На правах рукописи

ЕЛАТКИН Николай Павлович

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСОВ ОСПЫ ПТИЦ

03.02.02 «Вирусология»

Aвтореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владимир – 2013 2

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г.Владимир.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Дрыгин Владимир Викторович

Официальные оппоненты:

Рыбаков Сергей Сергеевич - доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г.Владимир, начальник научно-образовательного отдела;

Балышева Вера Ивановна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г.Покров, ведущий научный сотрудник.

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»), г.Москва.

Защита диссертации состоится 23 апреля 2013 г. в 12 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г.Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте www.arriah.ru

Автореферат разослан 22 марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Жбанова Татьяна Валентиновна

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Оспа птиц (ОП) – вирусное заболевание домашних и многих видов диких птиц, распространенное во многих странах мира с развитым птицеводством. Возбудителем оспы птиц является ДНКсодержащий эпителиотропный вирус рода подсемейства Avipoxvirus, Chordopoxvirinae, семейства Poxviridae, в котором насчитывается 10 видов (ICTV, 2012). Наибольший экономический ущерб птицеводству причиняет вирус оспы кур (ВОК, fowlpox), который определен как типичный вид данного рода (Tripathy D.N., 2003).

Оспа кур наносит птицеводческим хозяйствам экономический ущерб, вызывая смертность до 50%, снижение яйценоскости и приводя к вынужденному убою больных и переболевших птиц (S.I. Jarvi, 2008).

Специфическая вакцинопрофилактика оспы птиц применяется не во всех хозяйствах, что сохраняет возможность для распространения заболевания.

Эффективность мероприятий по борьбе с оспой птиц во многом зависит от своевременного выявления возбудителя. Диагноз основывается на данных клинических и патологоанатомических наблюдений, оценки эпизоотической ситуации и результатах комплекса лабораторных исследований с выделением вируса.

Лабораторная диагностика оспы птиц включает выделение вируса на хорионаллантоисной оболочке (ХАО) SPF-эмбрионов кур, гистологических исследованиях и электронной микроскопии (Tripathy D.N., 2003). Данные методы хотя и достаточно надежны, но весьма трудоемки и требуют значительного времени.

Лабораторные методы, основанные на выявлении генетического материала вируса оспы птиц обладают более высокой (ВОП), чувствительностью и специфичностью по сравнению с другими методами и сокращают время постановки диагноза до 4-5 часов с момента отбора проб. В последнее время появились методы ПЦР для выявления ВОП (Huw Lee & Hwa Lee, 1997; Jarmin S., 2006, Amano et al., 1999; Boulanger et al., 2002;

Батченко, 2006). Сравнительно недавно для выявления ВОП разработан такой метод, как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) (Hauck, 2009).

Метод ПЦР-РВ более чувствителен по сравнению с обычной ПЦР и позволяет проводить количественный анализ исследуемого гена. Одним из недостатков метода ПЦР является возможность ингибирования реакции при исследовании проб патологического материала. Для контроля процесса выделения ДНК и наличия ингибиторов реакции в исследуемой пробе используется внутренний контрольный образец (ВКО), т.е. гетерологичная положительный контрольный образец (ПКО).

Известные виды и штаммы ВОП могут значительно отличаться по необходимо не только выделять изоляты, но также проводить их изучение.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов даёт возможность устанавливать филогенетические связи ВОП. Чаще всего для этого анализируют участок гена Р4b (fpv167) и H3L (fpv 140) (Huw Lee L, 2000, Jarmin S, 2006), кодирующие структурные иммунодоминантные белки ВОП. Необходимо отметить, что генетическое разнообразие изолятов ВОП, малоизученным.

Поскольку используются живые вакцины против оспы кур, необходимо дифференцировать полевые изоляты вируса от вакцинных штаммов. Работа, проведенная Susan A. Jarmin с коллегами (Jarmin S, 2006), позволила выявить генный локус Н9, который может быть использован для различия полевых изолятов оспы кур от вакцинных штаммов.

Имеются свидетельства того, что вирус ретикулоэндотелиоза птиц (РЭВ) участвует в патогенезе вируса оспы кур (ВОК), увеличивая его вирулентность за счет подавления иммунного ответа (Singh P, 2005). РЭВ – иммуносупрессивный ретровирус. Как правило, вирулентные штамма ВОК имеют полногеномную последовательность РЭВ в своём геноме, в то время как вакцинные штаммы несут только длинные концевые повторы (LTR) (Hauck R., 2009).

