На правах рукописи

Шошина Наталья Сергеевна

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА БАКТЕРИАЛЬНЫХ

ТОКСИНОВ

03.01.04 Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук.

Научные руководители: доктор химических наук, академик Российской академии наук Гришин Евгений Васильевич кандидат биологических наук Валякина Татьяна Ивановна

Официальные оппоненты: Шишкин Сергей Сергеевич доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук, заведующий лабораторией Румш Лев Давыдович доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук, заведующий лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Российской академии медицинских наук

Защита состоится « 6 » июня 2013г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А. Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1.

Автореферат разослан « » _2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф.Орловский

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Проблема предотвращения угрозы биологической безопасности в настоящее время является приоритетной не только для России, но и для мирового сообщества в целом. Важнейшим направлением по обеспечению биологической безопасности является развитие новых методов диагностики биопатогенов. Одной из самых серьезных угроз является биологический терроризм, который представляет собой использование биологических агентов для нанесения ущерба жизни и здоровью людей. Центральным звеном в системе безопасности человека является оценка риска для здоровья воздействия того или иного агента, оценка его содержания в объектах окружающей среды. К основным современным источникам биологической опасности относятся патогенные микроорганизмы, вирусы, микроскопические грибы и продукты их жизнедеятельности.

Токсические продукты микроорганизмов Vibrio cholerae и энтеротоксигенных Escherichia coli обладают высокой активностью и чрезвычайно токсичны для человека. Эти токсины определяют симптомы таких заболеваний, как холера и «диарея путешественников». Методы диагностики этих заболеваний базируются как на основе классических схем микробиологического анализа, так и на иммунохимических и генно-инженерных методах, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью. Для обнаружения и мониторинга токсинов в лабораторных условиях используют биологические тесты на животных и клеточных культурах, иммунохимические методы, включающие непрямой и конкурентный иммуноанализ, иммупреципитацию, иммунофлуоресцентный анализ или ИФА.

В условиях, требующих определения на присутствие нескольких токсинов в значительном количестве опытных образцов, используются методы мультиплексного анализа. К их числу относятся 2-х мерные и 3-х мерные биочипы, позволяющие проводить параллельное определение нескольких токсинов на одной поверхности и мультиплексный иммунофлуоресцентный анализ (МИА), сочетающий проточную флуориметрию и иммунохимический «сэндвич»-анализ на основе моноклональных антител. Именно этот метод позволяет проводить одновременную детекцию различных токсинов (исчисляемых десятками) в одной анализируемой пробе. Однако формат этого метода требует использования моноклональных антител (как связывающих, так и детектирующих) к токсинам, не проявляющих перекрестной активности ни с одним из других токсинов, присутствующих в пробе. Это требование усугубляется при исследовании в одном образце токсинов, обладающих значительной гомологией, как например, холерного токсина (СТ) и термолабильного энтеротоксина E. coli (LT), обладающих гомологией аминокислотной последовательности (более 80%), пространственной структуры и иммунологических свойств.

Все вышеперечисленное однозначно указывает на актуальность создания тест-системы на основе мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа (МИА) для одновременной количественной детекции СТ и LT в одной анализируемой пробе.

Цели и задачи работы Целью настоящей работы явилось получение моноклональных антител (МА) к холерному токсину и термолабильному энтеротоксину E.coli, а также разработка на их основе тест-системы для одновременной идентификации и количественной регистрации токсинов в биологических образцах.

В ходе работы были решены следующие задачи:

1. Методом гибридомной технологии получены и охарактеризованы моноклональные антитела к холерному токсину и термолабильному энтеротоксину E. coli, не обладающие перекрестной активностью;

2. Из полученных панелей моноклональных антител к холерному токсину и термолабильному энтеротоксину E. coli выбраны пары для количественного определения СТ и LT методом «сэндвич»-ИФА в формате планшета;

3. Разработана биплексная тест-система «сэндвич»-хМАР анализа с применением технологии Luminex для одновременного количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в одном аналите;

4. Показана пригодность разработанной тест-системы идентификации и количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli для объектов окружающей среды и продуктов питания.

Научная новизна Получены моноклональные антитела к двум близкородственным токсинам:

холерному и термолабильному энтеротоксину E. coli, не обладающие перекрестной активностью.

Впервые разработана тест-система на основе «сэндвич»-варианта ИФА для дифференцированной детекции СТ и LT с использованием моноклональных антител в роли связывающих и детектирующих антител.

Впервые создана тест-система для одновременного количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в одном образце методом мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа с применением технологии хМАР.

Практическая значимость работы Полученные результаты дают основания тиражировать в дальнейшем разработанные тест-системы для использования их в мониторинге холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli. в объектах окружающей среды, а образцах пищевых продуктов, в воде. Определение биотоксинов необходимо в больницах для идентификации токсина, вызывающего отравление, и выбора соответствующего лечения.

Публикации По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи из списка журналов, рекомендованных ВАК.

