На правах рукописи

Рашитова Алена Дмитриевна

КОМПЛЕКСНОЕ ЛЕЧЕНИЕ ТРОФИЧЕСКИХ ЯЗВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ

ВЕНОЗНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.17 – хирургия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа - 2010 2

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Фаязов Радик Радифович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Плечев Владимир Вячеславович доктор медицинских наук Мустафин Айрат Харисович Ведущее учреждение Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертации состоится «» декабря 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.208.006.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу:

45000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», по адресу:

450000, г. Уфа, ул. Пушкина, 96.

Автореферат разослан «» ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук С.В. Федоров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Лечение трофических язв (ТЯ) при хронической венозной недостаточности (ХВН) остается сложной медико-социальной и экономической проблемой современного общества (Simon D.A., 2004). Распространенность ТЯ составляет 1-2% среди трудоспособного населения индустриально развитых стран (Cullum N., 1998; Савельев В.С., 2008; Binder B., 2007), с возрастом достигая 5-7% среди лиц старше 70 лет (Graham I.D., 2003).

Развитие ТЯ при ХВН становится противопоказанием к радикальной операции, приводит к ограничению трудоспособности и значительно снижает качество жизни пациентов (Hyland M. et al.,1994; Franks P. et al.,1994; В.Roe et al., 1995). У половины пациентов ТЯ при ХВН не заживают более 9 месяцев, а в 75% случаев они неоднократно рецидивируют (Бакстон П.К., 2006). В России инвалидизирующие ТЯ при ХВН, резистентные к самым современным методам хирургического и консервативного лечения, встречаются более чем у 1,5 млн.

человек (Савельев В.С., 2008; Богачев В.Ю., 2008).

При длительно незаживающих ТЯ с развитием грубых изменений мягких тканей в виде липодерматосклероза получены удовлетворительные результаты при иссечении ТЯ вместе с измененными тканями (Michel P., 2006; Богданец Л.И., 2010), но в большинстве случаев данная методика приводит к усугублению язвенно-некротического процесса (Гарипов Р.М., 1992). Использование плазменных методов в хирургическом лечении ТЯ дает лишь незначительное улучшение результатов (Хасанов А.Г. с соавт., 2009). Поэтому недостаточная эффективность существующих консервативных и хирургических методов лечения побуждает искать новые пути лечения больных с ТЯ при ХВН.

В последние годы в хирургической практике активно внедряются радиочастотные методы лечения (Тимербулатов В.М. с соавт., 2005). Но в лечении ТЯ при ХВН радиохирургические методы не используются, хотя представляются перспективным направлением.

Среди различных способов местного лечения ТЯ заслуживает внимания использование биоматериалов, раневых покрытий и клеточных компонентов соединительной ткани (культивируемых in vitro ауто– или аллогенных фибробластов), пересадка которых может быть альтернативой аутодермопластике (Martin L. et al, 2003; Agren M.S., 1998; Хунафин С.Н. с соавт., 2005; Богданец Л.И., 2010). Пересаженные аллогенные фибробласты оказывают непосредственное Экспериментально доказана эффективность аллогенных дермальных фибробластов в коллагеновом геле (дермальный эквивалент) на полнослойной ране спины крыс (Мельцова А.Ж., 2006). В ряде работ показана эффективность применения дермального эквивалента в лечении ТЯ при ХВН (Мельцова А.Ж., 2006; Лапин А.Ю., 2007).

Принимая во внимание опыт клиницистов, следует отметить, что не выработана единая концепция в тактике лечения ТЯ при ХВН с применением аллогенных фибробластов в комплексе с биодеградирующим полимерным покрытием. Недостаточная изученность данного вопроса, отсутствие данных о способе применения, показаниях и противопоказаниях для трансплантации клеточных культур и ряд других нерешенных вопросов ограничивают возможность широкого использования данного метода. Поэтому представляется актуальной и перспективной разработка оптимальных подходов к рациональной и эффективной комплексной терапии ТЯ при ХВН с применением новых хирургических и биомедицинских технологий.

Улучшить результаты комплексного лечения больных с трофическими язвами нижних конечностей при хронической венозной недостаточности.

1. Разработать экспериментальные модели хронической венозной недостаточности и трофической язвы.

2. В экспериментальном исследовании обосновать возможность и эффективность применения аутологичных и аллогенных фибробластов в лечении трофических язв при хронической венозной недостаточности.

3. Разработать и внедрить в клиническую практику комплексный метод лечения трофических язв при хронической венозной недостаточности с применением радиочастотного хирургического иссечения и клеточных технологий с биодеградирующим полимерным покрытием.

4. Изучить эффективность применения разработанного комплексного метода недостаточности.

5. Изучить отдаленные результаты лечения больных с трофическими язвами при хронической венозной недостаточности.