Исходя из вышеизложенного, разработка и усовершенствование методов выявления ВОП в пробах патологического материала, дифференциация вакцинных штаммов от полевых изолятов, а также изучение молекулярно-генетических свойств выделенных изолятов ВОП является актуальной задачей.

исследователями опубликован ряд рекомендаций по борьбе с оспой птиц (Новочеркасск, 1984; Кишинёв, 1989), разработаны вакцины против оспы птиц и изучены их свойства (Черкезова Т.В., 1989; Бочарников А.В., 2003;

Николаева И.П., 2003; Смирнов В.Н., 2003; Черкезова Т.В., 2003; Бочарников А.В., 2004; Похвальный С.А., 2011). Предложены системы ПЦР и ПЦР в режиме реального времени для выявления ВОП (Huw Lee & Hwa Lee, 1997;

Hauck, 2009; Jarmin S., 2006). Отечественными исследователями разработан метод гнездовой ПЦР на ген тимидинкиназы для выявления ВОП (Батченко Г.В., 2006).

Цель и задачи исследования. Основной целью данных исследований являлась разработка и усовершенствование методов выявления и дифференциации ВОП, а также изучение молекулярно-генетических свойств выделенных изолятов.

Для достижения поставленных целей было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать метод выявления ВОП на основе полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с рекомбинантными положительным и внутренним контрольными образцами.

2. Определить первичную нуклеотидную последовательность и провести филогенетический анализ фрагментов генов P4b, Fpv140 и генного локуса Н9 полевых изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также вакцинных и одного полевого штамма ВОК.

3. Разработать метод выявления генома вируса ретикулоэндотелиоза (РЭВ) в геноме ВОП с использованием ПЦР и провести анализ изолятов и штаммов ВОП на наличие встроенной последовательности РЭВ.

4. Изучить молекулярно-генетические свойства изолятов и штаммов ВОП.

Научная новизна результатов исследования.

1. Разработаны методы выявления ВОП с помощью ПЦР и ПЦР-РВ с рекомбинантными ПКО и ВКО.

2. Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов P4b, Fpv140 и генного локуса Н9 изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также пяти вакцинных штаммов и штамма ВОК для контрольного заражения. Проведен филогенетический анализ изолятов и штаммов ВОП с использованием полученных последовательностей.

3. Разработан метод выявления встройки генома РЭВ в ВОП с использованием ПЦР и проведен анализ изолятов и штаммов ВОП на наличие встроенной последовательности РЭВ.

Практическая значимость работы. С помощью разработанных методов выявления генома ВОП на основе ПЦР исследовано 65 проб патологического материала от кур, голубей и диких птиц, поступивших в 2008-2012 гг. из России, Украины и Казахстана. В 16 пробах от кур и пробах от голубей был выявлен ВОП. Установлено, что из 18 выявленных изолятов 16 являются вирусами оспы кур и 2 – вирусами оспы голубей.

Разработаны методы, позволяющие дифференцировать полевые изоляты ВОК, выделенные в России, от вакцинных штаммов. 18 изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., пять вакцинных и один штамм ВОК для контрольного заражения были исследованы на наличие генома вируса ретикулоэндотелиоза птиц. Изучены молекулярно-генетические свойства изолятов и штаммов ВОП.

Научные результаты, выносимые на защиту:

Методы выявления ВОП на основе ПЦР и ПЦР-РВ с рекомбинантным положительным и внутренним контролем.

последовательностей фрагментов генов P4b, изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также 5 вакцинных и одного штамма ВОК для контрольного заражения.

Способ дифференциации полевых изолятов ВОК от вакцинных штаммов на основе анализа генного локуса Н9.

Результаты анализа изолятов и штаммов ВОП с помощью ПЦР и ПЦРРВ на наличие встроенной последовательности РЭВ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы инфекционности вирусов, разработки мер и средств диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследования – генной инженерии, изучение генетических и негенетических взаимодействий между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку мер диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по разработке методов ПЦР для выявления ВОП, а так же исследования молекулярно-биологических и филогенетических свойств изолятов ВОП.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности – 4, 6, 8, 10.

Апробация результатов исследования. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2010-2012 гг., доложены и опубликованы на Международных научно-практических конференциях молодых ученых (Россия, 2010г.; Россия, 2012г.) и Международной научно-практической конференции «Трансмиссивные болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (Крым, Украина, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 работы опубликованы в изданиях, включенных в перечень высшей аттестационной комиссии (ВАК) РФ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения. Список иллюстрирована 25 рисунками и 7 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

Личный вклад автора в выполнении работы. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.б.н. Колосову С.Н., вед.