Апробация работы конференциях: XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009);

Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия биоорганической химии и биотехнологии «Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва-Пущино, 2011) Структура работы Диссертационная работа изложена на 120 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка цитируемой литературы, включающего 172 ссылки. Диссертация содержит 20 таблиц и 36 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для успешного создания адекватных иммунохимических тест-систем, позволяющих специфически определять бактериальные токсины, как в моно-, так и в мультиплексном формате, большое значение имеет качество используемых антител. Моноклональные антитела, обладающие свойствами высокой специфичности и аффинности, наилучшим образом подходят для создания подобных тест-систем. Для получения моноклональных антител к CТ и LТ использовали метод гибридомной технологии, в основе которого лежит индуцированное полиэтиленгликолем слияние иммунных лимфоцитов с клетками миеломы.

Для получения гибридом использовали клетки миеломы SP2/0, не секретирующие иммуноглобулины, и лимфоциты, выделенные из подколенных лимфоузлов иммунизированных соответствующим токсином мышей линии Balb/C конвенциональной категории, с естественной микрофлорой, и мышей категории SPF (specific pathogen free), свободных от патогенной микрофлоры. Мышей иммунизировали токсином в подушечки задних лапок, инициируя тем самым развитие в подколенных лимфоузлах локального иммунного ответа, который визуализировали по выраженному увеличению размера узлов. Для иммунизации использовали неполный адъювант Фрейнда. Основанием такого выбора адъюванта послужила имеющаяся в литературе информация о том, что холерный токсин, а также термолабильный энтеротоксин E. coli обладают ярко-выраженными свойствами адъюванта [Bowman С.С., Clements J.D. (2001) Infect Immun. 69(3):

1528–1535]. Применяли достаточно короткие схемы иммунизации мышей, продолжительностью 2 - 4 недели.

Мышей иммунизировали различными дозами холерного токсина дважды и трижды, с интервалом в 14 дней. Титр антител в сыворотке животных определяли общепринятым методом непрямого ИФА. В сыворотке крови мышей категории SPF после иммунизации регистрировали более высокие титры антител по сравнению с титрами в сыворотке крови мышей конвенциональной категории.

Данные схемы иммунизации не обеспечивали очень высоких титров специфических антител в сыворотке крови (1:15000), однако формирование лимфоцитов – предшественников плазматических клеток в лимфоузлах происходило в достаточной степени для получения гибридом, стабильно продуцирующих антитела в высоких титрах в культуральной жидкости. Те же схемы иммунизации, использовали для получения иммунных лимфоцитов, продуцирующих антитела к LT. Для данного антигена титры антител в сыворотке крови животных были выше и составляли 1:50000 и более.

Известно, что CT и LT являются родственными токсинами с высокой степенью гомологии, они подобны не только по функциональным свойствам, но и по структурным и иммунологическим характеристикам. Этот факт определил стратегию по отбору клонов гибридных клеток, продуцирующих специфические антитела. При отборе целевых клонов одновременно определяли специфичность МА к СТ и LT. Гибридомы, продуцирующие антитела с перекрестной активностью в отношении СT и LT, выбраковывали. Следует отметить, что число клонов, продуцирующих антитела, детектирующие как CT, так и LT, было значимым и составляло примерно 30% от общего количества клонов. В результате иммунизированных СТ, с клетками миеломы получили 14 клонов, перекрестно не детектирующих LT, а в результате гибридизации лимфоцитов мышей категории SPF, иммунизированных СТ, получено 20 клонов. В результате гибридизации лимфоцитов мышей категории SPF и конвенциональной категории, иммунизированных LT, с клетками миеломы получено 7 и 8 гибридных клонов соответственно, стабильно продуцирующих специфические МА, не связывающиеся с СТ.

Выделение и очистка моноклональных антител.

Антитела, продуцируемые полученными гибридными клонами, были изотипированы. Для изотипирования использовали кондиционную среду гибридом, культивированных в течение 3 дней. Все анализированные образцы относились к Соответствующие данные представлены ниже в таблицах 1 и 2. Принадлежность антител к классу G обеспечила возможность использовать при очистке МА аффинную хроматографию на протеин-А сефарозе. Для получения препаратов МА использовали стандартный метод культивирования клеток гибридом in vivo в брюшной полости мышей. Объем асцитов обычно составлял 3-5 мл с концентрацией антител 3-4 мг/мл. Степень чистоты препаратов антител составляла не менее 95% согласно электрофоретическим данным.

Характеристика моноклональных антител к холерному токсину.

Характеристика МА включала их изотипирование, а также определение констант аффинности. Результаты представлены в таблице 1.

Как следует из приведенных в таблице данных, 13 клонов продуцируют IgG1, 2 клона – IgG2a, 2 клона - IgG2b и 7 клонов - IgG3. Легкие цепи всех иммуноглобулинов относились к –типу. В таблице приведены величины констант аффинности (Кафф.) антител, определенные согласно методу Битти [Beatty J.D et al., (1987) J. Immunol. Methods. 100:173–179]. Величины констант варьировали от 0, х109 до 2,9х109 М-1, что свидетельствовало о высокой степени связывания полученных моноклональных антител с холерным токсином.