Впервые разработаны экспериментальные модели трофической язвы и хронической венозной недостаточности на животных – белых крысах линии Wistar. В эксперименте на крысах оценена эффективность трансплантации аллогенных фибробластов в периульцелярную зону как альтернативного метода лечения венозных трофических язв. При этом установлено, что трансплантация фибробластов создает оптимальные условия для перехода дегенеративновоспалительной реакции тканей в регенеративную стадию, способствуют активации репаративной регенерации.

Впервые в клинической практике разработан и внедрен комплексный метод лечения трофических язв при хронической венозной недостаточности с применением радиочастотного хирургического иссечения и аллогенных фибробластов с биодеградирующим полимерным покрытием. Выявлено, что применение разработанного метода оказывает стимулирующее влияние на репаративные процессы в трофической язве. Доказана эффективность использования разработанных методов путем сравнительного анализа заживления раневого процесса в контрольной и основной группах. Разработаны показания и противопоказания к использованию клеточных технологий.

Практическая значимость Впервые в хирургической практике разработан комплексный подход в недостаточности с применением радиочастотного хирургического иссечения и аллогенных фибробластов с биодеградирующим полимерным покрытием.

Данный метод лечения позволяет сократить сроки заживления трофических язв, сроки пребывания больных в стационаре, подготовить больных к радикальной операции, улучшить результаты медицинской и социальной реабилитации больных.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Разработанные экспериментальные модели хронической венозной недостаточности и трофической язвы являются оптимальным вариантом для изучения влияния клеточной терапии на процессы репаративной регенерации в области трофических язв при хронической венозной недостаточности.

2. Трансплантация аллогенных фибробластов в периульцелярную зону в альтернативным и эффективным методом лечения больных с трофическими язвами при хронической венозной недостаточности.

3. Эффективность лечения больных с трофическими язвами при хронической венозной недостаточности с использованием аллогенных клеточных культур значительно возрастает в комплексе с хирургическими методами лечения.

4. Комплексный метод лечения больных с трофическими язвами с применением радиочастотного хирургического иссечения и аллогенных фибробластов с биодеградирующим полимерным покрытием позволяет получить положительные результаты в отдаленном периоде в 85,9 % случаев.

5. Применение аллогенных фибробластов в комплексе с биодеградирующим полимерным покрытием позволяет подготовить больных с трофическими язвами нижних конечностей при хронической венозной недостаточности к радикальному оперативному вмешательству.

Основные положения диссертационного исследования изложены на Межрегиональной юбилейной конференции «Достижения и проблемы современной клинической и экспериментальной хирургии», посвященной 70летию кафедры факультетской хирургии БГМУ (2006 г.); Тюменской научнопрактической межрегиональной конференции (2008 г.); заседаниях Ассоциации хирургов Республики Башкортостан (2007, 2009 гг.), межкафедральном совещании хирургических кафедр БГМУ (2010 г.).

Внедрение результатов исследования Результаты работы внедрены в практику работы хирургических отделений Клиники БГМУ, Больницы скорой медицинской помощи, ГКБ №8 г.Уфы, в учебный процесс кафедры хирургии с курсами эндоскопии и подготовки интернов хирургического профиля ИПО БГМУ.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, их них 2 в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК.

Диссертация изложена на 161 страницах машинописного теста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Последний содержит 258 работ: отечественных и 140 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована таблицами, рисунками и диаграммами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая характеристика материала и методов исследования Экспериментальное исследование Экспериментальное исследование выполнено на 90 белых половозрелых крысах линии Wistar массой 180-200 г. в операционной – виварии ГОУ ВПО БГМУ, оборудованном согласно Санитарным правилам от 06.04.1973 № 1045-73.

Операции на животных производились под общим обезболиванием (эфирный наркоз) при строгом соблюдении правил асептики и антисептики в соответствии с Приложением №3 «Порядок проведения процедур на животных» к «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных»

(Утверждены приказом Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г.

№755).

Лабораторные животные были разделены на две группы. Контрольная группа, представленная 45 крысами, после моделирования ТЯ получала местное лечение (обработка ТЯ с последующим применением мази «Левомиколь») и консервативное (пентоксифиллин per os).

В основной группе, состоящей из 45 крыс, после моделирования ТЯ лечение проводилось с применением клеточных культур. Источником аллофибробластов служил кожный лоскут плодов беременных крыс (срок 14- суток). Культивирование клеток производилось в Проблемной научноисследовательской лаборатории трансплантологии ГОУ ВПО БГМУ. После механического диспергирования массу кожного лоскута помещали в колбу с раствором трипсина с последующей трипсинизацией в магнитной мешалке при температуре 37С в течении 3-х минут. Затем проводили отмывание аллофибробластов с помощью центрифугирования (10 минут при 1500 оборотов/ мин). Отмытые клетки культивировали в течение 7 суток в среде ДММ с осуществлялся при помощи инвертированного микроскопа с программным обеспечением фирмы DMIL «Leica» (Германия). После подсчета клеток в суспензии и подсчета живых клеток отмытые культуры помещались в стерильные флаконы.