биологу Ушаковой А.Н., к.б.н. Зинякову Н.Г., д.б.н. Мудрак Н.С., вед. вет.

врачу Похвальному С.А., к.б.н. Андрейчуку Д.Б., к.в.н. Чвале И.А. за помощь в проведении отдельных этапов работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирусы. В работе использовали изоляты ВОП, выделенные из полевых образцов, отобранных от кур, голубей и диких птиц на территории Российской Федерации в 2008-2012 гг., изоляты ВОП, полученные из ННЦ «ИЭКВМ» (г. Харьков, Украина), штамм для контрольного заражения Кучинский (ФГБУ «ВГНКИ», Москва), вакцинные штаммы ВОП: КЭМ- (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), НР-В (AVINOVA), «К» (Авивак), ВГНКИ 3/7 («ПЗБ», Покров), Gibbs (Авивак). Также, в работе использовали штаммы вируса аденовируса, вируса инфекционного ларинготрахеита.

Праймеры. Праймеры, использованные в работе, были синтезированы НПО «Синтол» (г. Москва) и ООО «Бигль» (г. Санкт-Петербург).

Реактивы. В работе были использованы реактивы фирм «Promega», (США), «Fermentas» (Литва), «Invitrogen» (США), «Вектор» (Россия), «Applied Biosystems» (США), «Sigma» (Германия), «BioOptica» (Италия), «Panreac» (Испания), «Stratagene» (США), ООО «Биоком» (Россия), ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Россия).

Выделение ДНК. Для выделения ДНК использовали препараты вируссодержащих суспензий ХАО, 5% суспензию тканей исследуемых органов. ДНК выделяли с помощью набора БиоКом (Москва, Россия).

Полимеразная цепная реакция. Реакционную смесь предварительно прогревали при 95С в течение 5 мин. Сорок циклов ПЦР проводили при следующем температурном режиме: денатурация при 95С в течение 30 с, отжиг праймеров при 57С в течение 30 с, элонгация при 72С в течение мин. на элонгацию 1000 нуклеотидов. Реакции проводили в амплификаторе DNA Engine Dyad Cycler («BioRad», США).

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Реакцию проводили в амплификаторе Rotor-Gene 6000 («Corbett Life Science», Австралия). Реакционную смесь предварительно прогревали при 95С в течение 5 мин. Сорок циклов ПЦР проводили при следующем температурном режиме: денатурация при 95С в течение 15 с, отжиг праймеров при 55С в течение 30 с, элонгация при 72С в течение 30 с.

Получение плазмид, несущих последовательности генов P4b и М1.

Для клонирования гена P4b использовали плазмидный вектор pGEM-TEasy («Promega», США). Для наработки кДНК гена P4b использовали штамм вируса оспы кур «КЭМ-7». Для клонирования гена М1 использовали плазмидный вектор pTKP7,5 («Вектор», Новосибирск). Для наработки кДНК гена М1 использовали штамм вируса гриппа птиц A/duck/Novosibirsk/02/ H5N1.

Определение первичной нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов кДНК ВОП осуществляли с помощью набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Applied Biosystems», США) на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 («Applied Biosystems», США), согласно инструкции производителя.

Нуклеотидный анализ последовательностей ПЦР-ампликонов.

Сравнение последовательностей, полученных из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), и полученных в исследовании, проводили с использованием программы «Clustal W» пакета программ BioEdit 7.0.5.3. Для филогенетического анализа использовали пакет программ MEGA 3.1.

Гистологические исследования тканей. Фиксированные гистологические препараты тканей готовили согласно стандартной методике.

Кусочки органов фиксировали в формалине, с последующей заливкой в парафин. Срезы изготавливали по общепринятым методикам, затем окрашивали гематоксилином и эозином (Avian Histopathology, 2008).

Статистическая обработка результатов. Данные обрабатывались с использованием пакета прикладным программ StatSoft, версия 6.0.

2.3.1. Выбор праймеров для ПЦР и ПЦР-РВ. В результате сравнительного анализа опубликованных систем праймеров и их тестирования для проведения ПЦР были выбраны праймеры на участок гена корового белка Р4b, предложенные Huw Lee и Hwa Lee (Huw Lee, Hwa Lee, 1997) (Рис.1). Также была разработана система праймеров для проведения ПЦР в режиме реального времени (Рис.1) на последовательность участка данного гена. Помимо этого, для создания тест-системы на основе ПЦР-РВ были выбраны праймеры, предложенные Hauck (Hauck, 2009).