Характеристика моноклональных антител к термолабильному Моноклональные антитела к LT характеризовали аналогично антителам к СТ. Было проведено изотипирование моноклональных антител, согласно которому, все антитела относятся к классу иммуноглобулинов G: 13 клонов принадлежат к подклассу IgG1, один - к IgG2а и один - к IgG3 (на таблице 2 представлены 10 из клонов). Легкие цепи всех иммуноглобулинов относятся к –типу.

Значения констант аффинности (Кафф.) антител, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой степени связывания полученных моноклональных антител с термолабильным энтеротоксином E. coli. Значения констант варьируют от 0,16 х109 до 2,0 х109 М-1.

Таблица 2. Характеристики моноклональных антител к термолабильному Подбор пар моноклональных антител для детекции CT методом Одним из методов выявления бактериальных токсинов в аналитических концентрациях является «сэндвич»-вариант ИФА. В данном формате высокая чувствительность достигается применением двух МА к различным эпитопам молекулы токсина, так называемых, связывающих и детектирующих антител.

Связывающие антитела иммобилизованы на поверхности лунок планшета, а детектирующие представляют собой меченые биотином антитела. Для мечения детектирующих МА использовали сукцинимидный эфир биотина. С целью подбора пары антител, позволяющей в «сэндвич»-ИФА выявлять СТ с высокой чувствительностью, все полученные антитела тестировали как в качестве связывающих, так и в качестве детектирующих антител. Для этого каждое из полученных антител (см. табл. 1) было биотинилировано. Таким образом, все антитела были представлены в нативном виде и в виде биотинилированных производных. Из полученных спектров антител подбирали пары, позволявшие выявлять холерный токсин с минимальной детектируемой концентрацией (МДК) менее 1 нг/мл. Отобранные пары МА в отсутствии токсина не связывались друг с другом и таким образом не формировали в пробах значимого неспецифического фона. Подобранные пары антител не взаимодействовали с LT. Пары таких антител приведены в табл. 3. Для определения чувствительности «сэндвич»-варианта ИФА детекции СТ в буфере использовали двоичные и троичные разведения CT в интервале концентрации от 1 мкг/мл до 0,1 нг/мл. МДК СТ, определяли как концентрацию, соответствующую значению оптического поглощения, превышающего не менее чем на три стандартных отклонения оптическое поглощение многократно измеренной нулевой точки (в отсутствии токсина). Пары антител оценивали по соответствующим величинам МДК.

Таблица 3. Пары моноклональных антител, выявляющие в «сэндвич»-анализе холерный Связывающие Детектирующие МДК Связывающие Детектирующие МДК Как видно из представленных в таблице данных, пары антител F5H3-D6G7, F5H3-E6E10 и F5H3-B1F8 выявляли СТ с МДК составляющей 0,2 нг/мл токсина.

При использовании антител D6G7, E6E10, B1F8 в качестве связывающих, а антитела F5H3 в качестве детектирующего, величины МДК увеличивались и составляли более 1 нг/мл холерного токсина.

Рисунок 1. Зависимость оптического поглощения при 490 нм анализируемых проб от концентрации токсина при тестировании холерного токсина методом «сэндвич»-ИФА с использованием пары антител F5H3-B1F8biot. В нижнем правом углу приведен калибровочный график, соответствующий области низких концентраций CT. Пунктирной линией обозначено значение оптической плотности, превышающее среднее значение оптической плотности нулевой пробы на три стандартных отклонения. Концентрация СТ при этом значении оптической плотности соответствует МДК.

Оптимальная композиция антител в «сэндвич»-варианте состояла из пар, в которых связывающим антителом было F5H3, а в качестве детектирующего каждое из трех других антител. МДК СТ при использовании вышеозначенных пар антител была сравнимой и составляла 0,2 нг/мл холерного токсина (рис. 1).

Подбор пар моноклональных антител для детекции термолабильного энтеротоксина E. coli методом «сэндвич»-ИФА.

Из пулов МА к LT, выделенных из асцитной жидкости мышей, и их биотинилированных производных подбирали пары антител, которые выявляли термолабильный энтеротоксин E. coli с чувствительностью, не превышающей нг/мл. Эти антитела не связывались друг с другом в отсутствии токсина, и перекрестно не взаимодействовали с холерным токсином (табл.4).

Как следует из данных таблицы 4 антитела F5G2, 1B1G6F2, B11G11 и G11F12 наилучшим образом проявили себя в качестве детектирующих антител.

Они определяли практически со всеми связывающими антителами высокий уровень чувствительности. Именно эти антитела имели самые высокие константы аффинности (табл. 2) порядка 109 М-1.

Таблица 4. Пары моноклональных антител, выявляющие в формате «сэндвич»-ИФА термолабильный энтеротоксин E. coli. с чувствительностью ниже 1 нг/мл Связывающие Детектирующие Нижний Связывающие Детектирующие Нижний Минимальный предел детекции LT составил 0,4 нг/мл для пар B11G11F5G2biot, E11F4 - F5G2biot (рис. 2), F5G2- B11G11biot, D2E4- B11G11biot и B11G11- B11G11biot, в которых связывающие антитела также имели высокие константы аффинности.

Рисунок 2. Зависимость оптического поглощения при 490 нм анализируемых проб от концентрации LT при тестировании термолабильного энтеротоксина E. coli методом «сэндвич»-ИФА с использованием пары антител E11F4-F5G2biot. В нижнем правом углу приведен калибровочный график, соответствующий области низких концентраций LT.

