнаруженных примесей.

Основными методами анализа фармпрепаратов и субстанций на содержание заданных примесей являются ВЭТСХ и ВЭЖХ. Предел обнаружения этими методами в стандартных 10-2 – 10-1 %.

фармакопейных методиках составляет Сочетание ВЭЖХ с массспектрометрией (МС) используют в большинстве случаев для подтверждения известных примесей, присутствующих в фармацевтической продукции. ГХ используется гораздо реже (для обнаружения остатков растворителей), однако этот факт является неоправданным, так как анализ Европейской Фармакопеи показал, что около 70 % фармакологически активных веществ, входящих в состав различных фармацевтических препаратов, и, следовательно, примесей, содержащихся в них, принципиально могут быть определены методом ГХ. При использовании дериватизации в сочетании с ГХ список этих веществ может быть значительно расширен.

В то же время, обнаружение и идентификация неизвестных примесей в чистых высококипящих веществах (к которым относятся фармсубстанции), когда концентрация основного компонента много больше, чем примесей, являются гораздо более сложной задачей, чем обнаружение заданных примесей. Обнаружение таких примесей с использованием метода ВЭЖХ/МС затрудняет наличие примесей, содержащихся в самом элюенте. Идентификация с использованием метода ВЭЖХ/МС также существенно ограничена вследствие потери информации о ряде компонентов смеси из-за различных ионмолекулярных реакций, связанных с примесями в элюенте, а также регистрации только эффективность разделения методом ВЭЖХ/МС значительно ниже, чем ГХ/МС. Метод ГХ/МС(ЭИ) позволяет проводить обнаружение и идентификацию примесей более достоверно. Наличие обширных баз данных масс-спектров электронной ионизации существенно расширяет возможности идентификации по сравнению с ВЭЖХ/МС.

Использование дериватизации также значительно расширяет диапазон обнаруживаемых соединений. Однако, на сегодняшний число работ по дериватизации фармсубстанций и их ГХ/МС(ЭИ) определению очень ограничено.

При анализе чистых веществ на примеси актуальным является увеличение селективности разделения, особенно в тех случаях, когда примеси элюируются одновременно с основным компонентом, либо разделены с ним частично. В этом случае даже возможности капиллярной газовой хроматографии существенно ограничены, особенно когда температура кипения основного компонента высока (150-300°С и более). Перспективным, по нашему мнению, является увеличение селективности обнаружения за счет сочетания капиллярной хромадистилляции с ГХ/МС(ЭИ). В применении к анализу фармсубстанций (и других чистых высококипящих органических веществ), использование капиллярной хромадистилляции (КХД) может позволить вводить большие количества фармсубстанции в хромадистилляционную колонку (по сравнению с ГХ и ВЭЖХ) и, соответственно, примесей в разделительную капиллярную колонку, а значит обнаруживать в анализируемой пробе большее количество примесей и на более низком уровне. Следует заметить однако, что распределение примесей в процессе КХД очень мало изучено (в отличие от ГХ). Метод КХД никогда ранее не использовался для анализа фармацевтических субстанций и других чистых среднелетучих веществ на содержание примесей.

Важной задачей после обнаружения числа неизвестных примесей методом ГХ/МС остается их идентификация. При отсутствии масс-спектров электронной ионизации аналитов в библиотеке масс-спектров (для многих фармсубстанций и их примесей эти масс-спектры отсутствуют) возможности идентификации существенно ограничены. В связи с этим представляло интерес изучение возможности идентификации таких соединений при использовании компьютерного моделирования масс-спектров соединений-кандидатов, для которых брутто-формула совпадает с брутто-формулой неизвестного соединения.

Целью настоящей работы являлось исследование возможности дериватизации ряда фармсубстанций различными реагентами и обнаружения дериватов методом ГХ/МС. Кроме того, целью работы являлась разработка нового подхода к обнаружению примесей в чистых веществах средней летучести, к которым относятся фармсубстанции и их дериваты, основанного на КХД в сочетании с масс-спектрометрией и с ГХ/МС, и изучение возможности идентификации неизвестных аналитов с использованием моделирования массспектров электронной ионизации, основанного на использовании специальной программы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить возможность получения летучих производных ряда фармацевтических субстанций различного строения, содержащих различные функциональные группы, обнаружение и выявить наиболее универсальные реагенты;

• разработать способ анализа, основанный на сочетании КХД и масс-спектрометрии (ЭИ) и прибор для его осуществления;

• с использованием собранного прибора для КХД/МС(ЭИ) изучить возможность селективной регистрации примесей различной летучести в среднелетучих органических веществах, и их распределения в процессе изотермической и термической КХД в зависимости от параметров эксперимента;

• изучить возможность увеличения числа обнаруживаемых примесей в фармсубстанции при использовании сочетания КХД и ГХ/МС off-line;

• изучить возможность идентификации неизвестных веществ (отсутствующих в библиотеке масс-спектров), основанной на сравнении экспериментального масс-спектра электронной ионизации неизвестного соединения с смоделированными в программе Mass Frontier масс-спектрами соединений, имеющих такую же брутто-формулу, с использованием программы NIST MS Search.

Научная новизна работы. Исследована дериватизация шести фармсубстанций, отличающихся по структуре и составу функциональных групп (-SH, -COOH, -NH2, -NH, -OH) - каптоприл, метоклопрамид, соталол, гидрохлортиазид, налидиксовая кислота, ставудин при использовании пяти дериватизирующих реагентов трех классов - силилирующих, ацилирующих и алкилирующих, проведено ГХ/МС обнаружение полученных производных на микроуровне.

Показано, что наиболее эффективными являлись силилирующие реагенты BSTFA и MTBSTFA - каждый из них образовывал соответствующие регистрируемые с помощью ГХ/МС дериваты с 4-мя из 6-ти изученных фармсубстанций.

Показано, что изученные реагенты не всегда образовывали ожидаемые исходя из их известного применения дериваты, и в общем случае при изучении состава примесей неизвестного состава в фармсубстанциях целесообразно использование нескольких дериватизирующих реагентов.

Предложены способ анализа, основанный на сочетании КХД и масс-спектрометрии с электронной ионизацией, а также установка для его осуществления. С использованием этого способа экспериментально изучены закономерности распределения легких и тяжелых примесей в процессе их разделения с основным компонентом средней летучести методом КХД в зависимости от их летучести, концентрации в пробе и условий опыта. Предложенный способ впервые обеспечил возможность концентрирования примесей различной летучести в чистых среднелетучих органических веществах методом КХД.

Предложен способ обнаружения примесей в чистых среднелетучих органических веществах, основанный на сочетании КХД и ГХ/МС off-line. На примере одной фармсубстанции показано, что при использовании такого сочетания возможно существенное увеличение числа регистрируемых примесей по сравнению с использованием метода ГХ/МС(ЭИ).

