на правах рукописи
Чекунова Наталия Валерьевна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИЗМЕНЕНИЙ
СЛИЗИСТОЙ КУЛЬТИ ЖЕЛУДКА У БОЛЬНЫХ, ОПЕРИРОВАННЫХ
ПО ПОВОДУ РАКА
14.01.17 - ХИРУРГИЯ
03.02.07 - ГЕНЕТИКА
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва 2014 1
Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России.
Научные руководители:
Хоробрых Татьяна Витальевна доктор медицинских наук, профессор Немцова Марина Вячеславовна доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Ветшев Петр Сергеевич - академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор, заместитель генерального директора по лечебной и научнообразовательной части ФГБУ «Национальный Медико-хирургический Центр имени Н.И. Пирогова» Министерства Здравоохранения РФ.
Петрин Александр Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией медицинских генетических технологий Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России.
Защита диссертации состоится «»2014 г.
в часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.03 ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.
Сеченова (119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2).
С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49) и на сайте Первый МГМУ имени И.М. Сеченова (www.mma.ru).
Автореферат разослан «_»2014г.
Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Шулутко Александр Михайлович 2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
В структуре онкологической смертности населения России рак желудка занимает второе место. В среднем, в России ежедневно выявляется новых больных [Аксель Е.М., Давыдов М.И., 2010г].
Основным фактором прогноза при лечении рака желудка являются объем хирургического вмешательства и установление стадии заболевания [Черноусов А.Ф. и соавт., 2004г]. В настоящее время субтотальная дистальная резекция желудка может быть выполнена без ущерба для радикальности при условии чистоты линии резекции и адекватной лимфаденэктомии [Чиссов В.И., Александрова Л.М., 2010г]. Что касается реконструктивного этапа операции, то основными требованиями к нему являются низкая частота послеоперационных осложнений, связанных с наложением анастомоза, а также физиологичность, обеспечивающая минимум постгастрорезекционных расстройств и минимальный риск развития метахронного рака культи желудка. Субтотальная дистальная резекция желудка по Бильрот-I при раке обеспечивает, как необходимый объем резекции органа, так и хорошие непосредственные и отдаленные результаты, что подтверждено многочисленными исследованиями ближайших и отдаленных результатов [Черноусов А.Ф., Поликарпов С.А., 2004г].
Накопленный в мире опыт позволяет отметить, что сегодня методом выбора в лечении рака проксимального отдела желудка остается хирургический. Проксимальная субтотальная резекция желудка может быть выполнена при небольших размерах опухоли (диаметром не более 4 см), локализующихся в проксимальном отделе без распространения на верхнюю треть тела желудка, а также при раннем раке верхней трети желудка [Давыдов М.И. и соавт., 2008г].
Рецидив рака желудка после хирургического лечения возможен даже при выполнении операции в объеме R0 и существенно ухудшает отдаленный 3 прогноз. На возникновение локорегионарных метастазов влияет не только снижение объема радикализма, но и прогрессирование опухолевого процесса.
Рецидив рака желудка, в отличие от первичной опухоли, характеризуются большей агрессивностью, выражающейся в склонности к инфильтративному росту, высокой степенью инвазивности, частым прорастанием в окружающие органы и отдаленным метастазированием [Давыдов М.И. и соавт., 2008г].
Улучшение результатов лечения рака желудка во многом связывают с патогномоничных клинических симптомов, а возможности лабораторных методов диагностики недостаточны.
Улучшение раннего выявления опухолей желудка связывают с необходимостью использования дополнительных критериев и новых методов диагностики в клинической практике. В последнее время в связи со значительным прогрессом, достигнутым в области изучения канцерогенеза, все большее значение начинают приобретать молекулярно-генетические маркеры, основанные на использовании ДНК- и РНК-технологий.
Определение молекулярных маркеров проводится в операционном материале, полученном в процессе хирургического лечения или в биоптатах, полученных посредством эндоскопического исследования, с последующим или предварительным морфологическим контролем. К молекулярногенетическим маркерам относятся структурные и функциональные повреждения, выявляемые в геноме опухолевой клетки. Повреждения ДНК или РНК опухолевых клеток приводят к изменению генной экспрессии, в результате чего происходит нарушение регуляции клеточного цикла, неоангиогенеза, повышение показателей метастатической и инвазивной активности опухолевых клеток. [Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Немцова М.В., 2011г].
Молекулярно-генетические онкологические маркеры обладают достаточной степенью чувствительности и специфичности, они просты в лабораторном исследовании. Однако их внедрение в клиническую практику требует тщательной научной разработки и подготовки.
