WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Илюшин Денис Григорьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИ

МОДИФИЦИРОВАННОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ

БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO И IN VIVO

Специальность 03.01.03 – «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

Работа выполнена в Лаборатории биокатализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М.

Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).

Научные руководители: Доктор биологических наук Пономаренко Наталья Александровна Кандидат химических наук Смирнов Иван Витальевич

Официальные оппоненты: Деев Сергей Михайлович, доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии Федерального государственном бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).

Лагарькова Мария Андреевна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией генетических основ клеточных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук (ИОГЕН РАН).

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН).

Защита состоится «14» мая 2013 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.

Автореферат разослан «10» апреля 2013 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат фармацевтических наук Грабовская Любовь Сергеевна

I. ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы В конце 1930-х гг. в качестве инсектицидов был синтезирован ряд фосфорорганических токсинов (ФОТ). Доступность ряда ФОТ в странах с развивающейся аграрной экономикой приводит к частым случаям отравлений и летальных интоксикаций. По данным Всемирной организации здравоохранения бытовое летальное отравление ФОТ получает более 300 000 человек в год. Несмотря на то, что 185 государств в 1992 г. присоединились к Конвенции «О запрещении химического оружия», сохраняется угроза использования нервно-паралитических агентов и других ФОТ в ходе военных действий и террористических актов.

Методы медикаментозного лечения отравлений фосфорорганическими токсинами на настоящий момент обладают целым рядом побочных эффектов. Альтернативным подходом к терапии и профилактике отравлений ФОТ является использование биологических антидотов. В качестве таких антидотов могут выступать антитела и ферменты, которые изолируют и инактивируют высокотоксичные соединения до того, как те достигнут своей биологической мишени. Из всех потенциальный кандидатов на роль биологического антидота против ФОТ только бутирилхолинэстераза (БуХЭ, ЕС 3.1.1.8) плазмы крови человека в 2006 г. получила статус «New development drug» (Новый лекарственный препарат, подлежащий дальнейшей разработке – англ.) от Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA).

Обзор современных биотехнологических методов получения БуХЭ позволяет сделать следующие выводы.

1. Получение БуХЭ из плазмы крови человека (чБуХЭ) – дорогостоящий процесс, осложненный возможностью контаминации препарата патогенами из зараженной плазмы.

2. Попытки экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека (рчБуХЭ) в клетках бактерий и дрожжей не привели к получению активного фермента;

3. Проект создания трансгенных животных в качестве источника рчБуХЭ закрыт в связи с нерентабельностью производства.

4. Несмотря на высокий уровень продукции активной рчБуХЭ в трансгенных растениях, применение этого препарата в качестве медикамента невозможно, так как на сегодняшний день FDA не одобрило использование трансгенных растений для получения препаратов рекомбинантных белков, пригодных для инъекции в кровь человека.

5. Из всех существующих на сегодняшний день систем экспрессии рчБуХЭ, только клетки линии CHO (Chinese hamster ovary cells - англ., клетки яичников китайского хомячка) полностью удовлетворяют требованиям FDA, однако низкий уровень продукции делает применение этой системы в промышленных масштабах нерентабельным.

Таким образом, на сегодняшний день не существует эффективной и экономически –3– выгодной системы экспрессии рчБуХЭ, пригодной для инъекции в кровь.

Цель работы и основные задачи исследования Цель работы состояла в создании эффективной системы экспрессии рекомбинантной БуХЭ человека и исследовании функциональной активности полученного фермента в экспериментах in vitro и in vivo. Для ее достижения были поставлены следующие экспериментальные задачи:

';

1. создание эффективной эукариотической системы экспрессии функционально активной БуХЭ человека;

2. изучение физико-химических свойств рекомбинантной БуХЭ человека;

3. оптимизация фармакокинетических характеристик рекомбинантного фермента;

4. определение эффективности полученного препарата рчБуХЭ для профилактики отравлений ФОТ.

Научная новизна и практическая значимость работы Для получения рекомбинантной БуХЭ человека была выбрана система экспрессии на основе клеток линии CHO, которая сертифицирована для синтеза медикаментозных препаратов на основе рекомбинантных белков. Ген БуХЭ был клонирован под контроль промотора фактора элонгации полипептидной цепи (EF–1). После проведения стабильной трансфекции и оптимизации условий продукции на специализированных безбелковых ростовых средах удалось получить клон А3 продуцирующий до 30 мг рчБуХЭ на литр ростовой среды, что как минимум на порядок выше, чем в ранее разработанных системах. Для изменения олигомерного состава рекомбинантного фермента клон А3 был трансфицирован фрагментом ДНК, несущим ген обогащенного остатками пролина пептида PRAD под контролем промотора EF–1. В результате отбора был получен стабильный клеточный клон А3Н9, продуцирующий БуХЭ в форме димера и тетрамера. Опыты на мышах линии BALB/c показали, что фармакокинетические параметры полученной рчБуХЭ не позволяют эффективно использовать рекомбинантный фермент для профилактики отравлений ФОТ.

Для радикального увеличения времени полувыведения препарата рчБуХЭ из крови была предложена химическая модификация гомополимерами N-ацетилнейраминовой кислоты – сиалирование. В отличие от полимеров этиленгликоля, широко применяемых для модификаций рекомбинантных белков, гетеро- и гомополимеры сиаловой кислоты являются биодеградируемыми молекулами, не токсичны и не накапливаются в тканях и внутренних органах. Таким образом, модификация полисиаловыми кислотами позволяет снизить риск возможных побочных действий рчБуХЭ, тем самым лучше вписываясь в концепцию биологического антидота. Применение комбинаторного подхода позволило определить оптимальные условия реакции химического полисилирования рчБуХЭ, при которых удалось добиться не менее 80% выхода реакции при относительно невысокой (не более 10%) потере удельной активности рекомбинантного фермента.