Предложен подход к идентификации микроколичеств неизвестных примесей, для которых отсутствуют библиотечные масс-спектры, основанный на установлении бруттоформулы аналита и сравнении (с использованием программы NIST MS Search) экспериментального масс-спектра электронной ионизации неизвестного соединения с смоделированными (в программе Mass Frontier) масс-спектрами соединений, взятых из баз данных органических соединений для одинаковой с аналитом брутто-формулой. На примере четырех модельных соединений показана принципиальная возможность идентификации таких соединений.

Практическая значимость работы Показана возможность ГХ/МС обнаружения на микроуровне шести фармсубстанций (в виде производных) различной структуры и содержащих различные функциональные группы (-SH, -COOH, -NH2, -NH, -OH) с использованием пяти дериватизирующих реагентов разных классов. Показано, что для любой фармацевтической структуры можно экспериментально подобрать дериватизирующий агент, однако его выбор на основе литературных данных не однозначен.

Показано, что при в общем случае при изучении состава неизвестных примесей в фармсубстанциях целесообразно использование нескольких дериватизирующих реагентов.

Предложен способ изучения распределения примесей в чистых среднелетучих органических веществах в процессе КХД, основанный на сочетании КХД с массспектрометрией. Показано, что предложенный способ, а также способ, основанный на сочетании КХД и ГХ/МС(ЭИ), могут быть использованы для концентрирования, обнаружения числа и состава неизвестных примесей в чистых среднелетучих органических веществах (в частности фармсубстанциях), а также для определения содержания заданных соединений.

Полученные предложенным способом КХД/МС(ЭИ) зависимости степеней отделения и профилей распределения примесей от условий опыта в процессе КХД могут быть использованы для разработки и оптимизации методов очистки чистых среднелетучих веществ и стандартных образцов.

Предложенный подход к идентификации неизвестных соединений, для которых отсутствуют библиотечные масс-спектры, основанный на сопоставлении экспериментального и смоделированных масс-спектров электронной ионизации, особенно перспективен для быстрой предварительной идентификации соединений, содержащихся в сложной смеси на низком уровне или трудноотделимых от основного компонента, в частности для примесей в фармсубстанциях и других чистых органических веществах.

Результаты работы использованы на Химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Результаты ГХ/МС исследования дериватизации шести фармсубстанций, отличающихся по структуре и составу функциональных групп, пятью различными дериватизирующими реагентами.

2. Способ анализа, основанный на сочетании КХД и масс-спектрометрии (ЭИ) on-line.

3. Концентрирование примесей различной летучести в чистых среднелетучих органических веществах, основанное на КХД.

4. Способ определения примесей в чистых среднелетучих органических веществах, основанный на сочетании КХД и масс-спектрометрии (ЭИ) on-line.

5. Способ обнаружения и идентификации примесей в чистых среднелетучих органических веществах с использованием сочетания КХД и ГХ/МС(ЭИ) off-line.

6. Новый подход к идентификации неизвестных соединений на микроуровне, для которых отсутствуют библиотечные масс-спектры, основанный на сравнении экспериментальных масс-спектров неизвестных соединений с моделированными масс-спектрами структуркандидатов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены в виде докладов на Международном симпозиуме по капиллярной хроматографии (Рива дель Гарда, Италия, 2010), на Международном симпозиуме по хемометрике (Райвола, Санкт-Петербург, Россия, 2010), на Всероссийских конференциях «Аналитика России» (Краснодар, 2009), «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции»

(Москва, 2009), «Хроматография – народному хозяйству» (Дзержинск, 2010), «Аналитическая химия – новые методы и возможности (п.Клязьма Москвоской обл., 2010), «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), «Экоаналитика-2011» (Архангельск, 2011), «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2011), «Стандартные образцы в измерениях и технологиях» (Екатеринбург, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ в виде статей и тезисов докладов.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 5-ти глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 168 страницах, содержит рисунка, 34 таблицы и список цитируемой литературы из 171 наименования.

Основное содержание работы

Исходные вещества, аппаратура, техника эксперимента Дериватизацию фармсубстанций проводили в ультразвуковой ванне Branson мощностью 100 Вт и частотой 42 кГц. Использовали дериватизирующие агенты бистриметилсилил)-трифторацетамид (BSTFA), N-(трет-бутил-диметилсилил)-Nметилтрифторацетамид (MtBSTFA), бензил-триметиламмоний гидроксид (BzTMAH), изобутилхлорформиат (IBCF), пентафторбензилбромид (PFBB). Сухие навески фармацевтических субстанций массой 0,5 – 2,0 мг растворяли в 1 мл растворителя (МТБЭ для каптоприла и метанол для остальных). (1 мкл полученного раствора вводили в хроматограф для обнаружения недериватизированной субстанции.) Аликвоту 10 мкл полученного раствора переносили в виалу емкостью 1,5 мл, упаривали досуха в токе азота, после чего добавляли к ней дериватизирующие агенты (50-100 мкл для разных реагентов).

Итоговая концентрация дериватизированных веществ в определяемой смеси составляла (0,5г/мкл. Реакционную смесь взбалтывали и помещали на 15 мин в ультразвуковую ванну (30 сек. для дериватизации изобутилхлорформиатом). 1 мкл реакционной смеси вводили в хроматограф в режиме с делением потока 10:1, и регистрировали соответствующие хроматограммы по суммарному ионному току.

Обнаружение фармацевтических субстанций в виде их производных проводили на хромато-масс-спектрометре Trace GC POLARIS Q (Thermo Finnigan, USA), капиллярная колонка Restek RTX-1ms (30м x 0.32мм x 0,25 мкм). Пробу вводили в инжектор в режиме с делением потока 1:10, скорость потока гелия 1,5 мл/мин, температура инжектора 270C, температура соединительной линии 270C; колонку выдерживали 3 мин при температуре 50C, затем нагревали со скоростью 20C/мин до температуры 270C, при которой нагрев проводили в течение 16 минут. Масс-спектральные условия: энергия электронов 70 эВ, температура в источнике ионов 250C, диапазон сканирования масс 50 – 650 Да, катод включали через 9 минут после ввода пробы.

Для осуществления сочетания КХД с масс-спектрометрией была собрана установка I на базе хроматографа фирмы CarloErba модели "5160" с пламенно-ионизационным детектором и масс-спектрометра фирмы Finnigan модели "MAT 4500" с квадрупольным массанализатором. В качестве хромадистилляционной колонки использовали никелевый капилляр (dвн = 0,25 мм, l = 4 м). На выходе из хромадистилляционной колонки поток газаносителя через тройник разделялся на два (МС/ПИД = 1/4-1/5). Для создания отрицательного градиента температуры вдоль колонки начальный участок капилляра (1 м) наматывали на медный стержень. В более поздних опытах (установка II) для создания градиента температуры хромадистилляционную колонку помещали в трубку из фольги (d = 2 см), через которую продували горячий воздух из воздуходувки «Bosch GHG 650 LCE». Установка позволяла плавно регулировать температуру начала воздушного потока (60-200°С). На выходе из трубки воздух охлаждался до температуры термостата. Сигнал регистрировали одновременно ПИД и масс-спектрометром в режиме электронной ионизации (70 эВ).