Пунктирной линией обозначено значение оптической плотности, превышающее среднее значение оптической плотности нулевой пробы на три стандартных отклонения.

Концентрация LТ при этом значении оптической плотности соответствует МДК.

Следует подчеркнуть, что при создании иммунохимических тест-систем большое значение имеет не только нижний предел детекции системы, но и уровень фона, определяемый неспецифическим взаимодействием между связывающими и детектирующими антителами в отсутствии анализируемого антигена. Кроме того, решающим фактором является отсутствие перекрестной активности антител с родственным холерным токсином. Нами были выбраны, принимая во внимание вышесказанное, следующие пары антител: E11F4-F5G2biot, F5G2-1B1G6F2biot и F5G2-B11G11biot.

Детекция и количественное определение холерного токсина и термолабильного энтеротоксина в образцах различной природы методом Тест-системы разрабатывались для выявления токсинов в объектах окружающей среды и в биологических жидкостях человека. Было изучено влияние некоторых продуктов питания, таких как молоко или мясной бульон, воды из чувствительность определения СТ методом «сэндвич»-ИФА в формате планшета для пары антител F5H3-B1F8biot и LT для пары E11F4-F5G2biot (табл. 5).

Таблица 5. Минимальные детектируемые концентрации холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в продуктах питания, в воде из открытого водоема и в носоглоточных смывах в нг/мл, определенные методом «сэндвич» - ИФА Из данных таблицы 5 следует, что МДК СТ в контрольном образце (в PBS) и в опытных образцах не отличается друг от друга и составляет 0,2 нг/мл, что делает разработанную систему пригодной для обнаружения CТ в объектах окружающей среды. Однако присутствие биологического материала в испытуемых пробах значительно снижает аналитическую чувствительность LT, что может быть связано иммуноглобулинов, способных связывать LT, и тем самым снижать содержание свободного токсина в анализируемой пробе. Увеличение МДК LT можно также объяснить его возможным связыванием с ганглиозидом Gm1, который содержится в молоке в заметных количествах и нейтрализует токсическую активность как LT так и CT [Laegreid A. et al (1986), Pediatr Res. 20(5):416-21.] CT и LT являются энтеротоксинами, поражающими желудочно-кишечный тракт, поэтому представлялось целесообразным провести количественное определение экзогенных препаратов CT и LT, внесенных в секреты здоровых доноров, а именно, в смывах со слизистой носоглотки, доступных в условиях лаборатории. Результаты исследования по подготовке проб образцов смывов для определения в них CT и LT методом «сэндвич»-ИФА на планшетах приведены в таблице 5.

Как следует из литературного обзора (см. стр.34) значения МДК известных иммуноферментных тест-систем дифференцированной детекции СТ и LT с применением моноклональных и поликлональных антител составляет 0,1 нг/мл.

Нами получены пары моноклональных антител, позволяющие детектировать СТ и LТ в буфере с МДК сравнимой с МДК вышеназванной тест-системы, а именно 0, нг/мл для СТ и 0,4 нг/мл для LT. МДК СТ и LT разработанной тест-системы на порядок превышает МДК коммерческой тест-системы VET-RPLA detection kit (Oxoid), используемой для детекции СТ и LT методом непрямой пассивной латексной агглютинации, позволяющий определять энтеротоксины в концентрации 1-2 нг/мл. Данные пары антител пригодны для определения токсинов в биологических образцах. Следует отметить отсутствие перекрестного связывания МА к CТ с термолабильным энтеротоксином E. coli (LT), а антител к LT с холерным токсином.

Разработка биплексной тест-системы на основе хМАР технологии для детекции холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli.

Разрабатываемая тест-система на основе хМАР технологии является разновидностью «сэндвич»-варианта ИХА метода, в котором связывающие антитела иммобилизованы на твердом носителе - полистирольных гранулах (микросферы) диаметром 5,6 мкм. Использующиеся в методе микросферы уникальны по спектральным характеристикам, обусловленным комбинацией внутренних флуорофоров. Детектирующие антитела – вторые из подобранной пары - мечены фикоэритрином. Детекцию флуоресцентной метки проводили, используя компактный проточный флуоресцентный анализатор (Luminex 200) с программным обеспечением для обработки результатов Luminex IS 2.3.

Полученные высокочувствительные и моноспецифические МА к LT и СТ определили возможность разработки биплексной иммунофлуоресцентной тестсистемы на основе xMAP технологии.

При разработке биплексной тест-системы на первом этапе работы исследовали пригодность отобранных методом «сэндвич»-ИФА пар МА в х-МАР анализе. Для разработки тест-системы на основе хМАР-анализа использовали пары антител к CT (F5H3-B1F8biot, F4F4-B1F8biot, F4F4-E6E10biot) и 5 пар антител к LT (E11F4-F5G2biot, E11F4-1B1G6F2biot, E11F4-B11G11biot, F5G2B1G6F2biot и F5G2-B11G11biot). Антитела, используемые в биплексном анализе, также как и в «сэндвич»-ИФА в формате планшета не обладали перекрестной активностью по отношению к другому анализируемому антигену и антителам характеризовались минимальными значениями фонового сигнала.