Полученный конъюгат рчБуХЭ с гомополимерами сиаловой кислоты (рчБуХЭ– САО27) был подвергнут всестороннему анализу in vitro и in vivo. Установлено, что химическая модификация полисиалированием не влияет на олигомеризацию рчБуХЭ. Масс-спектрометрическое исследование конъюгата рчБуХЭ–САО27 позволило выявить по меньшей мере 6 потенциальных сайтов модификации рекомбинантного фермента. Сравнение кинетических констант (KM, kcat, KSS и b) гидролиза бутирилтиохолин иодида модифицированной и немодифицированной рекомбинантной рчБуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что полученные значения отличались от известных из литературы в пределах ошибки, что свидетельствует об интактности активного центра фермента и его окружения. Фармакокинетические испытания in vivo на мышах линии BALB/c свидетельствуют о том, что в результате химического полисиалирования время полувыведения конъюгата рчБуХЭ–САО27 возросло в 5, раз по сравнению с немодифицированной рчБуХЭ и стало сопоставимо со временем полувыведения препарата нативной БуХЭ плазмы крови человека. Таким образом впервые успешно применен метод химического полисиалирования для модификации сложного глобулярного фермента.

Способность рчБуХЭ и рчБуХЭ–САО27 эффективно связывать агент VR in vitro стала основанием для проведения эксперимента на животных. В результате испытания in vivo на беспородных мышах доказано, что препарат рекомбинантной БуХЭ плазмы крови человека, модифицированный полимерами N-ацетилнейраминой кислоты при внутривенном введении в дозировке 21 мг/кг живого веса, обеспечивает профилактическую защиту от действия 4,2 ЛД50 агента VR, не вызывая долгосрочных изменений в поведенческой активности и физической выносливости подопытных животных.

Настоящая работа описывает метод получения конъюгата рекомбинантной бутирилхолинэстеразы плазмы крови человека с гомополимерами N-ацетилнейраминовой кислоты, полностью удовлетворяющего современным требованиям к биологическому антидоту.

Публикация и апробация работы По теме диссертации опубликовано 2 статьи и подана заявка на патент. Результаты диссертации были представлены на 4 международных конференциях: XX зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии» (2008, Москва); Русско-французской конференции «Химия в молекулярной биологии» (2011, Москва); XXIV зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2012, Москва); Международной научной конференции «The 11th Meeting on Cholinesterases» (2012, Казань).

Структура и объем работы Диссертация состоит из Введения, трех глав – «Литературный обзор», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», Выводов, Списка литературы, включающего 129 работы, и Приложений. Работа изложена на 107 страницах, включая рисунок и 15 таблиц.

II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Создание экспрессионных конструкций БуХЭ Последовательность, содержащая кДНК БуХЭ человека, была любезно предоставлена Оксаной Локридж. Данная последовательность содержится в векторе pGS/CMV/ BChE, несущем ген БуХЭ человека под контролем CMV-промотора. В векторе pGS/ CMV/BChE также содержатся сайты полиаденилирования BGH polyA и ген глутаминсинтетазы в качестве селективного маркера. Данная конструкция ранее была использована для создания клона-продуцента БуХЭ человека, однако авторам не удалось достичь приемлемого уровня экспрессии.

Для выбора промотора, обеспечивающего наиболее эффективную продукцию БуХЭ в клетках линии CHO, были созданы две новые экспрессионные конструкции:

pcDNA/CMV/BCHE (рис. 1, А) и pBudCE/EF/BCHE (рис. 1, Б), несущие ген чБуХЭ под контролем CMV- и EF-промоторов соответственно. Корректность сборки конструкций подтверждена методом рестриктного анализа и секвенированием по Сэнгеру.

Рис. 1. Схема создания конструкций pcDNA/CMV/BCHE (А) и pBudCE/EF/BCHE (Б) Получение клона продуцента А Для выбора промотора, обеспечивающего наиболее эффективную продукцию рчБуХЭ, клетки линии CHO были трансфицированы методом липофекции кольцевой плазмидной ДНК конструкций pGS/CMV/BCHE, pcDNA/CMV/BCHE и pBudCE/EF/ BCHE. Через 48 и 72 ч после проведения липофекции образцы культуральной среды были отобраны для определения содержания активной формы рчБуХЭ методом Эллмана. В качестве контроля использовались кондиционные среды клеток линии CHO, выращенных в тех же условиях, что и трансфектомы. Как видно из результатов, представленных на рис. 2, для конструкций pGS/BCMV/CHE и pcDNA/CMV/BChE уровень экспрессии был сопоставим и составлял около 0,2 мкг/мл, тогда как для pBudCE/EF/ BChE он оказался почти на порядок выше (1,45 мкг/мл). Таким образом, конструкция pBudCE/EF/BChE, содержащая ген БуХЭ под контролем промотора EF-1, оказалась BCHE линеаризовали и проводили трансфекцию методом липофекции в клетки линии CHO для получения стабильно экспрессирующего клона. Селекцию проводили добавлением в ростовую 0, 600 мкг/мл. Продукцию активной 0, формы БуХЭ на всех этапах опреРис. 2. Анализ эффективности временной деляли по методу Эллмана. После сравнительного анализа уровней трансфекции клеток линии CHO экспрессионными конструкциями pBudCE/EF/BChE, pGS/CMV/ экспрессии в одинаковых условиях BChE и pcDNA/CMV/BChE для ряда отобранных наиболее перспективных моноклонов (рис.

продукции на протяжении 5 поколений пассажированием на 25 см флаконах, для дальнейшей работы Были протестированы среды Peprotech, (Peprotech, США), EXCell (Sigma, США) и ProCHO4 (Lonza, Швецария). Для подбора условий экспрессии клетки клона Рис. 3. Сравнительный анализ продукции БуХЭ A3 предварительно наращивали в отобранными моноклонами после стабильной среде DMEM, содержащей 2%-ную трансфекции клеток линии CHO линеаризованной конструкцией pBudCE/EF/BChE бычью фетальную сыворотку. По достижению клетками 70–90%-ной конфлюентности среду заменяли на одну из тестируемых безбелковых сред и инкубировали в ней клетки на протяжении нескольких суток. Инкубация клеток в средах Peprotech и EX-Cell приводила к их гибели на 1-2 сутки. Данные среды были признаны не подходящими для моноклона А3. При инкубации клеток в среде ProCHO4 наблюдался значительный прирост продукции рчБуХЭ клетками на 96 часу инкубации (рис. 4).