Проводили селективную регистрацию ионов (значения m/z выбирались в каждом случае исходя из состава исходной смеси). Скорость потока через колонку в разных опытах составляла 2-7 мл/мин.

Для реализации сочетания КХД и ГХ/МС off-line установка II был модернизирована до установки III. В ней поток газа-носителя на выходе из колонки делился на два попадала в ПИД (для регистрации общего сигнала), 9/10 в сорбционный картридж, заполненный тенаксом. Конструкция позволяла быстро присоединять/отсоединять картридж для сбора необходимых фракций в процессе КХД. Собранные фракции термодесорбировали в инжектор хроматографа и проводили их ГХ/МС анализ.

В качестве модельных соединений и растворителей для опытов по КХД/МС использовали нормальные улеводороды C5-C16, ароматические углеводороды о-ксилол, пксилол, мезитилен, гексахлорбензол (х.ч. для хр.-ии, «Экоаналитика», Россия), а также галогеналканы бромтрихлорметан, 1,2-дибромэтан, бромоформ (GC Quant Kit Polyscience Corp., США). Концентрации модельных соединений в растворах составляли от 100 до 10-5%.

Пробу вводили в режиме без деления потока, либо с делением потока 4/1 (в некоторых опытах). Объем вводимых проб составлял от 0,5 до 2 мкл. В качестве фармсубстанций для обнаружения примесей использовали этиловый эфир бромизовалерьяновой кислоты и ментол рацемический.

В экспериментах по моделированию масс-спектров (для идентификации неизвестных соединений, отсутствующих в библиотеках масс-спектров), экспериментальные массспектры электронной ионизации модельных соединений получали при использовании серийного хромато-масс-спектрометра Trace DSQ (Thermo Electron Corporation, USA) с квадрупольным масс-анализатором, капиллярная колонка Restek RTX-1ms (30м x 0.32мм x 0,25 мкм). Пробу вводили в инжектор в режиме без деления потока, скорость потока гелия 1,5 мл/мин, температура инжектора 250C, температура соединительной линии 260C;

колонку выдерживали в течение 5 мин при температуре 40C, затем нагревали со скоростью 35C/мин до температуры 260C, при которой нагрев проводили в течение 10 минут. Массспектральные условия: энергия электронов 70 эВ, температура в источнике ионов 250C, диапазон сканирования масс 52 – 450 Да, катод включали через 9,5 минут после ввода пробы.

Изучение возможности ГХ/МС обнаружения ряда полифункциональных фармсубстанций с использованием дериватизации На сегодняшний день разработано множество дериватизирующих реагентов, как универсальных, так и специфических, подходящих для конкретного класса соединений.

Наиболее широко применяются силилирующие, ацилирующие и алкилирующие реагенты.

Тем не менее, редко можно с уверенностью предсказать, будет ли то или иное вещество образовывать с конкретным дериватизирующими реагентом устойчивое летучее соединение.

Поэтому актуальной задачей является изучение возможности дериватизации активных компонентов различных фармацевтических субстанций и фармпрепаратов, молекулы которых отличаются по структуре, и в состав которых входят разные функциональные группы, дериватизирующими реагентами. Примеси в фармпрепаратах часто имеют схожую с активным компонентом препарата (субстанции) структуру (если они образовались в результате побочной реакции синтеза во время производства, либо при распаде субстанции во время хранения). Поэтому можно предположить, что примеси и активный компонент фармпрепарата (субстанции) должны вести себя похожим образом при дериватизации.

Наиболее универсальные реагенты теоретически могли бы использоваться для дериватизации неизвестных примесей с последующим их определением методом ГХ/МС.

В качестве объекта исследования были выбраны фармацевтические субстанции, содержащие разные функциональные группы (-SH, -COOH, -NH2, -NH, -OH) - каптоприл, метоклопрамид, соталол, гидрохлортиазид, налидиксовая кислота и ставудин, степень чистоты которых составляет около 100% (по данным ВЭЖХ). Критерием их выбора было получить набор фармструктур, содержащих все наиболее часто встречающиеся функциональные группы. Часто такие вещества являются термонестабильными, и поэтому для их определения методом ГХ/МС требуется предварительная дериватизация. В нашем случае эти фармструктуры имитировали примеси в фармпрепаратах, в состав которых входят всевозможные функциональные группы.

Условия дериватизации выбирали исходя из литературных данных. Использование ультразвука вместо нагревания было продиктовано удобством проведения операции и меньшим временем пробоподготовки. При этом ряд предварительных опытов показал одинаковую степень дериватизации при использовании ультразвука и нагревания.

В таблице 1 представлены результаты ГХ/МС обнаружения изученных фармацевтических субстанций и их производных. Обнаружить производные удалось в случаях из 30. Очевидно, в остальных случаях производные либо не образовывались, либо оказались неустойчивыми, либо их предел обнаружения по каким-то причинам оказался слишком высок. Среди производных каптоприла и соталола с BSTFA были обнаружены сразу моно- и дизамещенные производные. Как и ожидалось, большинство из исследованных фармацевтических субстанций не определялись без дериватизации методом ГХ/МС, за исключением каптоприла и метоклопрамида. Однако для последних интенсивность сигнала триметилсилильных производных была соответственно в 60 и 80 раз выше, чем интенсивность пиков недериватизированных компонентов.

В каждом эксперименте по значениям m/z молекулярных и фрагментарных ионов в массспектрах было установлено число введенных дериватизирующих групп и подтверждена структура этих групп. В некоторых случаях удалось выдвинуть предположение о том, какие именно атомы водорода замещаются дериватизирующими группами.

Дополнительно было установлено, что дериватизация ставудина во всех случаях (кроме IBCF) приводила к образованию производных тимина, которые удавалось успешно зарегистрировать, а структура триметилсилильной производной тимина была подтверждена по библиотеке масс-спектров NIST.

Таблица 1. Обнаруженные производные субстанций фармпрепаратов и степень замещения атомов водорода в них. (Для каждого производного указано число замещенных атомов водорода и его время удерживания, мин) Прим. * – вещества, масс-спектры которых присутствуют в библиотеке NIST Нет – продуктов дериватизации не обнаружено Значения m/z указывают, по каким ионам строились масс-хроматограммы в случае невозможности обнаружения компонента на хроматограмме по полному ионному току Ни один из рассмотренных дериватизирующих реагентов не оказался достаточно универсальным. Даже для BSTFA, который согласно литературе образует производные в т.ч. с карбоновыми кислотами и аминотиолами, триметилсилильных производных гидрохлортиазида и налидиксовой кислоты обнаружено не было. В то же время каптоприл образует устойчивое триметилсилильное производное, причем замещение идет и по карбоксильной группе.

Наилучшим дериватизирующим реагентом для соединений с карбоксильной группой в структуре оказался изобутилхлорформиат. Он наиболее селективен и образует устойчивые производные с замещением по карбоксильной группе. Кроме того, этот реагент может использоваться в водных растворах. Это существенно расширяет область его применения и избавляет от необходимости выделения компонентов из водного раствора во время пробоподготовки.