2.3.2 Оптимизация параметров ПЦР и ПЦР-РВ. С использованием различных изолятов и штаммов ВОП методы ПЦР и ПЦР-РВ были реакционной смеси.

фрагмента гена P4b в ПЦР (А) и ПЦР-РВ (Б) Примечание: Нумерация показана по последовательности гена P4b штамма Fowlpox challenge virus FPV USDA (номер последовательности в GenBank: AF198100).

Для продукта амплификации указана длина. Буквами F и R обозначены прямой и обратный праймер, соответственно.

Аналитическую чувствительность определяли путем постановки реакции с ДНК, выделенной из десятикратных разведений препарата вакцинного штамма вируса оспы кур “КЭМ-7” с известным инфекционным титром, а также при использовании в качестве матрицы рекомбинантной плазмиды pGEMT4BI1, содержащей фрагмент гена P4b известной концентрации.

Чувствительность метода ПЦР, определенная с разведениями препарата вакцинного штамма “КЭМ-7” вируса оспы кур, составила 101,4 ЭИД50/мл или 0, рекомбинантной плазмиды – 1620 копии/мл или 8,1 копии/реакцию.

Чувствительность метода ПЦР-РВ, определенная с разведениями препарата вакцинного штамма “КЭМ-7”, вируса оспы кур составила 1,19 ЭИД50/мл или 0, рекомбинантной плазмиды – 400 копии/мл или 2,0 копии/реакцию.

2.3.4. Разработка положительного контроля для ПЦР и ПЦР-РВ. В качестве положительного контроля была получена рекомбинантная плазмида pGEMT4BI1 со встройкой участка гена P4b вируса оспы птиц размером Chicken/Rus_Rjazan/ FPV/1641/09.

2.3.5. Разработка внутреннего контрольного образца для ПЦР-РВ.

При разработке ПЦР-РВ в качестве ВКО использовали рекомбинантный плазмидный вектор pTKP 7.5/M, содержащий ген М1 вируса гриппа птиц (Рис.2). К преимуществам разработанного ВКО на основе плазмиды следует замораживания-оттаивания, а также возможность точной количественной оценки вносимой в реакцию кДНК. Было показано, что внесение ВКО в реакционную смесь практически не снижало эффективность выявления гена Р4b ВОП.

Рис. 2. Схема плазмидных векторов pGEMT4BI1 (А) и pTKP 7.5/М (Б) 2.3.6. Оценка эффективности амплификации фрагмента гена P4b в ПЦР-РВ. Для оценки эффективности амплификации были протестированы десятикратные разведения препарата плазмиды pGEMT4BI1 с известной концентрацией. Для выявления взаимного ингибирования систем праймеров протестированы разведения смеси плазмиды pGEMT4BI1 с плазмидой pTKP7.5/M и разведения плазмиды pGEMT4BI1 в отдельности.

При одновременной амплификации двух матриц, по сравнению с эффективности реакции с 86,5% до 81,2% (Рис.3), которое не оказывало существенного влияния на чувствительность реакции.

Эффективность амплификации Е = 0, Рис.10. График определения эффективности амплификации 10-кратных разведений плазмиды pGEMT4BI1 при отсутствии (1) и при наличии (2) Примечание: На графике 1 показаны результаты полученные при амплификации только участка вставки гена 4b, на графике 2 - результаты полученные при одновременной амплификации участков вставок генов 4b и М.

2.3.7. Специфичность ПЦР и ПЦР-РВ. Для оценки специфичности ПЦР и ПЦР-РВ тестировали 19 различных штаммов и изолятов вируса оспы птиц, вирус осповакцины штамма ЛИВП, а также другие ДНК-содержащие Положительный результат был выявлен только в реакции со штаммами и изолятами вируса оспы птиц.

2.3.8. Выявление вирусов оспы птиц в пробах биоматериала. С патологического материала от кур, голубей и диких птиц, поступившие в период с 2008 по 2012 гг. В результате проведенных исследований методом ПЦР и ПЦР-РВ вирус оспы птиц был выявлен в 16 пробах из 10 регионов России, а также 2 пробах с Украины. Из 18 положительных проб, 15 проб были получены от кур и 3 пробы от голубей. Большинство положительных проб были получены в весенний и осенний период (Рис.4), что может быть следствием сезонности распространения заболевания.