Олигомеризация рекомбиСодержание активной формы нантной БуХЭ состава продуцируемой клорБуХЭ, мг/л ном A3 рчБуХЭ по методу Карновского (рис. 5) показал, что в основном рчБуХЭ представлена в форме мономера, в то время как продукция тетраметра невелика. С фармакологической точки зрения тетрамер БуХЭ, поскольку Рис. 4.Анализ подбора условий экспрессии рекомвремя его полувыведения из бинантной БуХЭ человека клоном А3 в различных организма составляет 3-4 дня, а мономера – несколько часов.

Ранее было показано, что при добавлении к БуХЭ пептида продукта увеличивается.

В настоящей работе было Культуральная среда клона А3 (1); образец плазмы крови решено использовать коэк- человека (2); образец очищенной бутирилхолиэстеразы спрессию рчБуХЭ и пептида альбумина и БуХЭ, Д – димер, М – мономер PRAD.

Создание экспрессионных конструкций пептида PRAD Исходная экспрессионная конструкция pRC/RSV-rQ45 была любезно предоставлена Оксаной Локридж.

Для выбора промотора, обеспечивающего наиболее эффективную продукцию PRAD, были созданы две новые экспрессионные конструкции: pcDNA/CMV/BCHE (рис. 6, A) и pBudCE/EF/BCHE (рис. 6, Б), несущие ген пептида PRAD под контролем CMV и EF промоторов соответственно. Корректность сборки конструкций подтверждена методом рестриктного анализа и секвенированием по Сэнгеру.

Рис. 6. Cхема создания конструкций pcDNA/CMV/PRAD (А) и pcDNA/EF/PRAD (Б) Получение клона-продуцента А3H Экспрессионные конструкции pcDNA/CMV/PRAD и pcDNA/EF/PRAD, трансфицировали методом липофекции в клетки клона А3. Через 72 ч после проведения трансфекции количество тетрамерной формы рчБуХЭ в среде контролировали электрофоретически по методу Карновского. По результатам проведенного анализа (рис.

7) были выбраны клетки клона A3, трансфицированные плазмидой pcDNA/EF/PRAD.

Использование EF промотора в данном случае позволяет получать клетки, производящие большее количество тетрамерной формы БуХЭ в ростовую среду.

Для получения стабильного клона экспрессионную конструкцию pcDNA/EF/ PRAD линеаризовали и проводили трансфекцию методом липофекции в клетки клона А3. Селекцию проводили добавлением в ростовую среду 1,5 мг/мл гигромицина Б и 600 мкг/мл зеоцина. Продукцию изоформ БуХЭ моноклонами определяли по методу Карновского. По результатам тестирования был отобран клон A3H9 (рис. 8). После оптимизации условий экспрессии в ростовой среде ProCHO4 (Lonza) по ранее описанной схеме удалось получить стабильно продуцирующий клон А3Н9, характерной особенностью которого является продукция тетрамерной и димерной формы БуХЭ при полном отсутствии продукции мономера.

Разработка системы детекции и оценки продукции рекомбинантного белка В ходе работы оценку эффективности трансфекции и отбор клонов клеток линии CHO, продуцирующих рчБуХЭ, проводили по функциональной активности фермента временной трансфекции конструкцией pcDNA/EF/PRAD (3); образец плазмы крови человека (4); образец коммерчески доступной БуХЭ плазмы крови человека (Sigma, США) (5); образец очищенной БуХЭ плазмы крови человека (6); Т – тетрамер, А - димер альбумина и БуХЭ, Д – димер, М – мономер с применением методик Эллмана и Карновского. В основе этих гидролизовать бутирилтиохолин, что делает их неприменимыми в случаях, когда БуХЭ неактивна или ингибирована.

Известно, что высокий уровень экспрессии рекомбинантных продуктов в клетках эукариот иногда сопровождается снижением их удельной активности, т. е.

тивного белка. Часто это связано с тем, что собственная система емом продуцируемого белка, что приводит к появлению неактивных продуктов с некорректным фолдингом, неотщепленным пропептидом и другими дефектами.

В связи с этим представлялось интересным оценить удельную трансфицированными линеаризованными конактивность нашего фермента струкциями pBudCE/EF/BCHE и pcDNA/EF/PRAD:

при экспрессии. Таким образом, образец очищенной БуХЭ плазмы крови человека, встала дополнительная задача разработки системы прямой оценки содержания БуХЭ в образцах.

Для определения концентрации белка в образцах наиболее простым и информативным является метод ИФА в формате «сэндвич». Анализ коммерчески доступных антител к БуХЭ человека показал, что пары неконкурирующих моноклональных антител с возможностью применения в ИФА по типу «сэндвич» на сегодняшний день не существует.

Рис. 9. Схема создания конструкций pET28-N1, pET28-N2 и pET28-C Наработка полипептидных фрагментов чБуХЭ в прокариотической системе.

Нуклеотидные последовательности, кодирующие С-концевой фрагмент БуХЭ длиной 322 а.о., а также, два фрагмента N-концевого пептида БуХЭ, N1 и N2, длиной 133 и 119 а.о. соответственно, были получены методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы использовалась плазмида pGS/CMV/BCHE. ПЦР продукты С, N1 и N2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NheI и NotI и лигировали в аналогично рестрицированный и дефосфорилированный вектор pET28a, с получением экспрессионных конструкций pET28-C, pET28-N1 и pET28-N2 соответственно (рис. 9). Далее клетки E.coli штамма BL21(DE3) трансформировали методом электропорации конструкциями pET28-C, pET28-N1 или pET28-N2. Наличие шести остатков гистидина на С-конце экспрессируемых пептидов, позволило выделять их с помощью металло-хелатной хроматографии. Полученные в результате фракции анализировали методом белкового электрофореза в 15% ПААГ в восстанавливающих условиях. Полипептиды C и N1 обнаруживались во фракции, содержащей 2М мочевины, полипептид N2 – в нерастворимой фракции белков Получение и анализ мышиных моноклональных антител к полноразмерной БуХЭ плазмы крови человека Мышиные моноклональные антитела 3С6D8, 1A1F1, 1B4F4, 1B4D12, 1A1F7, 4C6D и 1A1D11 к полноразмерной БуХЭ человека были получены стандартным методом гидбридомной техногии.