Несмотря на схожие механизмы регуляции каждая опухоль является уникальной, ее развитие и прогрессия модифицируется особенностями генома конкретного пациента и ее собственным молекулярным патогенезом, поэтому единого универсального маркера для диагностики злокачественных опухолей в настоящее время не существует. Разработка комплексных систем диагностических и прогностических маркеров, которые включают молекулярно-генетические, иммуногистохимические и биохимические, позволит получить дополнительную информацию, необходимую для эффективной диагностики, лечения и послеоперационного мониторинга пациентов с раком желудка. [М.В. Немцова и соавт., 2013г].
неизмененной слизистой культи желудка у больных, перенесших его резекцию по поводу рака для послеоперационного мониторинга, используя систему молекулярно-генетических маркеров.
1. Оценить отдаленные результаты оперативного лечения в зависимости от характера опухолевого процесса и вида выполненной операции.
- после дистальной субтотальной резекции желудка - после проксимальной резекции желудка 2. Провести анализ эффективности комплексного лечения больных, оперированных по поводу рака в объеме субтотальной резекции.
метилирование генов CDH1, RASSF1А, MLH1, N33, DAPK, RUNX3) в биоптатах слизистой культи желудка у больных, ранее оперированных по поводу рака 4. Провести анализ корреляции молекулярно-генетических изменений в биоптатах слизистой культи желудка у ранее оперированных больных с такими характеристиками опухоли, как глубина инвазии стенки желудка, степень дифференцировки, размер первичной опухоли, прохождение линии резекции в зоне первичной опухоли.
5. Оценить перспективы использования системы молекулярногенетических маркеров в качестве прогностической для оценки риска генерализации процесса и развития рецидива.
Впервые проведено комплексное исследование аномального метилирования генов CDH1, RASSF1А, MLH1, N33, DAPK, RUNX3 в послеоперационных биоптатах слизистой культи желудка, полученных при эндоскопическом исследовании у больных, оперированных в объеме субтотальной резекции. В результате проведенного исследования показана связь молекулярной патологии с возможным развитием генерализации опухолевого процесса. Показано, что молекулярно-генетические изменения возникают до негативных клинических проявлений у пациентов, при отсутствии опухолевых клеток в биоптатах. На основании полученных данных показано, что исследуемые молекулярно-генетические маркеры могут быть использованы в качестве дополнительных для прогнозирования течения опухолевого процесса у ранее оперированных больных.
С целью оценки результатов оперативного лечения в зависимости от характера опухолевого процесса и вида выполненной операции (дистальной субтотальной резекции желудка или проксимальной резекции желудка), проведен анализ эффективности комбинированного лечения больных и оценены отдаленные результаты. С учетом данных молекулярногенетического анализа подтверждено, что выполнение резекций желудка в объеме R0 и при условии расширенной лимфаденэктомии не только правомочно, но и не снижает степень онкологического радикализма и качества жизни у больных раком желудка.
Изучены отдаленные результаты хирургического лечения больных раком желудка. Доказано, что выполнение оперативного вмешательства в объеме резекций (субтотальной дистальной по Бильрот-I или проксимальной) при условии отсутствия опухолевых клеток в краях резекций и адекватной лимфаденэктомии правомочно и не приводит к развитию локорегионарных рецидивов или генерализации опухолевого процесса.
Показано, что выполнение заведомо циторедуктивных операций вследствие распространенности опухолевого процесса или наличия тяжелых конкурирующих заболеваний в сочетании с послеоперационной системной химиотерапией позволяет продлить жизнь пациентам, не снижая ее качества.
Проведено комплексное исследование эпигенетических изменений в послеоперационных биоптатах слизистой культи желудка, полученных при эндоскопическом исследовании. В результате исследования показано, что аномальное метилирование генов N33, CDH1 и RUNX3 является маркерами неблагоприятного прогноза, развития генерализации опухолевого процесса, при мониторинге оперированных больных. Выявлены ассоциации молекулярно-генетических повреждений с такими клиническими характеристиками, как наличие отдаленных метастазов (р=0,0462), наличие сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного тракта (р=0,0077), в частности атрофического гастрита (р=0, 0378), а также с высоким риском генерализации опухолевого процесса (р=0,029), что позволить использовать анализ молекулярных изменений в качестве дополнительных маркеров прогноза у ранее оперированных больных.
Предложенные ДНК-маркеры позволяют дополнить морфологические и биохимические исследования, которые используется в настоящее время для послеоперационного мониторинга больных.
Диссертация апробирована 05.03.2014 года на кафедре факультетской хирургии №1 лечебного факультета Первого МГМУ имени И.М. Сеченова.