Рис. 4. График зависимости числа случаев выявления ВОП от месяца экспериментально заражённых птиц. Для проведения гистологических исследований отбирали участок кожных тканей перепонки крыла с характерными поражениями через две недели после внутрикожного заражения вирусом оспы кур изолята Chicken/Rus_Ivanovo/ FPV/1857/10.

В результате микроскопических исследований окрашенных гематоксилин - эозином препаратов были получены фотографии участков перьевых фолликулов с характерными эозинофильными серповидными тельцами включений. Наблюдали увеличение в размере поражённых клеток в два-три раза по сравнению с отрицательным контролем, и отмечали паутиновидные цитоплазматические структуры.

2.3.10. Анализ вариабельности последовательности гена Р4b (fpv167) вируса оспы птиц. На основании выравнивания 107 нуклеотидных генетическое родство изолятов и штаммов вирусов оспы птиц по участку гена Р4b (Рис. 5) размером 479 п.н.

Chicken/Rus_Belgorod/ FPV/1260/ Chicken/Rus_Lipetsk/ FPV/1580/ Chicken/Rus_Primorskiy/FPV/1648/ Chicken/Rus_Rjazan/ FPV/1641/ Chicken/Rus_Ivanovo/ FPV/1857/ Chicken/Rus_Kaluga/ FPV/1871/ Chicken/Rus_Belgorod/ FPV/1982/ Chicken/Rus_Vladimir/ FPV/2017/ Chicken/Rus_Vladimir/ FPV/2158/ Pigeon/Rus_Vladimir/ FPV/2169/ Chicken/Rus_Amurskaja/FPV/2318/ Chicken/Ukraine/ FPV/ КЭМ-7, НР-В, «К», ВГНКИ 3/7, Рис.5. Дендрограмма, отражающая филогенетическое родство вирусов Анализ филогенетической дендрограммы, построенной на основе нуклеотидных последовательностей гена Р4b, позволяет выявить наличие трёх генетических групп среди вирусов оспы птиц: вирусов оспы кур и схожих с ними вирусов, вирусов оспы канареек (ВОКР) и схожих с ними вирусов и вирусов оспы попугаев. Все выделенные в ходе работы изоляты из России и Украины относились к группе вирусов оспы кур и схожих с ними вирусов. Все изоляты от кур и один изолят от голубя относятся к подгруппе 1, в которой находится все опубликованные последовательности изолятов от кур. Два изолята от голубей, исследованные в ходе работы, из России и Украины объединены в подгруппе 4 вместе с тремя изолятами от голубей из Германии, Индии и Англии.

Чтобы увеличить участок анализируемой последовательности гена Р4b были подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать участок гена последовательностей расширенного участка гена P4b изолятов ВОП, была исключением изолята, выделенного от голубя (приблизительно 96%) (Рис.6).

Рис. 6. Дендрограмма, отражающая генетическое родство вирусов оспы Примечание: Изоляты и штаммы, секвенированные в ходе исследования, обозначены жирным шрифтом и курсивом. Дендрограмма построена с использованием метода присоединения соседей.

2.3.11. Анализ вариабельности последовательности гена H3L (fpv140) вируса оспы птиц. Был проведен анализ последовательностей гена fpv140 изолятов ВОП. При этом наблюдается полиморфизм длины этого гена. Между исследованными изолятами и штаммами вирусов кур и голубей, различие составляет 14 п.н. (Рис.7).

Рис. 7. Выравнивание участка нуклеотидных последовательностей ВОП, показывающее различия в длине нуклеотидной последовательности гена fpv140 у изолятов ВОК и ВОГ, обнаруженные в ходе работы Примечание: последовательности изолятов вируса оспы голубей отмечены стрелками На основании выравнивания 43 последовательностей была построена дендрограмма, отражающая генетическое родство изолятов и штаммов вирусов оспы птиц по участку гена fpv140 (Рис.8). Анализ нуклеотидных генетических групп: вирусов оспы кур и схожих с ними вирусов; вирусов оспы голубей, индеек и схожих с ними вирусов, а также вирусов оспы канареек и схожих с ними вирусов.

последовательности изолятов, выделенных от кур, в том числе полученные в ходе работы. Два изолята от голубей из России и Украины относятся к группе вирусов оспы голубей, индеек и схожих с ними вирусов. Анализ данного гена в отличие от гена P4b позволяет дифференцировать вирусы индеек от вирусов голубей (ВОГ).