В целом, для изученных соединений силилирование показало большую эффективность, чем другие виды дериватизации – BSTFA и MtBSTFA образовали производные с 4 из 6 препаратов каждый. Наиболее трудно оказалось определить метоклопрамид и гидрохлортиазид – для них подошли только реагенты BSTFA и BzTMAH соответственно.

Тем не менее, для каждой из выбранных фармацевтических субстанций удалось подобрать дериватизирующий реагент, позволяющий определять ее ГХ/МС методом в виде соответствующего производного. Это говорит о потенциальной возможности применения ГХ/МС с дериватизацией для обнаружения неизвестных примесей, однако подбор дериватизарующего реагента представляет собой нетривиальную задачу.

Таким образом, были продемонстрированы возможности метода ГХ/МС с дериватизацией для обнаружения микроколичеств термонестабильных и нелетучих фармацевтических веществ. Дериватизирующие реагенты показали различную активность, потенциальное образование тех или иных производных оказалось не всегда предсказуемым исходя из строения определяемого вещества. Для реагентов BSTFA, MtBSTFA и BzTMAH были обнаружены производные с 4 субстанциями из 6; для IBCF c 2; для PFBB с 1.

Разработка метода капиллярной хромадистилляции в сочетании с массспектрометрией с электронной ионизацией КХД/МС с нерегулируемым градиентом температуры. Исследование распределения примесей в процессе КХД Метод КХД потенциально мог бы использоваться для концентрирования примесей относительно макрокомпонента (субстанции). Возможность ввода больших проб дает значительное преимущество по сравнению с ГХ – полученные концентраты могут в дальнейшем использоваться для анализа методами ГХ/МС, ВЭЖХ/МС и даже ЯМР.

Отсутствие неподвижной фазы в ХД-колонке удешевляет анализ, минимизирует загрязнение и позволяет использовать более низкие температуры, что особенно важно при анализе термонестабильных веществ, которые нередко встречаются среди фармсубстанций. Возможность анализа в КХД смесей малолетучих соединений в перспективе позволяет вводить фармсубстанцию в чистом виде, не используя дополнительных растворителей. Это резко увеличивает производительность и устраняет необходимость учитывать примеси, содержащиеся в растворителе.

В соответствии с теорией ХД, описанной подробно в работах А.А.Жуховицкого, в изотермическом варианте бинарная смесь должна разделяться в процессе ХД на две зоны. Первая зона при этом содержит смесь компонентов, а вторая чистый менее летучий компонент.

Согласно теории ХД в случае тяжелой примеси 1, если растворитель 2 не регистрируется детектором, то наблюдаемая зона примеси должна иметь вытянутый низкий ступенчатый участок, заканчивающийся узким пиком. (см. рис. 1) При этом ширина зоны тяжелой примеси 1 на ХДГ где N1 - мольная доля компонента 1 (примеси); 2,1 - отношение давлений (или концентраций) насыщенного пара компонента 2 (растворителя) и компонента (примеси).

Согласно той же теории доля неотделенной примеси (т.е. элюирующейся вместе с растворителем до пика) должна быть равна отношению давлений насыщенных паров примеси и растворителя:

Qпотерь В случае легкой примеси 2 в растворителе 1 согласно теории ХД полоса примеси должна иметь прямоугольную форму на ХДГ, а величина объема удерживания зоны примеси должна составлять откуда с учетом того, что Qсм Q1 (количеством примеси 2 в смеси можно пренебречь по сравнению с общим количеством смеси), соотношение ширин зон где 1,2 - отношение давлений (или концентраций) насыщенного пара растворителя 1 и примеси 2, а 2 - коэффициент активности примеси.

Ур.-ия (1)-(3) получены в теории ХД, однако не были экспериментально подтверждены ни на колонках с инертным заполнителем, ни на пустых капиллярах. Это было связано с невозможностью одновременной регистрации сигналов примесей на фоне сигнала растворителя при использовании одного универсального детектора.

Выделение более летучих, чем растворитель, примесей в виде прямоугольных зон также не было показано экспериментально. Выделение менее летучей, чем растворитель, примеси в виде пика было экспериментально показано только в работе Динса* при использовании колонки с инертным заполнителем и дополнительного детектора для селективной регистрации примеси.

Для осуществления возможности селективного детектирования сигналов примесей одновременно с сигналом растворителя в процессе КХД нами была собрана установка I для КХД/МС. Установка позволила одновременно непрерывно регистрировать общий сигнал компонентов по ПИД и селективные сигналы примесей и растворителя по характеристичным ионам с помощью масс-спектрометра.

Так как наиболее актуальным является отделение близкокипящих к растворителю примесей, в качестве модельного раствора для регистрации профиля распределения легких и тяжелых примесей использовали раствор в нонане, содержащий 0,05% пксилола и мезитилена. Сигналы каждого компонента регистрировали селективно по соответствующему характеристичному иону (m/z = 128, 91, 120 для нонана, п-ксилола и мезитилена соответственно). На рис. 2 представлены масс-хромадистограммы по характеристичным ионам примесей и растворителя. Видно, что оба компонента концентрируются у краев ступени, но не отделяются полностью. Мезитилен, как более тяжелый компонент, концентрируется на конце ступени н-нонана (рис. 2Б). Часть мезитилена элюируется равномерно вместе с основным компонентом вдоль его ступени (порядка 70% по площади), другая часть (30% по площади) регистрируется в виде острого пика (ширина пика на середине высоты 0,25 сек). Условная эффективность разделения, рассчитанная из ширины пика и времени его выхода, составила 2* теор.т. (если считать такой пик аналитическим сигналом вещества при хроматографическом разделении). При этом концентрация мезитилена в газовой фазе (исходя из интенсивности сигнала мезитилена) в момент выхода пика оказывается в 500 раз выше, чем во время элюирования вдоль ступени н-нонана. Рассчитанный коэффициент концентрирования (если выделить фракцию, соответствующую выходу мезитилена в виде пика в конце ступени) составил 40.

* Deans D.R. The sample as its own stationary phase in gas chromatography // Analytical Chemistry.

1971. V. 43. № 14. P. 2026- П-ксилол, как более легкий компонент, (рис. 2В) концентрируется в начале ступени н-нонана (пик в конце ступени обусловлен мешающим сигналом мезитилена). В отличие от мезитилена, п-ксилол не образует острого пика и сильно размывается вдоль ступени ннонана. Коэффициент концентрирования составил около 2.

Образование пика примесью, более тяжелой чем растворитель, согласуется с теорией ХД. Однако образование столь узкого пика было зарегистрировано впервые. Согласно ур.ю (1) ширина пика должна резко сокращаться при приближении летучести компонента к летучести растворителя. Это подтверждается полученными нами данными.