Материалы диссертации были представлены и обсуждены:
- На конференции «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 26- октября 2011г) - На XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»
(Москва, 23-27 апреля 2012г) - На XVII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 12-14 ноября 2013г) - Номинант в категории «Лучший проект года», подноминации «Лучший научно-исследовательский проект» Всероссийской премии в области онкологии ассоциации онкологов России IN VITA VERITAS (СанктПетербург, 12 сентября 2013г) Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
специальности 14.01.17 – хирургия (медицинские науки). Хирургия – область медицинской науки, изучающая заболевания и повреждения, в лечении которых важнейшее значение приобретают методы кровавого и бескровного оперативного вмешательства. Создание новой хирургической техники, разработка новых оперативных вмешательств и новых хирургических технологий, а также совершенствование методов профилактики, ранней диагностики и лечение хирургических болезней будут способствовать сохранению здоровья населения, сокращению сроков временной нетрудоспособности и восстановлению трудоспособности. Области распространенности хирургических заболеваний; разработка и усовершенствование методов диагностики и предупреждения хирургических заболеваний; обобщение интернационального опыта, разных хирургических школ и отдельных хирургов; экспериментальная и клиническая разработка методов лечения хирургических болезней и их внедрение в клиническую практику; усовершенствование методов диспансеризации и профилактики хирургических заболеваний.
Научные положения диссертации соответствуют паспорту научной специальности 03.02.07 – генетика (медицинские науки). Генетика - это область науки, изучающая явления изменчивости и наследственности, закономерности процессов хранения, передачи и реализации генетической информации на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровне. Области исследования: молекулярные и цитологические основы наследственности; генетический код, структурно-функциональная организация генома; процессы репликации, рекомбинации, репарации;
мутационная изменчивость, геномная и хромосомная перестройка;
эпигенетика; реализация генетической информации (транскрипция, трансляция), механизмы регуляции экспрессии генов, роль геномных перестроек в реализации генного действия, взаимодействие генов; генетика индивидуального развития, апоптоз, иммуногенетика; генетика человека, медицинская генетика.
Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования данных специальностей.
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 в рецензируемых изданиях, в которых изложены основные положения диссертации.
Внедрение результатов исследования в клиническую практику.
практическую работу в Клинике факультетской хирургии им. Н. Н. Бурденко Первого МГМУ им. И.М.Сеченова.
Использование основных положений диссертации в практической работе позволило с помощью генетических маркеров дополнить и расширить общепринятую систему клинико-морфологических факторов прогноза возможной генерализации процесса у ранее оперированных больных.
Автор принимал непосредственное участие в лечении пациентов (включая предоперационную подготовку, оперативное вмешательство, послеоперационный период); ведении больных при контрольном обследовании. Автору принадлежит ведущая роль в сборе материала, анализе, обобщении и научном обосновании полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведен мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их клинической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.
Диссертация изложена на 139 странице, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.
Работа иллюстрирована 13 рисунками, содержит 15 таблиц, библиография включает 139 источников, из них 84 отечественных и 55 зарубежных.
1. Хирургическое лечение рака желудка в объеме резекций (субтотальной дистальной или проксимальной) при радикальности R0 и адекватной лимфаденэктомии является правомочным, так как не снижает объема онкологического радикализма, что подтверждено анализом отдаленных результатов оперативного лечения данной категории больных и результатами молекулярно-генетического анализа.
2. Хирургическое вмешательство в объеме резекций с лимфаденэктомией D при заведомо циторедуктивных операциях, вследствие распространенности опухолевого процесса или наличия тяжелого конкурирующего заболевания, в сочетании с послеоперационной системной химиотерапией позволяет продлить жизнь больным не снижая ее качества.
3. Из шести исследуемых генов (CDH1, RASSF1А, MLH1, N33, DAPK, RUNX3) в послеоперационных биоптатах морфологически неизмененной слизистой культи желудка, полученных при эзофагогастродуоденоскопии, аномальное метилирование выявлено по 3-м генам- N33, CDH1 и RUNX3, с общей частотой метилирования 22,5% (9/40).
4. Метилирование генов N33, CDH1 и RUNX3 достоверно связано с наличием сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного тракта (р=0,0077), в частности хронического атрофического гастрита (р=0,0378), а также с выявлением отдаленных метастазов (р=0,0462) и генерализацией опухолевого процесса (р=0,029). Корреляции молекулярно-генетических изменений в биоптатах слизистой культи желудка с такими клиническими характеристиками опухоли, как локализация, глубина инвазии в стенку желудка, дифференцировка, размер первичной опухоли и прохождение линии резекции достоверной корреляции выявлено не было 5. Исследование метилирования генов N33, CDH1 и RUNX3 может быть использовано в качестве дополнительных маркеров прогноза в послеоперационном мониторинге больных.
Общая характеристика клинических наблюдений и методов Группу наблюдения составили 103 больных в период с декабря года по декабрь 2012 года находившихся на лечении в клинике факультетской хирургии имени Н.Н. Бурденко. Все больные были оперированы по поводу рака желудка в объеме субтотальных дистальных или проксимальных резекций с расширенной лимфаденэктомией.