Рис. 8. Дендрограмма, отражающая генетическое родство вирусов оспы Примечание: Последовательности, полученные в ходе работы отмечены синим цветом.

Группы вирусов оспы кур, голубей и индеек, канареек обозначены соответственно зелёным, синим и красным цветом. Дендрограмма построена с использованием метода присоединения соседей.

2.3.12. Анализ последовательности генного локуса Н9 вируса оспы кур. Был проведен анализ нуклеотидных последовательностей генного локуса Н9 (Рис. 9). ПЦР-продукты были получены для всех изолятов и штаммов вируса оспы кур. Размер ПЦР-фрагмента составил приблизительно 2200 п.н. за исключением вакцинного штамма «ВГНКИ3/7», с которым нарабатывается два ПЦР-фрагмента размером 2200 и 1000 п.н., что может быть следствием гетерогенности данного штамма. Анализ показал, что последовательность в 1000 п.н. штамма «ВГНКИ 3/7» идентична с вакцинными штаммами Chick‘N’Pox и FPV M и штаммом FPV USDA.

Дополнительная последовательность в 1207 п.н., обнаруженная во всех изолятах и штаммах, за исключением штаммов «Кучинский» и «ВГНКИ 3/7», сходна с последовательностями двух европейских полевых (HP1 и FPV 174) и трех вакцинных штаммов: Nobilis Variole W (Nobilis), Diftosec CT (Diftosec), Poxine.

Рис. 9. Схема расположения праймеров для амплификации и секвенирования, ОРС, положения основных замен и вариантов Примечание: Буквами F и R обозначены прямой и обратный праймеры, соответственно. Горизонтальными стрелками обозначены ОРС, жирными вертикальными стрелками показано положение основных замен.

Анализ нуклеотидных последовательностей генного локуса Н9, полученных в ходе работы и имеющихся в базе данных GenBank позволяет разделить изоляты и штаммы на четыре группы (табл. 1) по отличиям в нуклеотидных последовательностях.

Группировка изолятов и штаммов ВОП по основным Название изолята/штамма AM396439/Commercial vaccine FPV M (Websters) Chicken/Rus_Lipetsk/FPV/1580/ Chicken/Rus_Kaluga/FPV/1871/ Chicken/Rus_Rjazan/FPV/1641/ Chicken/Rus_Belgorod/FPV/1260/ AM396438/Commercial vaccine Diftosec (Merial) AM396440/HP1-200/Germany Chicken/Ukr/ FPV/ Примечание: + - генетический маркер присутствует у данного изолята/штамма, – отсутствует. Полевые изоляты выделены жирным шрифтом К первой группе относятся три штамма: вакцинный штамм FPV M (Websters), патогенный штамм для контрольного заражения FPV USDA и отечественный вакцинный штамм «ВГНКИ 3/7». Во всех этих штаммах не обнаружено дополнительной последовательности 1,2 т.п.н. Ко второй группе относятся все российские полевые изоляты, выявленные в ходе работы. У них отсутствует замена нуклеинового основания аденин (А) на цитозин (С), но есть делеция 4 нуклеотидов СТАТ. Можно предположить, что изоляты, циркулирующие в настоящее время на территории России, генетически родственны. К третьей группе относятся два вакцинных штамма: Diftosec (Merial), Duphar Poxine, и два полевых изолята из Германии и Англии:

AM396440/HP1-200/Germany и AM396436/FPV174/04/United Kingdom. У них отсутствует замена основания А на С и нет делеции нуклеотидов СТАТ. К четвёртой группе относятся два зарубежных вакцинных штамма: HP-B («Avinova»), Gibbs («Intervet»), два отечественных вакцинных штамма: «К»

(«Авивак») и «КЭМ-7» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), а также изолят, выделенный от курицы из птицефабрики Украины. У них есть замена основания А на С и нет делеции нуклеотидов СТАТ.

дифференциацию полевых изолятов, выявляемых на территории России, от вакцинных штаммов.

ретикулоэндотелиоза птиц (РЭВ) в геноме ВОП. Был проведен анализ изолятов и штаммов ВОП методом ПЦР с праймерами, рассчитанными на все гены РЭВ и на область встройки ДНК РЭВ в геном ВОП в гене Fpv202, а также методом ПЦР-РВ на ген gag РЭВ (Рис. 10).