При гибридизации по Вестерну полученных антител с С-, N1- и N2-полипептидами БуХЭ обнаружилось, что все семь антител взаимодействуют с С-концевым фрагментом рекомбинантного фермента (рис. 10). Анализ методом конкурентного ИФА подтвердил, что все антитела конкурируют друг с другом за связывание с С-концевым полипептидом (рис. 11), из чего следует, что иммунизация мышей полноразмерной БуХЭ плазмы крови человека стимулировало выработку антител к одну эпитопу. Таким образом, полученные моноклональные антитела не пригодны для анализа методом "сэндвич"–ИФА. Для преодоления возникшей проблемы были получены поликлональные сыворотки кроликов с использованием в качестве антигенов рекомбинантных фрагментов БуХЭ N1 и N2.

OП 450нм, OE Создание системы детекции БуХЭ на основе ИФА Очищенными препаратами N1- и N2-фрагментов БуХЭ иммунизировали кроликов. Анализ полученных сывороток методом ИФА показал одинаковый титр антител к обоим N-концевым фрагментам БуХЭ в сыворотках, однако с полноразмерной БуХЭ лучше связывались антитела к полипептиду N1. Несмотря на высокий уровень специфического взаимодействия антител с БуХЭ в непрямом ИФА, максимальный уровень сигнала в формате «сэндвич» ELISA не превышал 0.6 ОЕ. Было предположено, что частичная денатурация антигена увеличит доступность эпитопов и тем самым повысит чувствительность метода. Из опробованных методов денатурации БуХЭ (нагревание, добавление детергентов, щелочи) наиболее эффективной оказалась инкубация в течение 15 мин при 95 °С (рис. 12, А). По результатам анализов, из панели полученных моноклональных антител было выбрано антитело 4C6D8 проявившее максимальную чувствительность в комбинации с антителами к N1 полипептиду.

В итоге был разработан метод определения количественного содержания БуХЭ в образцах культуральной среды, очищенных препаратах, а также в плазме крови человека. Сравнение полученных величин концентрации БуХЭ в образцах с данными полученными по методике Эллмана показало, что более 95% рчБуХЭ, экспрессируемой клоном А3Н9 в ростовую среду, является активной (рис.12, Б).

OП 450нм, OE Рис. 12. Анализ различных способов денатурации антигена для определения концентрации бутирилхолинэстеразы методом «сэндвич» ELISA на примере моноклонального антитела 4C6D8 (А) и сравнительный анализ содержания бутирилхолинэстеразы в образцах из различных источников методами «сэндвич» ELISA и Эллмана (Б) Характеристики рекомбинантной БуХЭ Для изучения функциональной активности рБуХЭ была очищена из ростовой среды. Разработанный протокол очистки включал стадии ультрафильтрации, концентрирования, аффинной очистки и гель-фильтрации. На каждой стадии очистки отбирали образец для анализа на содержание активной формы БуХЭ методом Эллмана и количественной оценки белка методом ELISA. Данные анализа представлены в табл.

1. Конечный выход белка составил около 70% с чистотой 95% (по данным электрофоретической оценки). Определение кинетических параметров очищенного препарата Табл. 1. Таблица очистки рекомбинантной БуХЭ из ростовой среды Элюат cо стадии аффинной хроматографии Элюат с гельфитрации (21-я мин) Примечания: *по данным методики Эллман;

Табл. 2. Кинетические константы гидролиза бутирилтиохолин йодида рчБуХЭ в сравнении с БуХЭ плазмы крови человека * Duysen EG, Bartels CF, Lockridge O (2002) J Pharmacol Exp Ther 302:751–758.

рекомбинантной БуХЭ проводили в диапазоне концентраций субстрата 10 – 1000 мкМ при концентрации фермента 5 нМ. На основании этих данных были рассчитаны индивидуальные кинетические параметры реакции гидролиза. Сравнение кинетических констант рекомбинантной БуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что константы KM одинаковы в пределах ошибки расчетов, а константы k2 лишь незначительно различаются, что по-видимому связано с различными способами определения концентрации активных центров изучаемых ферментов (табл.2). Также известно, что для бутирилхолинэстеразы, полученной из плазмы крови человека, характерна активация субстратом в реакциях с соединениями холинового ряда. Аналогичный эффект наблюдается и для гидролиза бутирилхолин йодида рекомбинантной БуХЭ при концентрациях субстрата выше 500 мкМ. Это позволило рассчитать константы KSS и параметр b. Для рекомбинантной БуХЭ параметр b отличался от литературного значения в пределах ошибки. Таким образом, можно сделать вывод, что полученная рекомбинантная БуХЭ функционально активна, а организация активного центра фермента идентична с природной БуХЭ (табл. 2).

Для определения фармакокинетических характеристик рекомбинантной БуХЭ были проведены испытания на мышах. Самцам мышей BALB/c весом 25–30 г внутривенно вводили препарат рчБуХЭ в количестве 100 ед. акт. на животное быстрой инъекцией в хвостовую вену. После введения препарата 10 мкл крови отбирали из глазного синуса в разные временные промежутки в течение пяти дней для определения остаточной активности рчБуХЭ. По полученным данным была построена фармакокинетическая кривая, по которой, исходя из двух-камерной фармакокинетической модели, были рассчитаны среднее время удержания (MRT), время полураспределения (t1/2распр.) и полувыведения (t1/2вывед.) (табл. 3). Полученные in vivo данные находятся в строгом соответствии с данными литературного источника. Тем не менее, препарат рекомбинантной БуХЭ, экспрессированной клоном А3Н9, продемонстрировал на порядок более низкие параметры по сравнению с БуХЭ плазмы крови человека (табл. 3);

быстрое выведение препарата затрудняет его использование в качестве профилактического антидота против действия ФОТ.