Получение конъюгатов микросфер с моноклональными антителами к Ключевым звеном в хМАР технологии является структура конъюгата микросфер со связывающими антителами.

связывающих антител, являющихся оптимальными на основании результатов подбора пар МА методом «сэндвич»-ИФА (см. табл.3,4). Связывающие МА к карбодиимидным способом в соответствии со стандартным протоколом.

Для каждого МА подбирали оптимальные условия конъюгирования. С этой целью конъюгацию микросфер проводили с различными количествами МА (25, 5 и 1 мкг). При разработке тест-системы для определения холерного токсина спектральный адрес (ID) 29. В качестве связывающих CT антител использовали F5H3 и F4F4. Для определения LT использовали карбоксилированные микросферы хМАР 136 (ID36). В качестве связывающих LT антител использовали МА E11F4 и F5G2.

количествами связывающих антител оценивали по интенсивности флуоресценции полученного комплекса с поликлональными кроличьими антимышиными иммуноглобулинами, меченными фикоэритрином. В экспериментах использовали различные концентрации поликлональных кроличьих антимышиных меченых фикоэритрином иммуноглобулинов с целью выявления пула микросфер с оптимальным содержанием связывающих антител.

Максимальную интенсивность флуоресценции при минимальном неспецифическом фоне наблюдали для микросфер, конъюгированных с антителами F4F4 и F5H3 в количестве 1 и 5 мкг, а для антител E11F4 и F5G2 - 1 мкг. На рисунке 3 в качестве примера приведена графическая зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала конъюгатов микросфер ID 29 с антителами F4F4 от концентрации поликлональных антитмышинных антител, меченых фикоэритрином.

Рисунок 3. Зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала комплекса иммобилизованных на микросферах антител F4F4, с поликлональными антимышиными антителами, меченными фикоэритрином, от концентрации антимышиных антител. 1 – кривая, полученная для микросфер, конъюгированных с F4F4 в количестве 1 мкг; 2 микросфер, конъюгированных с F4F4 в количестве 5 мкг; 3 - микросфер, конъюгированных с F4F4 в количестве 25 мкг.

Проведение экспериментов по определению оптимального количества связывающих антител конъюгированных с микросферами, является обязательным для характеристики эффективности конъюгации.

Определение оптимальных концентраций детектирующих антител.

На следующем этапе работы для отобранных конъюгатов связывающих антител с микросферами осуществляли подбор оптимальных концентраций детектирующих антител, меченых биотином.

В экспериментах использовали четыре концентрации биотинилированных антител – 0,5, 1,0, 2,0 и 4,0 мкг/мл и три концентрации токсина – 30, 300 и пг/мл. Максимальную интенсивность флуоресценции при минимальном неспецифическом фоне наблюдали при концентрации детектирующих антител В1F8 2 мкг/мл, для антител E6E10 - 4 мкг/мл, для F5G2 – 2 мкг/мл, а для 1B1G6F – 1 мкг/мл. На рисунке 4 в качестве примера приведена графическая зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала конъюгатов микросфер со связывающими антителами F5H3 от концентрации СТ при различных концентрациях детектирующих антител B1F8biot.

Рисунок 4. Зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала в пробах, содержащих микросферы F5H3хМАР129, и детектирующие антитела B1F8 biot в концентрациях 0,5, 1,0, 2,0 и 4,0 мкг/мл, от концентрации СТ. 1 - кривая, полученная с использованием биотинилированных антител в концентрации 4 мкг/мл, 2 – 2 мкг/мл, 3 – мкг/мл, 4 – 0,5 мкг/мл.

В таблице 6 приведены оптимальные количества связывающих антител, использованных в конъюгации с микросферами ID29 и ID36, и оптимальные концентрации детектирующих антител, определяющие максимальную интенсивность медианного флуоресцентного сигнала.

Таблица 6. Пары МА отобранные для хМАР - анализа токсинов СТ и LT.

Токсин Определение минимальной детектируемой концентрации CT и LT в буфере методом биплексного иммунофлуоресцентного анализа с применением Определяли минимальную детектируемую концентрацию CT и LT в буфере PBS-BSA. Микросферы, с иммобилизованными на них специфическими МА к CT и LT, инкубировали с соответствующими токсинами в различных концентрациях.

Образовавшийся комплекс токсина с микросферами детектировали с помощью биотинилированных антител. МДК была определена в соответствии с общепринятыми стандартами как концентрация, соответствующая среднему уровню флуоресцентного сигнала аналита, превышающему среднее значение фонового сигнала флуоресценции плюс три стандартных отклонения. В таблице приведены величины МДК для СТ и LT.

Таблица 7. Минимальные детектируемые концентрации СТ и LT, определенные в хМАР анализе, с участием различным пар связывающих антител, иммобилизованных на микросферах, и детектирующих антител, несущих биотиновую метку.