Рис. 10. Схема структуры встроенного в ВОП генома РЭВ и расположения праймеров для амплификации генов РЭВ Примечание: Буквами F и R обозначены прямой и обратный праймеры, соответственно.

Праймеры для ПЦР-РВ отмечены синим цветом В ходе проведённого анализа изолятов и штаммов было установлено, что все полевые изоляты ВОК имеют встройку полного генома РЭВ, в то время как во всех вакцинных штаммах ВОК есть только длинные концевые повторы РЭВ. Геном РЭВ не был обнаружен в обоих изолятах вируса оспы голубей.

последовательности полного генома РЭВ в полевых изолятах ВОК совпадают с анализом генного локуса Н9. Таким образом, проведение молекулярно-генетического анализа данных сайтов генома ВОК позволяет дифференцировать выявляемые полевые изоляты оспы кур от вакцинных штаммов.

1. Разработаны методы полимеразной цепной (ПЦР) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с рекомбинантными положительным и внутренним контрольными образцами для выявления ВОП, аналитическая чувствительность которых составила 101,4 ЭИД50/мл (8, соответственно. С помощью разработанных методов геном ВОП выявили в 18 пробах.

эпителиальных тканей кожи кур, зараженных вирусом оспы кур изолята Chicken/Rus_Ivanovo/FPV/1857/10, эозинофильные тельца включений.

3. Определена первичная нуклеотидная последовательность фрагмента гена P4b размером 578 п.н. и гена Fpv140 размером 1983 п.н. 18 изолятов ВОП, 5 вакцинных и штамма ВОК «Кучинский». В результате проведённого филогенетического анализа установлено, что 22 изолятов и штаммов ВОП относятся к вирусам оспы кур, в то время как 2 изолята относятся к вирусам оспы голубей.

4. Разработан метод для амплификации участка гена P4b 1281 п.н. на основе ПЦР. По результатам филогенетического анализа изолятов и штаммов ВОП было показано высокое внутривидовое сходство вирусов по этому участку гена.

5. Определены первичные нуклеотидные последовательности генного локуса Н9 14 изолятов ВОП, 5 вакцинных и полевого штамма ВОК «Кучинский». Анализ последовательностей данного локуса позволяет дифференцировать полевые изоляты от вакцинных штаммов.

ретикулоэндотелиза птиц и для выявления сайта встраивания генома РЭВ в геном ВОП. Анализ 18 изолятов ВОП, 5 вакцинных и одного полевого штамма ВОК на наличие встройки генома РЭВ показал, что в геноме всех полевых изолятов ВОК имеется полная геномная последовательность РЭВ, в то время как в вакцинных штаммах – только длинные концевые повторы РЭВ.

В результате проведенных исследований разработаны следующие нормативные документы:

- «Методические рекомендации по выявлению вируса оспы кур с помощью полимеразной цепной реакции» (2010 г.);

- «Методические рекомендации по выявлению ДНК вируса оспы птиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с рекомбинантным положительным контролем» (2011 г.) испытания, были одобрены Учёным советом, утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ»

диагностических и научных исследований.

1. Бочарников А.В., Ковалишина Н.И. К вопросу о продолжительности иммунитета у кур, вакцинированных различными дозами эмбрионвакцины против оспы птиц // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: метериалы Междунар. науч. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ», Владимир, 30-31 окт. 2003г. – Владимир, 2003. – С. 366-368.

2. Бочарников А.В., Кулаков В.Ю. Стабильность вакцинных штаммов вирусов инфекционного ларинготрахеита и оспы птиц // Ветеринария. – 2004.

- № 3. – С. 22-24.

3. Культуральная вакцина против ньюкаслской болезни и оспы птиц // В.Н. Смирнов, А.Т. Кушнир, Д.В. Колбасов и др. / V Международный конгресс по птицеводству, Москва, 21-24 апреля 2003. – Москва, 2003. – С.

125-129.

4. Методика выявления генома вируса оспы кур методом полимеразной цепной реакции / Г.В. Батченко, С.Н. Колосов, Л.О. Щербакова, В.В. Дрыгин;

ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2006. – 6с.

5. Николаева И.П., Седунова А.И., Талыбова О.Н. Культивирование вируса оспы кур // V Международный конгресс по птицеводству, Москва, 21апреля 2003. – Москва, 2003. – С. 103-105.

6. Оспа птиц и мероприятия по её профилактике в хозяйствах Ростовской области: рекомендации; Северо-кавказский зональный научноисследовательский ветеринарный институт. – Новочеркасск, 1984. – 12с.