Экспериментальное значение ширины пика мезитилена 0,25 сек близко к рассчитанному по ур.-ю (1) значению 0,08 сек. Следует отметить, что стандартное значение ширины пика в капиллярной ГХ составляет 3-5 с, что в 20 раз больше полученного нами значения.

Рассчитанная из справочных данных о давлениях насыщенных паров по ур.-ю (2) доля отделенного мезитилена составляла бы 40%. Экспериментально полученное значение 30% близко к нему, что также подтверждает, что полученные из теории ХД уравнения близки к описанию реальной системы.

В случае более легкой, чем растворитель, примеси согласно теории ХД полоса примеси должна иметь прямоугольную форму на ХДГ. В эксперименте (рис. 3) интенсивность сигнала п-ксилола действительно остается постоянной в средней части зоны примеси, но в начале и в конце форма сигнала отличается от прямоугольной.

Согласно ур.-ю (4) ширина зоны легких примесей должна уменьшаться при увеличении разницы в давлениях насыщенных паров, что подтверждается в последующих опытах.

Проведение аналогичного опыта с 0,1% растворами н-декана, н-додекана и нтетрадекана в н-нонане показали, что, с увеличением разницы в Ткип тяжелой примеси и основного компонента значительно увеличивается степень отделения (что соответствует ур.-ию (2) теории КХД), но в тоже время ширина пика резка увеличивается (что также согласуется ур.-ем (1) теории КХД). (На рис. 3 показаны полученные при вводе 1 мкл хромадистограммы, а в табл. 2 характеристики полученного распределения.) Образование столь узкого пика мезитилена объясняется тем, что растворитель выступает в качестве ограничителя и как бы сжимает зону компонента. Сжатие сильнее для примесей с летучестью, наиболее близкой к летучести растворителя.

Рис. 3. Масс-хромадистограммы проб, содержащих разные примеси в нонане. Ттерм= 60°С.

А) н-нонан (m/z 128), мезитилен (m/z 120); Б) н-нонан (m/z 128), декан (m/z 142);

В) н-нонан (m/z 128), додекан (m/z 170); Г) н-нонан (m/z 128), тетрадекан (m/z 198).

Таким образом, впервые был зарегистрирован непрерывный профиль распределения одновременно легких и тяжелых примесей в процессе капиллярной хромадистилляции, показан характер распределения примесей в зависимости от летучести. Впервые для КХД экспериментально показано, что тяжелые примеси могут образовывать высокий узкий пик (шириной до 0,25 сек). Ранее такой результат в принципе не мог быть получен при использовании только одного детектора или при сборе фракций и их анализе методом ГХ. Кроме того, экспериментально подтверждены уравнения хромадистилляции, описывающие распределение примесей более и менее летучих, чем основной компонент, в процессе хромадистилляционного разделения.

Таблица 2. Распределение тяжелых примесей в зависимости от Tкип вдоль ступени н-нонана (Ткип = 150°С).

Прим. * - эффективность посчитана как для газовой хроматографии N = 5,54*(tR/Wh)2, где tR - время удерживания (время от ввода пробы до выхода пика), Wh - ширина на полувысоте Недостатком разработанного способа КХД является невозможность регулировки градиента температуры, а значит и ее оптимизации для повышения степени извлечения.

Литературные данные свидетельствуют о повышении эффективности разделения в ХД за счет применения отрицательного градиента температуры, однако отсутствует информация о степени этого влияния, и какой градиент оптимален. Отсутствует информация о влиянии температуры и скорости потока в изотермической КХД.

Экспериментально не установлено влияние исходной концентрации компонента на степень его отделения. Кроме того, как показали опыты после каждого цикла нагревания/остывания хроматографа (для очистки капилляра) необходимо ожидать длительное время (около 40 мин) для стабилизации температуры нагретого медного стержня, что значительно удлиняет время анализа.

КХД/МС с регулируемым градиентом температуры. Исследование зависимости распределения примесей в процессе КХД от условий опыта, летучести примесей и их концентрации в смеси Для повышения эффективности разделения и изучения влияния отрицательного градиента температуры на характер распределения примесей установка I для КХД/МС была модернизирована до установки II. Для создания отрицательного градиента температуры ХД-колонка помещалась в трубку из фольги, через которую подавался поток горячего воздуха из воздуходувки с регулируемой температурой нагрева.

Для исследования влияния температуры, скорости потока, наличия/отсутствия градиента температуры, а также величины градиента температуры на профиль распределения и степень отделения примесей использовали модельные растворы компонентов в нонане (Ткип = 150°С), температуры кипения которых составляли от до 253°С. Перечень компонентов, их содержание в растворах, температуры кипения компонентов и используемые значения характеристичных ионов представлены в табл.

Таблица 3. Растворы модельных соединений в н-нонане для исследования зависимости распределения компонентов в процессе хромадистилляционного разделения от их летучести и условий проведения КХД *прим. - в опытах по изучению зависимости от температуры (в изотермическом режиме) использовался раствор с содержанием мезитилена 0,05%.

В случае изотермической ХД варьировали температуру проведения КХД в пределах 40-70С. Показано, что для легких примесей эффективность отделения выше при низких температурах, а для тяжелых при высоких. Степень отделения (доля вещества, отделенного в виде пика) с увеличением температуры монотонно возрастает для мезитилена от 26% до 37%, для н-декана от 54% до 71%.

В случае термической ХД варьировали градиент температуры вдоль колонки от 61С (61°С на входе к колонку и 50°С на выходе) до 150-50°С. Для всех примесей степень отделения монотонно увеличивалась с увеличением значения градиента. Для мезитилена степень отделения увеличивалась от 29% до 49%, а для декана от 76% до 88%. Такое поведение вполне очевидно - с увеличением значения градиента увеличивается движущая силу разделения, и вещества разделяются лучше.

Если сравнивать изотермическую и термическую КХД (рис. 4), то использование градиента позволило резко увеличить степень отделения для всех исследуемых примесей, кроме того увеличивается высота пика. Для мезитилена степень отделения возрастает в 2 раза, а высота пика в 5 раз; для н-декана степень отделения возрастает в 1,5 раза, а высота пика в 2 раза.

При варьировании скорости потока газа-носителя в диапазоне от 2,6 до 7,3 мл/мин заметного ее влияния на степень отделения выявлено не было.

Зависимость степени отделения от концентрации примеси изучали при использовании растворов н-декана в н-нонане в диапазоне содержания н-декана 0,1 Результаты представлены в таблице 4. Показано, что степень отделения тяжелого компонента практически не меняется с изменением концентрации компонента в диапазоне в три порядка. Это целиком подтверждает теорию КХД и ур.-е (2), согласно которому степень отделения не должна зависеть от концентрации примеси. Однако ранее это не было показано экспериментально.

Видно, что степень отделения сохраняется как для изотермического варианта, так и для варианта с градиентом температуры. При этом степень отделения, как и ожидалось, значительно выше при использовании градиента температуры (92%) чем при использовании изотермического режима (65%). Это хорошо видно на рис. 5, где изображена хромадистограмма смеси состава 1:1 в обоих режимах. Также видно, что в первой ступени элюируется смесь компонентов, а во второй практически чистый менее летучий компонент, что также соответствует литературным данным по ХД эквимолярных смесей.