Самые низкие значения МДК для CT (10 пг/мл) показаны при использовании связывающих антител F4F4 и F5H3, конъюгированных с микросферами и работающих в паре с детектирующими антителами B1F8 биот. Для связывающих антител Е11F4, конъюгированных с микросферами, работающих в паре с детектирующими F5G2-биот. показана наибольшая аналитическая чувствительность определения LT, составляющая 80 пг/мл. Для указанных пар антител изучена зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала от концентрации токсинов LT и СТ при использовании для определения СТ связывающих антител F4F4, иммобилизованных на микросферах, и детектирующих B1F8 biot, для определения LT связывающих антител E11F4, иммобилизованных на микросферах, и детектирующих F5G2 biot. Результаты представлены в виде графиков (рис.5).

Рисунок 5. Зависимость интенсивности медианного флуоресцентного сигнала в пробах от концентрации холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E.coli.

нескольких токсинов в одном образце требует присутствия в анализируемой пробе смеси микросфер, конъюгированных со связывающими антителами к каждому из токсинов, детектирующих антител, также специфичных к каждому из токсинов, и смеси анализируемых токсинов. Одним из обязательных условий успешного применения данной тест-системы является отсутствие неспецифического взаимодействия между антителами разной специфичности. С этой целью предварительно производили подбор комбинации пар связывающих и детектирующих антител, характеризующейся минимальным неспецифическим фоном. Схема анализа приведена ниже:

1. микросферы с иммобилизованными связывающими антителами к к СТ и LT инкубировали с одним из токсинов и с соответствующими ему детектирующими антителами, 2. микросферы с иммобилизованными связывающими антителами к CT и LT инкубировали c CT и LT и с детектирующими антителами специфичными к одному из токсинов, 3. микросферы с иммобилизованными связывающими антителами к СТ и LT инкубировали с CT и LT и смесью детектирующих антител, специфичным к обоим токсинам.

Эксперименты по биплексному определению CT и LT в одном аналите проводили в соответствии с представленной схемой.

Неспецифической агрегации антител в биплексном анализе выявлено не было. Значения флуоресцентного сигнала в отсутствии токсинов для пары связывающих антител F4F4, иммобилизованных на микросферах и детектирующих антител B1F8 biot составила 5 единиц флуоресценции (ед. фл.). Для пары связывающих антител E11F4, иммобилизованных на микросферах, и детектирующих F5G2 biot фоновый сигнал составил 8,5 ед. фл. Важно, что фоновые сигналы, полученные для тех же пар антител в индивидуальном анализе, отличались несущественно и составили 5 и 6,5 ед. фл. соответственно. На рисунке 6 приведены результаты биплексного анализа.

Рисунок 6. Зависимость интенсивности сигнала флуоресценции от концентрации CT и LТ в хМАР анализе, проведенном с участием двух пулов микросфер, конъюгированных с антителами F4F4 и с E11F4, с детектирующими антителами B1F8 biot и F5G2 biot. В верхнем левом углу приведен график, соответствующий области низких концентраций CT и LT. Пунктирной линией обозначены медианные значения флуоресцентного сигнала, превышающие на три стандартных отклонения средние значения MFI нулевых проб.

Из данных, приведенных на рисунке 6, видно, что с увеличением концентрации обоих токсинов, увеличивается интенсивность медианных флуоресцентных сигналов образовавшихся комплексов связывающих антител F4F и E11F4, иммобилизованных на микросферах, с токсинами СТ и LT и детектирующими антителами B1F8 biot и F5G2 biot. Следует отметить, что величина МДК СТ меньше величины МДК LT, что согласуется с данными, полученными при хМАР анализе этих токсинов, проведенном в индивидуальном анализе.

Для определения МДК проведен хМАР анализ с подробным титрованием токсинов в области низких концентраций. Холерный токсин титровали от 10 до пг/мл с последовательным двукратным разведением, а термолабильный энтеротоксин E. coli от 25 до 800 пг/мл также с последовательным двукратным разведением. Данные приведены в таблице 8.

Таблица 8. Минимальные концентрации холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli детектируемые в биплексном иммунофлуоресцентном анализе с применением технологии Luminex и в «сэндвич»-ИФА в формате планшета.

В таблице также представлены значения МДК для CT и LT, регистрируемые в тест-системах формата хМАР анализа и «сэндвич»-ИФА. МДК токсинов, определенные с применением технологии хМАР, на порядок превосходят МДК токсинов, определяемые с помощью «сэндвич»-ИФА в формате планшета.

Таким образом, было показано, что полученные нами моноклональные антитела, как иммобилизованные на поверхности микросфер, связывающие МА, так и детектирующие биотинилированные МА могут быть использованы в биплексном анализе, поскольку они неспецифически не взаимодействуют при совместном использовании. МДК для СТ в биплексном анализе составила 10 пг/мл, МДК для LT - 80 пг/мл. Следует отметить, что МДК токсинов, определенные в буфере с применением разработанной тест-системы, значительно превосходят аналогичные показатели, зарегистрированные для известных тест-систем.

Разработанная японскими авторами [Koike N et al. (1997) FEMS Immunology and microbiology, 17, 21-25] иммуноаналитическая тест-система для качественной одновременной детекции CT и LT представляет собой модифицированный ИФА в формате нейлонового слипа и позволяет определять эти токсины в концентрации нг/мл. Разработанная в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгарта РАН тест-система для одновременного количественного определения 15 токсинов с применением технологии гидрогелевых биологических микрочипов [Филлипова М.