Табл. 3. Сравнение полученных в работе фармакокинетических параметров рчБуХЭ с литературными данными Оптимизация фармакокинетических параметров рчБуХЭ химическим полисиалированием Исследования биологических антидотов на основе холинэстераз последние годы сосредоточены на получении рекомбинантных ферментов с улучшенными фармакодинамическими показателями. Пегилирование стало одним из наиболее популярных и хорошо изученных методов увеличения времени полувыведения из крови как рекомбинантной, так и нативной БуХЭ плазмы крови человека. Тем не менее, ряд исследователей отмечают, что пегилирование не влияет на иммуногенность рекомбинантного фермента; это приводит к падению фармакодинамических параметров при повторных введениях рекомбинантного фермента. В качестве альтернативы была предложена модификация полисиаловыми кислотами. В отличие полимеров этиленгликоля, гетеро- и гомополимеры N-ацетилнейраминовой кислоты являются биодеградируемыми молекулами, не накапливаются в организме и не являются токсичными. В организме человека не обнаружено специальных рецепторов распознающих полисиаловые кислоты. Модификация полисиаловыми кислотами позволит снизить риск возможных побочных действий рекомбинантного препарата БуХЭ, тем самым лучше вписываясь в концепцию биологического антидота.

Препаративное выделение рчБуХЭ из ростовой среды Для проведения химической модификации рчБуХЭ была очищена из ростовой среды. Разработанный протокол очистки был адаптирован для препаративных количеств белка и включал стадии ультрафильтрации, концентрирования, аффинной очистки и ионообменной хроматографии. В результате было наработано 35,8 мг рекомбинатного фермента. По данным электрофоретической оценки, конечный выход белка составил около 80% с чистотой 95% (рис. 13).

Так как С-концевой фрагмент чБуХЭ, отвечающий за тетрамеризацию фермента, наиболее уязвим для действия протеаз, деградация этого участка может привести к необратимому изменению олигомерного состава рчБуХЭ в сторону мономеров. Поэтому препарат рчБуХЭ проверялся на наличие протеолических повреждений в процессе очистки. Для этого образцы рчБуХЭ клона А3Н9 и чБуХЭ наносили на 8% ПААГ в присутствии и отсутствии восстановителя -меркаптэтанола. Отношение интенсивности полос массой ~160 кДа, соответствующих ковалентному димеру БуХЭ, свидетельствует об интактности С-концевого фрагмента БуХЭ в процессе очистки (рис. 14).

Оптимизация условий химического полисиалирокДа ческому полисиалированию. В работе использовали окисленные полисиаловые кислоты со средней молеС-концевого фрагмента рчБуХЭ кулярной массой 27кДа (САО27), произведенные на предприятии Lipoxen, Лондон, Англия. В основе этого процесса лежит реакция 7’-кетогруппы окисленных полимеров полисиаловой кислоты с N-концевой аминогруппой фермента и/или -аминогруппой остатка лизина; в результате этого взаимодействия образуются основания Шиффа, которые далее восстанавливаются NaBH3CN (рис. 15, А). Проведение химического полисиалирования в неоптимальных условиях может не только снизить выход реакции, но и существенно уменьшить удельную активность фермента.

Для определения оптимальных условий реакции последовательно варьировались основные параметры реакции: pH (6,0–8,0), молекулярное соотношение рчБуХЭ:САО (1:15–1:100), температура инкубации (4–37 °С) и концентрация восстановителя NaBH3CN (0–10 мг/мл). Как видно из результатов, представленных на рис. 15, Б-Е в результате проведенных экспериментов удалось определить условия реакции, при которых удалось добиться не менее 80%-ного выхода реакции при относительно невысокой (не более 10%) потере удельной активности фермента (рис. 15, Е).

Проведение препаративного химического сиалирования рчБуХЭ Препаративное полисиалирование проводили в оптимальных условиях: 0,1 М фосфатный буфер, pH=6,9, молярное соотношение рхБуХЭ:САО = 1:50, конечная концентрация восстановителя 3 мг/мл. Конъюгат рхБуХЭ-САО27 очищали с помощью аффинной хроматографии с использованием сорбента Procainamide-Sepharose 4FF (GE

OH OH OH NH NH NH

NH NH NH

HOOC HOOC HOOC

HO HO O HN

OH OH OH

OH OH OH

Рис. 15. Схема реакции химического полисиалирования рсБуХЭ (А) и поэтапный подбор оптимальных условий реакции химического полисиалирования. Остаточная активность и выход реакции изображены сетчатой и цветной плоскостями соответственно (Б-Е) Healthcare, США). В результате было получено 16 мг рчБуХЭ, модифицированной полисиаловыми кислотами, со средней молекулярной массой 27 кДа (рчБуХЭ–САО27).

Характеристики препарата рчБуХЭ–САО Полученный конъюгат рчБуХЭ–САО27 был подвергнут всестороннему анализу.

Данные электрофоретического анализа (рис. 16), свидетельствуют о изменении молекулярной массы комплекса минимум на 20 кДа. При электрофоретическом разделении продуктов реакции химического сиалирования рчБуХЭ на 10%-ном ПААГ наблюдалось появление диффузной полосы с молекулярной массой более 82 кДа (рис. 16, 2), что также свительствует о прохождении реакции.

Анализ препарата рчБуХЭ–САО27 по методике Карновского не обнаружил изменений олигомерного состава модифицированного рекомбинантного фермента (рис.

17). Анализ резорциноловым методом полученного рчБуХЭ–САО27 показал, что в результате химической модификации полученный конъюгат содержал в среднем 6 молекул полисиаловой кислоты на каждый мономер рекомбинантного фермента.