Рис. 4. Масс-хромадистограммы, зарегистрированные в изотермической КХД при 50°C (верхние) и с градиентом температуры (Тmax = 90°C, Тmin = 50°C), (нижние).

А) Бромтрихлорметан (Ткип = 105°С); Б) 1,2-дибромэтан (Ткип =132°С); В) бромоформ (Ткип = 150°С); Г) мезитилен (Ткип = 163°С); Д) н-декан (Ткип = 174°С); Е) н-додекан (Ткип = 216°С);

Ж) н-тетрадекан (Ткип = 253°С).

Рис. 5. Хромадистограмма смеси нонан/декан (1/1) в изотермическом режиме слева (Т = 60°) и с градиентом температуры справа (Тmin = 60°C, Tmax = 140°С) Ранее в литературе зависимости степени отделения от указанных параметров опыта не были исследованы или описаны количественно.

Сохранение степени отделения при изменении концентрации примеси в процессе КХД и возможность получения высокого узкого пика при использовании отрицательного градиента температуры свидетельствуют о потенциальной возможности использования КХД для количественного определения близколетучих с основным компонентом примесей в органических веществах средней летучести в виде пиков на конце ступени.

Таблица 4. Доля отделенного компонента при КХД смеси С10/С9 с разным соотношением компонентов в изотермическим и термическом вариантах (Sr< 0,03) Состав смеси, об. Доля декана, отделенного во второй ступени (Нонан / декан) Изотермический режим (60°С) Режим с градиентом температуры Исследование возможности определения примесей методом КХД/МС На примере модельных смесей (растворов) мезитилена в н-нонане (5*10-8 - 5*10- г/мкл), диэтилфталата в н-додекане (1*10-9 - 5*10-8 г/мкл) и гексахлорбензола в нгексадекане (5*10-10 - 5*10-8 г/мкл) при их анализе методом КХД/МС была показана линейная зависимость между площадью пика и концентрацией модельной примеси (RSD < 8%), а также между высотой пика и концентрацией (RSD < 12%). Показана принципиальная возможность определения примесей методом КХД/МС. На примере гексахлорбензола в н-гексадекане показана возможность определения примеси на уровне 5*10-10 г/мкл.

Обнаружение примесей в фармсубстанциях методом КХД/МС Изучение числа примесей проведено для двух фармсубстанций - этилового эфира бромизовалерьяновой кислоты (ООО «Технопарк-Центр») и ментола рацемического (ОАО «Аромасинтез»).

При анализе этилового эфира бромизовалерьяновой кислоты вводили 1 мкл чистой фармсубстации в испаритель установки для КХД (градиент 95-70°С), при анализе ментола вводили 1 мкл 50% раствора в метаноле (градиент 100-80°С), (катод включали после выхода метанола). Сначала проводили КХД/МС в режиме сканирования по полному ионному току (m/z 50-400) со скоростью сканирования 2 сек/скан. Затем выбирали m/z, по которым наблюдался какой-либо сигнал на конце ступени растворителя, и повторяли в режиме селективного сканирования по выбранным ионам.

Это позволяло увеличить скорость сканирования до 0,12 - 0,14 сек/скан и давало возможность разграничить узкие плотно примыкающие друг к другу пики, зарегистрированные по разным m/z (при скорости сканирования 2 сек/скан это было невозможно).

При использовании термической КХД/МС по масс-хроматограммам были обнаружены 14 примесей в этиловом эфире бромизовалерьяновой кислоты и примесей в ментоле. (Примеси были менее летучие, чем основной компонент). Таким образом, была показана принципиальная возможность регистрации примесей методом КХД/МС в реальных объектах - фармсубстанциях.

Обнаружение и идентификация примесей в фармсубстанции, основанное на сочетании КХД и ГХ/МС off-line Обнаружение и идентификацию примеси проводили в фармсубстанции этиловом эфире бромизовалерьяновой кислоты (ООО «Технопарк-Центр»).

1 мкл чистой фармсубстанции вводили в испаритель установки III для КХД (градиент 100-55°С). Процесс элюирования основного компонента (длина ступени 15, минут) контролировали по ПИД. При этом осуществляли сбор фракции легких примесей (от 0 до 1,0 мин) и фракции тяжелых примесей (от 15,0 до 20,0 минуты). Для более полного сбора фракции тяжелых примесей после выхода ступени основного компонента догревали термостат установки до 200°С. При этом с каждой фракцией отбиралось по 5% основного компонента. Полученные фракции путем термодесорбции вводили (по отдельности) в испаритель хромато-масс-спектрометра и проводили ГХ/МС анализ.

ГХ/МС анализ собранных фракций осуществляли в режиме с делением потока 1/50.

Полученный результат сравнивали с анализом раствора 10-6 г/мкл фармсубстанции в МТБЭ в режиме без деления потока. (В этом случае количество основного компонента, попадаемого в масс-спектрометр, одинаково) При непосредственном использовании метода ГХ/МС было обнаружено примесей, в то время как при использовании сочетания КХД и ГХ/МС off-line зарегистрировали 51 примесь. Идентифицировано по библиотеке NIST 24 примеси. Для большинства примесей площадь пика в КХД-ГХ/МС анализе оказалась в 10-12 раз больше, чем при непосредственном ГХ/МС анализе. (В случае 100% концентрирования и отсутствии потерь при термодесорбции площадь пика в КХД-ГХ/МС могла оказаться максимум в 20 раз больше, чем в ГХ/МС.) При этом количество основного компонента фармсубстанции, попадаемого в масс-спектрометр, оставалось одинаковым (т.е.

нагрузка на колонку оставалась одинаковой). На рис. 6 показаны некоторые из примесей, зарегистрированные тем и другим методом.

Таким образом, на примере фармсубстанции этиловый эфир бромизовалерьяновой кислоты была показана возможность обнаружения и идентификации примесей с использованием сочетания КХД с ГХ/МС off-line. По сравнению с непосредственным ГХ/МС обнаружением на порядок увеличивается чувствительность обнаружения примесей (а значит и понижается предел обнаружения), увеличивается количество обнаруживаемых примесей при одной и той же нагрузке на колонку. В отличие от предлагавшегося ранее способа сочетания ГХ с ГХ/МС off-line отсутствует необходимость многократного ввода одной и той же пробы со сбором соответствующей фракции для накопления примеси. При одинаковом объеме пробы мкл концентрация фармсубстанции для ГХ не должна превышать 0,1%, в тоже время в КХД можно вводить чистое вещество, либо, если вещество твердое, максимально концентрированный раствор (что было показано нами на примере КХД/МС анализа ментола в виде 50% раствора в метаноле).