7. Похвальный С.А., Кулаков В.Ю. Иммунобиологические свойства аттенуированного штамма «КЭМ-7» вируса оспы кур // Ветеринария и кормление – 2011. - № 6. – С. 42-43.

сельскохозяйственный институт. – Кишинёв, 1989. – 8с.

9. Черкезова Т.В. Реактогенность, безвредность и иммуногенность вакцинного штамма «К» вируса оспы кур для цыплят суточного возраста // Деп. рукопись в РЖ сер. Ветеринария ВНИИиТЭИ Госкомпродзаг СМ СССР, ВАСХНИЛ, М., – 1989, № 7. – С. 28.

10. Черкезова Т.В. Формирование иммунитета к оспе у цыплят раннего возраста: автореф. дис. … канд. биол. наук. – Москва, 2003. – 18 с.

11. AAAP. Avian Histopathology / ed. O.J. Fletcher. – 3rd ed. – Madison, WI: Omni Press, 2008. – 438 p.

12. Boulanger, D., Smith T., Skinner M.A. Morphogenesis and release of fowlpox virus // J. Gen. Virol. - 2000. - Vol. 81. - P. 675-687.

13. Diversity, origins and virulence of Avipoxviruses in Hawaiian Forest Birds / S.I. Jarvi, D. Triglia, A. Giannoulis [et al] // Conserv. Genet. – 2008. – Vol. 9, N 2. – P. 339-348.

14. Identification of the canarypox virus thymidine kinase gene and insertion of foreign genes / H. Amano, S. Morikawa, H. Shimizu [et al] // Virology. – 1999.

– Vol. 256, 280–290.

15. Lee, H.L., Hwa Lee K. Application of the polymerase chain reaction for the diagnosis of fowl poxvirus infection // J. Virol. Methods. - 1997. - Vol. 63. - P.

113–119.

16. Retention of 1,2 kbp of ‘novel’ genomic sequence in two European field isolates and some vaccine strains of Fowlpox virus extends open reading frame fpv241 / S. Jarmin, R. Manvell, R.E. Gough [et al] // J. Gen. Virol. – 2006. – Vol.

87. – P. 3545-3549.

17. Serologic response against fowl Poxvirus and Reticuloendotheliosis virus after experimental and natural infections of chickens with Fowl Poxvirus / R.

Hauck, C. Prusas, H. M. Hafez, D. Luschow // Avian Diseases – 2009. – V. 53. – P. 205-210.

18. The genome of fowlpox virus / C. L. Afonso [et al] // J. Virol. – 2000. – Vol. 74, – P. 3815-3831.

19. Tripathy D.N., Reed W.M. Poxvirus // Diseases of Poultry. – Ames, IA:

Iowa State University Press, 2003. - P. 253-269.

http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2007 (дата обращения:

22.10.12).

7. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Выявление генома вируса оспы птиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / Н.П. Елаткин, Д.Б. Андрейчук, Н.С.

Мудрак [и др.] // Молекулярная диагностика - 2010: сб. тр. VII Всерос. науч.практ. конф. с междунар. участием. - 2010. - Т. 2. - С. 95-97.

2. Клонирование генов иммунологически значимых белков вируса гриппа птиц / Н.П. Елаткин, Д.Б. Андрейчук, Н.Н. Власова [и др.] // Ветеринария и кормление. - 2010. - № 6. - С. 12-14.

3. Конструирование и использование рекомбинантной плазмиды pGEMT4b в качестве положительного контроля в диагностических тестсистемах для выявления ДНК вируса оспы птиц методом полимеразной цепной реакции / Н.П. Елаткин, В.В. Дрыгин // Ветеринарна медицина. Вип.

95: мiжвiд. тем. наук. зб. - 2011. - С. 56-58.

Выявление вируса оспы птиц с помощью молекулярнобиологических методов на территории Российской Федерации в 2009-2011 гг.

/ Н.П. Елаткин, А.Н. Ушакова // Ветеринария и кормление. - 2011. - № (ноябрь-декабрь). - С. 20-21.

5. Эмбриональный штамм "КЭМ-7" вируса оспы кур / С.А.

Похвальный, Н.П. Елаткин // Ветеринария и кормление. - 2011. - № (ноябрь-декабрь). - С. 42-43.

Подписано в печать 15 марта 2013-03- Формат 60х90 1/16. Усл. печ. л. 1.

Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».