Эти данные подтверждаются результатами масс-спектрометрического исследования, которым удалось выявить шесть фрагментов БуХЭ, подвергнувшихся модификации: 45–51, 453–499, 454–476, 514–544, 545–568 и 550–576 (табл. 4). Сравнение кинетических констант гидролиза бутирилтиохолин иодида модифицированной и немодифицированной рчБуХЭ с данными опубликованными в литературе показало, что KM одинаковы в пределах ошибки расчетов и составляют 28±2 мкМ, 25±1 мкМ и 23±2 мкМ соответственно, а константы k2 (830±20 с-1, 830±10 с-1 и 665±30 с-1 соответственно) лишь незначительно различаются. Для конъюгата рчБуХЭ–САО27 также наблюдался эффект активации субстратом; параметр b отличался от литературного значения (2,5±0,1) в пределах ошибки и составил 2,2±0,2 (табл. 5). Для определения эффекта полисиалирования на фармакокинетические параметры рчБуХЭ–САО вновь были проведены испытания на животных. По полученным данным была построена фармакодинамическая кривая (рис. 18), по которой, исходя из двухкамерной фармакодинамической модели были рассчитаны среднее время удержания, время полураспределения и полувыведения (табл. 6).

Полученные данные свидетельствуют о том, что в результате химического полисиалирования время полувыведения рчБуХЭ–САО27 возросло в 5,5 раз по сравнению с немодифицированной рчБуХЭ и составило 1000±140 мин и 180±30 мин соответственно. Таким образом, – Химическое полисиалирование не влияет на олигомерный состав рчБуХЭ и не изменяет ее кинетические параметры;

– В результате химического полисиалирования время полувыведения рчБуХЭ– САО27 увеличилось в 5,5 раз по сравнению рчБуХЭ и стало сопоставимо с временем полувыведения БуХЭ плазмы крови человека.

Рис. 17. Сравнительный анализ олигомерного состава очищенной рчБуХЭ и конъюгата рчБуХЭ-САО27 методом Карновского Табл. 4. Выявленные с помощью масс-спектрометрического анализа пептиды с вероятной модификацией остатком N-ацетил нейраминовой кислоты (СА) в результате химического сиалирования

KPQSLTK

SWPVFKSTEQK

DNYTKAEEILSRSIVKRWANFAK

LRAQQCRFWTSFFPKVLEMTGNIDEAEWEWK

AGFHRWNNYMMDWKNQFNDYTSKK

WNNYMMDWKNQFNDYTSKKESCVGL

Ther 302:751–758.

Рис. 18. Фармакодинамические кривые выведения из крови препаратов рчБуХЭ и рчБуХЭ-САО Исследование защитной эффективности модифицированной рчБуХЭ Для определения защитной эффективности конъюгата рчБуХЭ–САО27 на первом этапе эксперимента были определены бимолекулярные константы ингибирования модифицированного и немодифицированного фермента агентом VR (рис. 19). Полученные данные (табл. 7) свидетельствуют о способности чБуХЭ и рчБуХЭ эффективно связывать агент VR, а также о том, что химическое полисиалирование не влияет на способность рчБуХЭ связывать данный ФОТ.

Способность рчБуХЭ эффективно связывать агент VR стало основанием для проведения эксперимента на животных. Мышам внутривенно вводили препараты рчБуХЭ–САО27 и чБуХЭ в количестве 21 мг/кг быстрой инъекцией в хвостовую вену;

через 30 мин после введения антидота внутримышечно вводили водный раствор агента VR в объеме 50–100 мкл инъекцией в большую ягодничную мышцу. Дозу агента VR варьировали от летальной (ЛД100) до нелетальной для точного определения ЛД50.

Животных наблюдали в течение пяти дней, падеж считали через 30 минут после введения агента VR.

Полученные данные были обработаны методом пробит-анализа по методике Девида Финни (David Finney). В результате удалось рассчитать величины защитных индексов для двух препаратов (табл. 8): для дозы 21 мг/кг рчБуХЭ-САО27 и чБуХЭ величина защитного индекса составила 4,2 и 4,7 соответственно.

Для контроля скрытых побочных эффектов препаратов рчБуХЭ-САО27 и чБуХЭ на протяжении всего эксперимента животные наблюдались в серии тестов «Открытое поле» и проходили испытание на физическую выносливость на тредбане. Результаты наблюдений представлены на рис. 20. Видно, что в течении первых трех часов после отравления агентом VR наблюдался значительный спад в активности испытуемых животных во всех группах, вероятно вследствие переживаемого стресса, однако спустя сутки все животные восстанавливали свои поведенческие показатели. Это позволяет сделать следующие выводы:

1. Внутривенное введение препаратов рекомбинантной и нативной БуХЭ плазмы крови человека не вызывает видимых отклонений в поведении испытуемых животных. Эти данные соответствуют литературным источникам.

2. Полное восстановление испытуемых животных через сутки после отравления агентом VR свидетельствует о том, что весь ФОТ был связан препаратами БуХЭ до того, как достиг своей биологической цели.

Таким образом было доказано, что препарат рекомбинантной БуХЭ плазмы крови человека, модифицированный полимерами N–ацетилнейраминой кислоты при внутривенном введении в дозировке 21 мг/кг живого веса обеспечивает профилактическую защиту от действия 4,2 ЛД50 агента VR, не вызывая побочных последствий.

Полученный конъюгат рчБуХЭ–САО27 полностью удовлетворяет основным требованиям к биологическому антидоту.

Табл. 8. Защитная эффективность рчБуХЭ-САО27 и чБуХЭ простив действия агента VR активность, % Вертикальная Исследовательская активность, % Животных наблюдали до начала эксперимента за сутки до введения препаратов белков (1), в момент введения (2) и после отравления агентом VR (3). Медианное значение контрольной группы во всех экспреиментах – 100% III. ВЫВОДЫ 1. Разработана эффективная система экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека в клетках линии CHO, позволяющая получать до 30 мг/л активного фермента в олигомерной форме.