Рис. 6. Хроматограммы некоторых примесей фармсубстанции этиловый эфир бромизовалерьяновой кислоты, зарегистрированные при использовании метода КХД-ГХ/МС (А) и непосредственно ГХ/МС (Б) Разработка подхода к быстрой предварительной идентификации неизвестных соединений на основе сравнения их экспериментальных массспектров электронной ионизации с моделированными масс-спектрами вероятных структур-кандидатов В результате процесса КХД менее летучие, чем растворитель, примеси концентрируются (в разной степени) в узкой зоне и элюируются сразу после испарения основного по концентрации компонента, что подтверждается полученными нами данными. Их идентификацию можно осуществить при сочетании КХД с ГХ/МС off-line и использовании библиотек масс-спектров NIST. Но что делать, если масс-спектр искомого соединения отсутствует в библиотеке масс-спектров? Мы предложили подход к решению такой задачи, основанный на сравнении экспериментальных масс-спектров электронной ионизации неизвестных соединений с масс-спектрами, моделированными для структур-кандидатов, имеющих одинаковую с неизвестным соединением бруттоформулу, с использованием соответствующих программ.

Предлагаемый алгоритм включает в себя:

1. Определение молекулярной массы неизвестного соединения (методом ГХ/МС в режимах электронной ионизации, химической ионизации, фото- и фотохимической ионизации при атмосферном давлении).

2. Определение брутто-формулы (формул), соответствующей молекулярной массе искомого соединения, на основании информации, полученной методами ГХ с атомно-эмиссионным детектированием или масс-спектрометрии высокого разрешения.

3. Нахождение по базам данным (напр., CAS) всех известных на сегодня соединений с данной брутто-формулой.

4. Моделирование масс-спектров структур-кандидатов, найденных в базах данных, с использованием программы HighChem Mass Frontier.

5. Сопоставление экспериментального масс-спектра неизвестной примеси с моделированными масс-спектрами структур-кандидатов с помощью программы NIST MS Search. Определение наиболее вероятной структуры (структур) неизвестного соединения.

Данный подход позволяет выбрать из всего многообразия органических соединений небольшой круг веществ, с большой вероятностью включающий искомое вещество.

Причём для этого нет необходимости проводить набор сложных, времязатратных операций по выделению индивидуального вещества из многокомпонентной смеси. В рамках данного алгоритма нами впервые было предложено использовать программу Mass Frontier для моделирования масс-спектров электронной ионизации структуркандидатов и одновременно программу NIST MS Search для сравнения этих массспектров с экспериментальными масс-спектрами неизвестных соединений.

Для проверки предлагаемого алгоритма идентификации мы провели эксперимент с использованием 4 модельных соединений. В качестве последних использовали фармсубстанции афобазол (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]-бензимидазола дигидрохлорид), метаболиты афобазола М-3 (2-(2-морфолиноэтилтио)-5гидроксибензимидазол) и М-11 (2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио]-5этоксибензимидазола гидрохлорид) (хромато-масс-спектральные (ГХ/МС) данные для которых были впервые получены нами), а также пентоксифиллин (3,7-дигидро-3,7диметил-1-(5-оксогексил)-1Н-пурин-2,6-дион), масс-спектр электронной ионизации которого представлен в библиотеке NIST.

Мы рассматривали эти вещества в роли неизвестных примесей в фармацевтической субстанции. Методом ГХ/МС получили масс-спектр электронной ионизации этих соединений. Предполагалось, что с использованием ГХ/АЭД и масс-спектрометрии высокого разрешения установлена брутто-формула этих соединений. Далее, в соответствии с предложенным алгоритмом, в базе данных структур (http://chemexper.com/) были найдены все структуры с брутто-формулами искомых соединений. (Информация о максимальном числе зарегистрированных на сегодняшний день органических веществ представлена в базе данных структур CAS, где на каждую брутто-формулу приходиться 1000-2000 структур, однако в рамках данного модельного опыта было решено ограничиться меньшей по объему базой данных.) Брутто-формулы и количество структур-кандидатов представлены в табл. 6.

Таблица 6. Результаты применения предложенного алгоритма для модельных соединений Название Брутто-формула ММ Число кандидатов с Порядковый номер афобазола М- афобазола М- На сегодняшний день существуют программы, моделирующие (по структуре соединения) набор масс вероятных осколочных ионов, получающихся при электронной ионизации; однако не существует программ, предсказывающих относительную интенсивность пиков этих ионов в масс-спектре. Используя одну из таких программ (Mass Frontier) мы получили набор значений m/z вероятных осколочных ионов для каждой структуры-кандидата. Далее мы решили использовать масс-спектры, моделированные с помощью программы Mass Frontier для минимизации выборки структур вероятных кандидатов и идентификации неизвестных компонентов. Для этого построили модельные масс-спектры, присвоив каждому из этих значений m/z 100%-ую интенсивность в масс-спектре. Таким образом, для каждой структуры-кандидата был смоделирован масс-спектр. Далее, для каждой из «неизвестных примесей» (модельных соединений) ее экспериментальный масс-спектр сравнивали с смоделированными массспектрами структур-кандидатов с той же брутто-формулой. Это сравнение осуществляли с использованием программы NIST MS Search. Для каждой пары сравниваемых масс-спектров считалось значение фактора сходимости, характеризующего степень сходства масс-спектров. На рис. 7 представлены экспериментальный и смоделированный в программе Mass Frontier масс-спектры афобазола, а в табл. 7 номера структур-кандидатов, смоделированные масс-спектры которых больше других похожи на экспериментальный масс-спектр неизвестной примеси (афобазола).

Таблица 7. Результаты сравнения смоделированных масс-спектров структур-кандидатов с экспериментальными масс-спектрами средствами NIST MS Search Видно, что многие даже интенсивные пики экспериментального масс-спектра могут отсутствовать в моделированном. Тем не менее, такого «качества моделирования»

масс-спектров оказывается достаточно - в трех случаях из четырех удается правильно выделить искомое соединение из порядка сотни структур-кандидатов, а для структуры пентоксифиллина искомое соединение вошло в четверку наиболее вероятных из структур.

Подобный способ идентификации может оказаться чрезвычайно быстрым и эффективным для предварительного исследования примесей в чистых органических субстанциях, фармсубстанциях или стандартных образцах, когда число и состав присутствующих примесей не может быть заранее известен. Масс-спектры электронной ионизации, используемые в данном подходе, могут быть получены для малых количеств вещества и не требуют выделения исследуемой примеси в виде индивидуального соединения (которое в ряде случаев не может быть осуществлено на практике). Моделирование масс-спектров структур-кандидатов и их сравнение с экспериментальным масс-спектром может осуществляться автоматически при написании соответствующей программы. В этом случае от исследователя будет требоваться только ввести брутто-формулу (или молекулярную массу - в этом случае будут рассматриваться все подходящие под эту массу брутто-формулы) идентифицируемого соединения и его экспериментальный масс-спектр, а программа будет выдавать набор наиболее вероятных структур неизвестного соединения со значениями их коэффициентов сходимости. Использование баз данных структур по сравнению с базами данных масс-спектров значительно увеличивает диапазон идентифицируемых соединений, расширяя возможность применения метода ГХ-МС для идентификации компонентов смесей (в библиотеке NIST содержится порядка тыс. масс-спектров, а в библиотеке структур CAS порядка 60 млн. структур). Такая предварительная идентификация способствует значительному уменьшению числа образцов сравнения, необходимых для подтверждения правильности идентификации неизвестного соединения.