(2011) Автореф. дисс.], позволяет определять CT и LT с МДК 1 и 10 нг/мл соответственно.

Детекция и количественное определение холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в продуктах питания в формате В следующей серии экспериментов оценивали возможность использования разработанной тест-системы для количественного определения CT и LT в сложных биологических образцах, содержащих компоненты, способные влиять на качество анализа. Такими биологическими образцами в наших экспериментах явились молоко, мясной бульон, смыв со слизистой носоглотки человека, вода из открытого водоема. В этих образцах могут обнаруживаться холерный вибрион, энтеротоксигенная кишечная палочка, а также продуцируемые ими токсины. С целью моделирования природных условий токсины разводили до концентрации мкг/мл и добавляли в молоко, бульон, в смывы со слизистой носоглотки здорового человека и в воду из открытого водоема, после чего делали соответствующие разведения и определяли количество экзогенного токсина.

Следует отметить, что в молоке наблюдали снижение чувствительности определения LT (табл. 9), что выражалось в значительном уменьшении величин флуоресцентного сигнала. МДК СТ в молоке практически не увеличивался, по сравнению с аналитической чувствительностью данного токсина в буфере (табл. 9).

Снижение интенсивности медианного флуоресцентного сигнала при определении LT в молоке, могло быть обусловлено совлечением токсина в осадок, в процессе пробоподготовки при центрифугировании образцов молока. Для проверки этого предположение был проведен анализ токсинов в молоке без предварительного центрифугирования образцов. Было показано, что величины МДК токсинов в центрифугированных образцах молока не отличалась от таковых в нецентрифугированных образцах (данные не приводятся). Однако в образцах молока без центрифугирования наблюдали высокую степень агрегации микросфер, что делало затруднительным определение токсинов данным методом, по причине существенного увеличения времени сбора данных для каждой пробы. Более того, снижение чувствительности определения LT при определении в молоке, повидимому, могло происходить за счет присутствия в нем значительного количества эндогенных иммуноглобулинов. Разведение молока буфером и центрифугирование пробы позволяли определять в нем LT, с более низкой чувствительностью по сравнению с образцами молока без разведения. Следует отметить, что тенденция изменения величин МДК, определенных в формате биплексного хМАР-анализа токсинов в молоке относительно величин МДК в модельном буфере соответствует изменениям величин, полученным методом «сэндвич»-ИФА (Табл.9). Из данных таблицы следует, что увеличение МДК LT в молоке по сравнению с МДК LT в PBS-BSA, наблюдалось в обоих случаях, однако, значения МДК определенные с использованием хМАР анализа на 1 порядок выше соответствующих значений МДК, определенных методом «сэндвич»-ИФА в формате планшета.

Таблица 9. Минимальные детектируемые концентрации (нг/мл) холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в буфере, молоке, бульоне, смывах со слизистой носоглотки человека и в воде из открытого водоема, определенные методами «сэндвич» ИФА в формате планшета и биплексного анализа с применением технологии Luminex.

Биплексное определение CT и LT проводили также в мясном бульоне. Для этой цели использовали коммерческий концентрат мясного бульона, разведенный в соответствии с прилагающейся инструкцией. Токсины добавляли в бульон, центрифугировали и проводили анализ. Для LT наблюдали снижение чувствительности детекции токсина и интенсивности флуоресцентного сигнала как в разбавленных, так и в неразбавленных образцах бульона. Величины МДК существенно увеличивались по сравнению с соответствующими величинами для контрольного буфера. В табл. 9 приведены данные, полученные методами биплексного анализа и «сэндвич»-ИФА двух токсинов в бульоне и модельном буфере. Из приведенных результатов видно, что МДК LT, определенная в бульоне методом ИФА, почти в 10 раз больше величины МДК LT в буфере, в то же время МДК CT, определенная в бульоне, статистически не отличается от МДК СТ, определенной в модельном буфере. При этом, также как и в пробах молока, величины МДК токсинов в бульоне выше на порядок при определении в формате биплексного анализа, чем при использовании «сэндвич»-ИФА в формате планшета.

Смывы со слизистой оболочки носоглотки человека готовили для количественного определения в них CT и LT путем разведения в PBS-BSA, внесения в образец соответствующего токсина и последующего центрифугирования. В смывах со слизистой носоглотки наблюдали для токсинов небольшое снижение чувствительности определения. Для СТ МДК в этой среде составляла 90 пг/мл, и для LT - МДК - 800 пг/мл. Данные находились в соответствии с результатами, полученными в «сэндвич»-ИФА токсинов в этих образцах (табл. 9).

Вместе с загрязненными ливневыми, талыми и сточными водами в озера и реки попадают представители нормальной микрофлоры человека и животных (кишечная палочка, цитробактер, энтеробактер, энтерококки, клостридии) и возбудители кишечных инфекций (брюшного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, лептоспироза, энтеровирусных инфекций и др.). Вода является фактором передачи возбудителей многих инфекционных заболеваний. Некоторые возбудители могут размножаться в воде, например, холерный вибрион. Поэтому важно дифференцированно определять LT и СТ в образцах воды [Cabral J.P.S.