Показаниями к выполнению субтотальной дистальной резекции желудка считали опухоли антрального отдела и нижней трети тела желудка, при отсутствии в его проксимальном отделе предраковых изменений слизистой оболочки, таких как полипы, тяжелая дисплазия [Черноусов А.Ф. и соавт., 2002г.]. Субтотальную проксимальную резекцию желудка выполняли больным с небольшим юкстакардиальным раком [Черноусов Ф.А. и соавт., 2009г.].
В исследовании преобладали пациенты старше 60 лет – 77 из больных (74,8%), преимущественно мужчины – 54 из 103 (52,4%).
Сопутствующие, а по сути дела конкурирующие заболевания со стороны сердечно-сосудистой и дыхательной систем были у 68% (70 из 103) больных.
Распределение пациентов по возрастным подгруппам и структура сопутствующих заболеваний у больных в исследуемой группе представлены на рисунках Рисунок 1. Распределение пациентов по возрастным подгруппам Рисунок 2. Структура сопутствующих заболеваний у больных в исследуемой группе Использовали международную классификацию по системе TNM (7-ая редакция, UICC 2009г), по которой группировали больных по стадиям. В работу были включены преимущественно пациенты с I и II стадиями заболевания – 73 из 103 (70,9%). Данную выборку объясняли тем, что одной результатов хирургического лечения больных с ранними формами рака лимфаденэктомией по поводу рака и возможность развития рецидива заболевания или генерализации опухолевого процесса после такого объема оперативного вмешательства у этих больных.
По гистологической структуре преобладала аденокарцинома - 90,3% всех опухолей, в основном низкой степени дифференцировки – 53 из (51,5%) больных.
После предоперационной подготовки все больные были оперированы.
лимфаденэктомией составило 95,2%, то есть 98 из 103 больных, 5 (4,8%) больным выполняли проксимальные резекции желудка.
В ходе реконструктивного этапа операции после субтотальных дистальных резекций желудка мы чаще всего выполняли реконструкцию с наложением гастродуоденоанастомоза по типу «конец в конец». Данное предпочтение объясняет наш опыт и изучение литературы, которые показывают, что субтотальная дистальная резекция желудка по первому способу Бильрота при раке обеспечивает как необходимый объем резекции органа, так и хорошие непосредственные и отдаленные результаты [Черноусов Ф. А., 2008]. Таким способом оперированы 74 из 103 пациентов, что составляет 71,9% всех больных. Показаниями для выполнения реконструкции по второму способу Бильрота считали распространение опухоли на двенадцатиперстную кишку и необходимость резекции ее метастатических узлов в области привратника. Данный вид оперативного вмешательства перенесли 24 (23,3%) пациента – таблица №1.
Таблица № 1: Характер оперативных вмешательств Субтотальная дистальная резекция лимфаденэктомия Д2/Д2,5/Д Субтотальная дистальная резекция желудка с анастомозом по Бильрот II, лимфаденэктомия Д2/Д2,5/Д Субтотальная проксимальная резекция желудка, лимфаденэктомия Д Комбинированные вмешательства выполнены 9 из 103 (8,7%) больных.
4 (3,9%) - обширная резекция мезоколон, 2 (1,9%) – плоскостная резекция головки поджелудочной железы, 3 (2,9%) – атипичная резекция печени.
оперированных в объеме резекции желудка, оценивали состояние слизистой эзофагогастродуоденоскопии. Был проведен морфологический анализ, а также исследование аномального метилирования генов-супрессоров опухолевого роста CDH1, RASSF1А, MLH1, N33, DAPK и RUNX3.
Известно, что эпигенетические изменения ДНК, к которым относится аномальное метилирования регуляторных районов генов, являются ранними пролиферацию и дифференцировку. Эти изменения создают определенный потенциал молекулярно-генетической нестабильности, который в течение времени может реализоваться в виде опухолевого роста. В настоящее время считается, что аномальное метилирование является опухолевым маркером, который проявляется до клинической манифестации заболевания [Zhao C., Bu X, 2012].
Используемая система молекулярно-генетических маркеров была предложена и ранее опробована на опухолевом материале, полученном в клинике факультетской хирургии имени Н.Н. Бурденко [Быков И.И., 2011].
сравнению с контрольной группой пациентов, имеющих неопухолевые заболевания ЖКТ (при ЖКБ) [Немцова М.В. и соавт.,2013 г].
Из 103 вошедших в исследование больных, ранее оперированных по поводу рака в объеме резекции желудка, у 40 пациентов в биопсийном материале неизмененной слизистой культи желудка, полученном при контрольной эзофагогастродуоденоскопии, определяли аномальное метилирование генов CDH1, RASSF1А, MLH1, N33, DAPK и RUNX3.
«