При анализе органических веществ высокой степени чистоты, какими являются в частности фармсубстанции, необходимо в первую очередь установить число присутствующих в образце компонентов (примесей), число которых никогда заранее неизвестно, провести их идентификацию (на микро и ультрамикроуровне) и только затем проводить их определение (при наличии стандартных образцов), либо оценку их содержания (при принятии коэффициентов чувствительности одинаковыми).

Сочетание КХД с ГХ/МС(ЭИ) off-line обеспечивает существенное увеличение достоверности обнаружения числа присутствующих в образце примесей по сравнению с ГХ/МС(ЭИ), а использование предложенного подхода к идентификации неизвестных примесей позволяет получить узкий набор наиболее вероятных структур-кандидатов и существенно расширить возможности идентификации неизвестных микропримесей, для которых отсутствуют масс-спектры в библиотеках масс-спектров.

Выводы 1. Исследованы дериватизация шести фармсубстанций, отличающихся по структуре и составу функциональных групп, при использовании силилирующих, ацилирующих и алкилирующих дериватизирующих реагентов и ГХ/МС обнаружение полученных производных на микроуровне. Показано, что в общем случае при изучении состава примесей неизвестного состава целесообразно использование нескольких дериватизирующих реагентов.

2. Предложены способ анализа смесей, основанный на сочетании КХД и массспектрометрии с электронной ионизацией, позволяющий проводить селективную регистрацию примесей в присутствии основного компонента в процессе КХД, и устройство для его осуществления.

3. С использованием этого способа экспериментально изучена возможность выделения примесей из среднелетучих чистых органических веществ в зависимости от условий эксперимента и их летучести, и впервые показана возможность концентрирования примесей из среднелетучих чистых органических веществ методом КХД.

4. Предложен способ обнаружения примесей в чистых среднелетучих органических веществах, основанный на сочетании КХД и ГХ/МС off-line, и на примере одной фармсубстанции показана возможность существенного увеличения числа регистрируемых примесей по сравнению с использованием метода ГХ/МС(ЭИ).

5. Предложен новый подход к идентификации микроколичеств неизвестных примесей (для которых отсутствуют библиотечные масс-спектры), основанный на установлении брутто-формулы аналита и сравнении (с использованием программы NIST MS Search) экспериментального масс-спектра электронной ионизации неизвестного соединения с смоделированными (в программе Mass Frontier) массспектрами соединений, взятых из баз данных органических соединений для одинаковой с аналитом брутто-формулой. На примере четырех модельных соединений показана принципиальная возможность идентификации таких соединений.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Гуляев И.В., Ревельский А.И. Анализ фармацевтических субстанций методом реакционной газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией // Масс-спектрометрия. Т. 6, № 3. 2009. Стр. 140-144.

2. Ревельский И.А., Гуляев И.В., Ревельский А.И., Чепелянский Д.А., Бочков П.О.

Идентификация неизвестных соединений с использованием баз данных и компьютерного генерирования масс-спектров // Масс-спектрометрия. Т. 7, № 2. 2010. Стр. 118-123.

3. Гуляев И.В., Чепелянский Д.А., Ревельский А.И., Ревельский И.А. Капиллярная хромадистилляция – масс-спектрометрия для концентрирования и определения примесей // Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. (В печати) 4. Гуляев И.В., Чепелянский Д.А., Ревельский И.А., Ревельский А.И. Капиллярная хромадистилляция в сочетании с масс-спектрометрией и определение примесей в органических растворах // Масс-спектрометрия. 2012. (В печати) 5. Жуховицкий А.А., Ревельский И.А., Чепелянский Д.А., Гуляев И.В., Ревельский А.И.

Определение примесей в высокочистых органических веществах – новый подход, основанный на капиллярной хромадистилляции и хроматографии // Всероссийская научнопрактическая конференция «Хроматография – народному хозяйству», Дзержинск, 2010.

6. Жуховицкий А.А., Ревельский И.А, Чепелянский Д.А., Гуляев И.В., Ревельский А.И.

Увеличение достоверности обнаружения числа примесей в высокочистых органических веществах при сочетании газовой хроматографии и капиллярной хромадистилляции // Съезд аналитиков России «Аналитическая химия – новые методы и возможности», п.

Клязьма Москвовской обл., 2010. Стр. 110-111.

7. Zhukhovitsky А.А., Revelsky I.A., Chepelyansky D.A., Gulyaev I.V., Revelsky A.I. New opportunities for reliable components number determination in pure organic compounds due to combine use of chromadistillation, GC and GC/MS // 34th International Symposium on Capillary Chromatography, Riva del Garda, Italy, 2010. P. 210.

8. Жуховицкий А.А., Ревельский И.А, Чепелянский Д.А., Гуляев И.В., Ревельский А.И.

Обогащение примесей в высокочистых органических веществах методом капиллярной термической хромадистилляции // Всероссийская конференция "Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез", Краснодар, 2010. Стр. 74.

9. Гуляев И.В., Чепелянский Д.А., Ревельский А.И., Ревельский И.А. Распределение примесей в процессе капиллярной хромадистилляции // VIII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2011", Архангельск, 2011. Стр. 106.

10. Гуляев И.В., Чепелянский Д.А., Ревельский А.И., Ревельский И.А. Капиллярная хромадистилляция - масс-спектрометрия для концентрирования и определения примесей // III Всероссийский симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии», Краснодар, 2011. Стр. 230.

11. Гуляев И.В., Чепелянский Д.А., Яшин Ю.С., Ревельский А.И., Ревельский И.А. Новый подход к определению состава примесей в высокочистых органических веществах – стандартах для хроматографии // III Всероссийская научно-техническая конференция с международным участием «Стандартные образцы в измерениях и технологиях», Екатеринбург, 2011. Стр. 89.

12. Ревельский И.А., Яшин Ю.С., Соколов В.Н., Чернецова Е.С., Самохин А.С., Гуляев И.В., Ревельский А.И. Идентификация компонентов на ультранизком уровне – состояние вопроса и новые возможности // III Всероссийская конференция с международным участием «Аналитика России», Краснодар, 2009. Стр. 480.

13. Ревельский И.А., Гуляев И.В., Ревельский А.И., Чепелянский Д.А. Идентификация неизвестных соединений с использованием баз данных структур и компьютерного генерирования масс-спектров // I Всероссийская конференция «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции», Москва, 2009. Стр. 111.

14. Revelsky I.A., Gulyaev I.V., Revelsky A.I., Chepelyansky D.A. Identification of unknowns based on structure data bases and computer simulation of mass spectra // VII Winter Simposium on Chemometrics (WSC-7), Raivola, St. Petersburg, 2010. P. 65.