(2010)]. Образцы воды из открытого водоема готовили следующим образом: в воду добавляли токсины в различных концентрациях, пробы фильтровали, центрифугировали, отбирали надосадочную жидкость и в ней проводили определение токсинов методом биплексного анализа. МДК CT и LT в воде практически не отличалась от соответствующих величин для этих токсинов в буфере (Табл. 9). Наблюдалось лишь незначительное снижение интенсивности флуоресценции, не влияющее на величины МДК. Следовательно, разработанная тест-система биплексного определения LT и СТ в буфере позволяет определять эти токсины в пробах воды из открытого водоема без потери чувствительности.

Таким образом, впервые было показано, что разработанная тест-система позволяет одновременно проводить детекцию CT и LT в воде и в образцах биологической природы с высокой чувствительностью.

ВЫВОДЫ

1. Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к холерному токсину и к термолабильному энтеротоксину E coli. Антитела к каждому из токсинов не взаимодействуют с другим токсином. МА к обоим токсинам относятся к иммуноглобулинам класса G. Величины констант аффинности МА к СТ варьируют от 0,11х109М-1 до 2,9х109М-1; МА к LT от 0,16х109М-1 до 2,0 х109М-1.

2. Из панелей антител подобраны пары связывающих и детектирующих МА для количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в «сэндвич»-ИФА в формате планшета. МДК, определенная в модельном буфере составила 0,2 нг/мл для СТ, 0,4 нг/мл для LT. Впервые создана тест-система на основе МА для специфической детекции СТ и LT.

3. Подобраны комбинации пар МА для количественного определения холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli в модельном буфере методом хМАР-анализа. Величины МДК СТ (0,01 нг/мл) и LT (0,08 нг/мл) существенно выше соответствующих величин МДК, определенных в формате «сэндвич»-ИФА.

4. Величины МДК СТ в разработанных тест-сиcтемах, определенные в образцах молока, мясного бульона, воды из открытого водоема и носоглоточных смывов, сравнимы с величиной МДК СТ, определенной в модельном буфере.

Величины МДК LT, определенные в образцах молока, мясного бульона и носоглоточных смывов превышают соответствующие значения для МДК LТ в модельном буфере и воде из открытого водоема.

5. Впервые создана высокочувствительная иммунофлуоресцентная тестсистема на основе хМАР технологии с использованием системы Luminex для одновременной детекции холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E.

coli в буфере, биологических пробах и продуктах питания.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ

ПУБЛИКАЦИЯХ

Статьи:

1. Е. Э. Петрова, Р. Л. Комалева, О. Е. Лахтина, Л. В. Самохвалова, Н. А.

Калинина, Н. С. Шошина, А. Ю. Рубина, М. А. Филиппова, Ю. В. Вертиев, Т. И.

Валякина, Е. В. Гришин. Получение и характеристика моноклональных антител к холерному токсину (2009) Биоорганическая химия. 35 (3) 357- 2. Т. И. Валякина, О. Е. Лахтина, Р. Л. Комалева,, М.А. Симонова, Л. В.

Самохвалова, Н. Н. С. Шошина, А. Калинина, А. Ю. Рубина, М. А. Филиппова, Ю.

В. Вертиев,, Е. В. Гришин. Получение и характеристика моноклональных антител к дифтерийному токсину (2009) Биоорганическая химия. 35 (5) 618-628.

3. Simonova MA, Valyakina TI, Petrova EE, Komaleva RL, Shoshina NS, Samokhvalova LV, Lakhtina OE, Osipov IV, Philipenko GN, Singov EK, Grishin EV.

Development of xMAP Assay for Detection of Six Protein Toxins (2012) Anal. Chem.

84, 6326- Тезисы конференций:

4. Н.С. Шошина, Е.Э. Петрова, Р.Л. Комалева, О.Е. Лахтина, Л.В.

Самохвалова, Н.А. Калинина, М.А. Филиппова, Т.И. Валякина, Е.В. Гришин.

Получение моноклональных антител к холерному токсину с целью создания высокочувствительных тест-систем. Тезисы докладов XXI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Россия, Москва, 9-11 февраля 2009, стр. 5. М.А. Симонова, Н.С. Шошина, Т.И. Валякина Получение моноклональных антител к дифтерийному токсину с целью создания высокочувствительных тестсистем. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова, Москва-Пущино, 2009, сборник тезисов, стр. 6. Н.С. Шошина, М.А. Симонова, О.Е. Лахтина, Е.Э. Петрова, Р.Л. Комалева, Т.И. Валякина. Иммуноаналитические методы мониторинга холерного токсина и термолабильного энтеротоксина E. coli с использованием моноклональных антител. Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова». Москва-Пущино, 2011, сборник тезисов, том 2, стр. 77.

7. М.А. Симонова, Т.И. Валякина, Е.Э. Петрова, Р.Л. Комалева, Н.С. Шошина, Е.В. Гришин. Применение технологии хМАР в разработке тест-систем для иммунохимической детекции белковых токсинов. Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова». Москва-Пущино, 2011, сборник тезисов, том 1, стр.