2. Полученный рекомбинантный фермент обладает сравнимыми структурно–функциональными характеристиками с препаратом бутирилхолинэстеразы плазмы крови человека.

3. Впервые успешно осуществлено химическое полисиалирование гидролитического фермента. Подобраны условия реакции, позволяющие получать конъюгат рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека с полисиаловыми кислотами с 80%-ным выходом. Показано, что данная модификация не изменяет кинетические характеристики фермента, что свидетельствует об интактности его активного центра.

4. Применение химического полисиалирования существенно улучшило фармакокинетические параметры рекомбинантного фермента, увеличив время полувыведения модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека в 5,5 раз.

5. Полисиалированный препарат показал высокую эффективность в качестве профилактического биологического антидота. Защитный индекс по веществу VR составил 4,2 ЛД50, что сопоставимо с бутирилхолинэстеразой плазмы крови человека.

IV. СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Denis G. Ilyushin, Ivan V. Smirnov Alexey A. Belogurov Jr., Igor A. Dyachenko, Tatiana Iu. Zharmukhamedovad,Tatjana I. Novozhilova, Eugene A. Bychikhin, Marina V. Serebryakova, Oleg N. Kharybin, Arkadii N. Murashev, Konstantin A. Anikienko, Eugene N. Nikolaev, Natalia A. Ponomarenko, Dmitry D. Genkin, G. Michael Blackburn, Patrick Masson, Alexander G. Gabibov (2013) Chemical polysialylation of human recombinant butyrylcholinesterase delivers a long-acting bioscavenger for nerve agents in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 110(4): 1243-8.

2. Д. Г. Илюшин, О. М. Эртле, Т. В. Бобик, О. Г. Шамборант, Е. А. Сурина, В. Д.

Кнорре, P. Masson, И. В. Смирнов, А. Г. Габибов, Н. А. Пономаренко (2013). Рекомбинантная бутирилхолинэстераза человека как биологический антидот нового поколения: разработка эукариотической системы экспрессии // Acta Naturae, том 5, № 1(16), C. 76– 3. Ilyushin DG, Smirnov IV, Masson Patrick, Dyachenko IA, Novojilova TI, Bychihin EA, Anikienko KA, Myrashev AN, Ponomarenko NA, Gabibov AG. Sialylation as a novel approach of long-live recombinant human butyrylcholinesterase obtaining. // Материалы конференции Международная научная конференция «The 11th Meeting on Cholinesterases». Казань, 4–9 июля, 2012 г.

4. Д.Г.Илюшин, И.В.Смирнов, Masson Patrick, И.А.Дьяченко, Т.И.Новожилова, Е.А.Бычихин, К.А.Аникиенко, А.Н.Мурашев, Н.А.Пономаренко, А.Г.Габибов. Рекомбинантная бутирилхолинэстераза человека как биологический антидот нового поколения // Материалы конференции “XXIV зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»“, Москва, 7–9 февраля 5. Ilyushin DG, Smirnov IV, Masson Patrick, Dyachenko IA, Novojilova TI, Bychihin EA, Anikienko KA, Myrashev AN, Ponomarenko NA, Gabibov AG. The new approach in creating long-live recombinant human butyrylcholinesterase: sialilation // Материалы Русско-французкой конференци «Химия в молекулярной биологии», 16–19 декабря 2011 г.

6. Илюшин Д.Г., Дурова О.М., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г., Masson P.. Сравнительная характеристика систем экспрессии человеческой бутирилхолинэстеразы, основанных на культуре клеток животных // Материалы конференции “XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»”. Москва, 11-15 февраля 2008 г.

Заказ № Подписано в печать 26.03.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л.



Похожие работы:

«Писарев Денис Владленович РАСПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТЕЙ И ТУРБУЛЕНТНОСТЬ В РЕЧНЫХ ПОТОКАХ 05.23.16 – Гидравлика и инженерная гидрология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2012 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московский государственный строительный университет Научный руководитель – профессор, доктор технических наук Боровков Валерий...»

«Гапонова Надежда Ильинична Совершенствование системы оказания скорой медицинской помощи больным с гипертоническими кризами на догоспитальном этапе 14.01.05 – Кардиология (мед. наук и) 14.02.03 – Общественное здоровье и здравоохранение (мед. науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московский государственный...»

«Иванович Юлия Витальевна СВАРКА МАЛОГАБАРИТНЫХ КОРПУСОВ ИСТОЧНИКОВ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ Специальность 05.02.10 – Сварка, родственные процессы и технологии АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата технических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в ОАО Государственный научный центр научноисследовательский институт атомных реакторов (г. Димитровград) Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Казаков Юрий Васильевич, ФГБОУ ВПО...»

«Руфф Ольга Сергеевна РАЗВИТИЕ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ПОДДЕРЖКИ КРЕСТЬЯНСКИХ (ФЕРМЕРСКИХ) ХОЗЯЙСТВ (на материалах Новосибирской области) Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (экономика, организация и управление предприятиями, отраслями и комплексами. АПК и сельское хозяйство) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Новосибирск 2012 Диссертация выполнена на кафедре финансов в ФГБОУ ВПО Новосибирский...»

«Кохан Виктор Сергеевич Характеристика фенотипических особенностей нокаутных мышей с направленной инактивацией генов семейства синуклеинов 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук Черноголовка – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологически активных веществ Российской академии наук и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной...»

«Карапетян Сергей Вазгенович КЛИНИКО-БИОМЕХАНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ОРТЕЗИРОВАНИЯ ПРИ ОРТОПЕДИЧЕСКИХ ПОСЛЕДСТВИЯХ БЕРЕМЕННОСТИ 14.01.15 – травматология и ортопедия 14.01.01 – акушерство и гинекология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2013 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Санкт-Петербургский научно-практический центр медикосоциальной экспертизы, протезирования и...»

«ЗАЙЦЕВА Ольга Николаевна МНОГОПРОФИЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИОННО-КОМПЬЮТЕРНАЯ ПОДГОТОВКА БАКАЛАВРОВ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ НАПРАВЛЕНИЙ (НА ПРИМЕРЕ НАЦИОНАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО УНИВЕРСИТЕТА) 13.00.08 – теория и методика профессионального образования АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Йошкар-Ола – 2012 Работа выполнена на кафедре информатики и прикладной математики ФГБОУ ВПО Казанский национальный исследовательский технологический университет...»

«Ваганов Глеб Вячеславович ИССЛЕДОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ЭПОКСИДНЫХ ПОРОШКОВЫХ КОМПОЗИЦИЙ И ПОКРЫТИЙ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ СИЛИКАТНЫМИ НАНОЧАСТИЦАМИ РАЗЛИЧНОЙ МОРФОЛОГИИ 05.17.06. – Технология и переработка полимеров и композитов АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования СанктПетербургский государственный...»

«МАКСИМОВ Дмитрий Михайлович КЛИНИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕКОМЕНДАЦИЙ ПО ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ ОСТЕОАРТРОЗА КРУПНЫХ СУСТАВОВ В ОБЩЕЙ ВРАЧЕБНОЙ ПРАКТИКЕ специальность 14.01.04 – внутренние болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Екатеринбург – 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Уральская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения...»

«КОЛОДЯЖНАЯ Вероника Николаевна СЕМАНТИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАРЕЧИЙ НЕПОЛНОТЫ ДЕЙСТВИЯ ИЛИ ПРИЗНАКА В СОВРЕМЕННОМ АНГЛИЙСКОМ ЯЗЫКЕ Специальность 10.02.04 – германские языки АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата филологических наук Белгород – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования Белгородский государственный национальный исследовательский...»

«КОЛЬЦОВА Анна Михайловна ПОЛУЧЕНИЕ ПОСТОЯННЫХ ЛИНИЙ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И СРАВНЕНИЕ ИХ ХАРАКТЕРИСТИК ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В РАЗНЫХ СИСТЕМАХ 03.03.04.– Клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Научный руководитель : доктор биологических наук...»

«Иванов Семён Сергеевич ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА И УПРАВЛЕНИЕ РЕКРЕАЦИОННЫМИ ТЕРРИТОРИЯМИ ПОД ГОРОДСКИМИ ЛЕСАМИ (НА ПРИМЕРЕ ГОРОДА КРАСНОЯРСКА) 25.00.36 – Геоэкология (географические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Улан-Удэ – 2012 Работа выполнена в лаборатории таксации и лесопользования Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения Российской академии наук...»

«МИШУКОВ АНДРЕЙ АНДРЕЕВИЧ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ УПРАВЛЕНИЯ РЕЧЕВОЙ РАЗБОРЧИВОСТЬЮ В МНОГОКАНАЛЬНЫХ СИСТЕМАХ КОНФИДЕНЦИАЛЬНОЙ ГОЛОСОВОЙ СВЯЗИ Специальности: 05.13.18 Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ. 05.13.19 Методы и системы защиты информации, информационная безопасность АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Воронеж 2 Работа выполнена в Воронежском институте МВД России Научный руководитель : доктор...»

«ТРУБЕЦКОВА Марина Дмитриевна ЗОНАЛЬНЫЙ СТОК РЕК ЦЕНТРАЛЬНОЙ АЗИИ В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЯЮЩЕГОСЯ КЛИМАТА 25.00.27 – гидрология суши, водные ресурсы, гидрохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте водных проблем Российской академии наук Научный руководитель : БОЛГОВ Михаил Васильевич, доктор технических наук Официальные оппоненты : КОРОНКЕВИЧ...»

«Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Кубанский государственный технологический университет Научный консультант: доктор технических наук, профессор Симанков Владимир Сергеевич Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Атрощенко Валерий Александрович заведующий кафедрой информатики ФГБОУ ВПО Кубанский технологический университет доктор физико-математических наук, профессор Веремей Евгений Игоревич...»

«ШАНИНА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА ИНТЕРПРЕТАЦИЯ АНГЛИЙСКОЙ И СОВЕТСКОЙ ПРЕССОЙ ВАЖНЕЙШИХ СОБЫТИЙ МЕЖДУНАРОДНОЙ ЖИЗНИ СЕРЕДИНЫ 1950-Х ГГ. В КОНТЕКСТЕ ХОЛОДНОЙ ВОЙНЫ Специальность 07.00.03 – Всеобщая история (новая и новейшая история) АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ИСТОРИЧЕСКИХ НАУК Ярославль – 2012 2 Работа выполнена на кафедре всеобщей истории федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования...»

«Левицкая Наталья Николаевна Критерии и индикаторы для оценки состояния лесов Московской области Специальность 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центр по проблемам экологии и продуктивности лесов РАН Научный руководитель : Черненькова Татьяна Владимировна доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник...»

«АБДРАХМАНОВ РОБЕРТ НАЗЫМОВИЧ ИССЛЕДОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУКОПЧЕНЫХ КОЛБАС ИЗ МЯСА ПТИЦЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОЛЛАГЕНОВОГО ГЕЛЯ Специальность: 05.18.04. – технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Кемерово – 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Кемеровский...»

«Щетинин Игорь Викторович Формирование структуры и свойств высоколегированной стали, полученной с использованием фуллеренов и углеродных нанотрубок методом порошковой металлургии Специальность 05.16.09 – материаловедение (металлургия) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования Национальный исследовательский...»

«Лукин Алексей Анатольевич ОБОСНОВАНИЕ ГРАНИЦ ВЛИЯНИЯ РЕЖИМА РАБОТЫ ГОРНОТЕХНИЧЕСКИХ СИСТЕМ НА НАПОРНОЕ ГИДРОГЕОДИНАМИЧЕСКОЕ ПОЛЕ 25.00.16 – горнопромышленная и нефтегазопромысловая геология, геофизика, маркшейдерское дело и геометрия недр Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук Томск – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Национальный...»






 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.