контактной планиметрии ручным подсчетом по R.W.Sessions с вычислением скорости и размеров заживления. Динамика состояния микроциркуляции в нижней конечности крысы в области ТЯ до и после оперативного вмешательства, а так же после имплантации клеточной культуры изучалась с помощью метода капиллярного кровотока ЛАКК-02 (НПП «Лазма», г. Москва). Морфологические и гистохимические методы исследования проводились на кафедре гистологии БГМУ.

Клиническое исследование Выполнен проспективный анализ результатов лечения 165 больных с ТЯ нижних конечностей при ХВН, госпитализированных в отделения общей хирургии клиники БГМУ, больницы скорой медицинской помощи г. Уфы, городских клинических больниц № 8, № 21 за период с 2005 по 2009 гг. В зависимости от применяемого метода лечения больные распределены на нозологической форме заболевания были статистически сопоставимы по возрасту, полу, этиологии и характеру поражений.

Для наблюдения за пациентами была разработана специальная карта.

Клиническое исследование включало изучение жалоб, анамнеза заболевания и жизни, общего и местного состояния, осмотра в вертикальном положении. При этом учитывались локализация патологического процесса — наличие варикозного расширения вен в системах большой и малой подкожных вен. Для определения и подтверждения наличия и характера венозной патологии и оценки состояния магистральных артерий проводились ультразвуковая допплерография и дуплексное сканирование («ACUSON Sequoia» фирмы «Siemens»).

Контрольная группа представлена 87 (52,73%) больными, которым проводилось стандартное комплексное лечение. Обязательным компонентом консервативных мероприятий явилась эластическая компрессия нижних конечностей. Основу системной фармакотерапии составило применение различных медикаментозных препаратов – использование поливалентного флеботропного препарата детралекс, дезагрегантов, периферических вазодилататоров, антиоксидантов, противовоспалительные препараты, антигистаминные средства. Тактика применения лекарственных средств для местного лечения основывалась на соответствии действия препарата фазе раневого процесса. В период воспаления и экссудации основу лечения составили водорастворимые мази и ферментативные препараты. Во вторую и третью фазы раневого процесса применялись средства стимулирующие грануляцию и эпителизацию язвенной поверхности.

Основную группу составили 78 (47,27%) больных, которым комплексное лечение дополнялось радиочастотным иссечением ТЯ и трансплантацией аллогенных дермальных фибробластов с биодеградирующим полимерным покрытием (БДПП).

Мужчин в исследовании было 44 (26,67%), женщин – 121 (73,33%). При этом в основной группе мужчин – 21 (26,9%), женщин - 57 (73,1%), а в контрольной группе мужчин -23 (26,4%) и женщин 64 (73,6%) (2=0,01; p=0,916).

Возраст больных в исследовании варьировал от 29 до 83 лет. Средний возраст больных в основной группе составил 59,7±10,9 лет, в контрольной группе 59,17±12,07 лет (t=0,58; p=0,567). Средний возраст мужчин в основной группе составил 52,52±8,64 лет, в контрольной 50,91±9,74 лет (t=0,58; p=0,567). Средний возраст женщин в основной группе составил 62,30±10,63 года, в контрольной 61,69±11,33 лет (t=0,3; p=0,761). Распределение больных по возрастным группам представлено в табл. 1.

Характеристика больных по полу и возрастным группам В соответствии с международной классификацией хронической венозной клиническим проявлениям относились к классу С6. Согласно клинической классификации ХВН L.K. Widmer (1978) в модификации Е.Г. Яблокова и соавт.

(1999), у всех пациентов была III стадия заболевания.

Причинами возникновения ТЯ нижних конечностей явились:

- варикозная болезнь (ВБ) в 67 (40,61%) случаях, в том числе в основной группе у 32 (41,03%) и в контрольной у 35 (40,23%) больных (2=0,03; p=0,863);

- посттромботическая болезнь (ПТБ) в 98 (59,39%) случаях, в том числе в основной и контрольной группе у 46 (58,97%) и 52 (59,77%) пациентов соответственно (2=0,067; p=0,796).

ТЯ во всех случаях располагались в нижней трети голени, размеры варьировали от 2 до 8,5 см в диаметре. Средняя площадь ТЯ у пациентов с ВБ в основной группе составила 11,86±5,98 см2, в контрольной группе 10,93±6,16 см (t=0,69; p=0,492). У пациентов с ПТБ средняя площадь ТЯ в основной группе составила 15,68±8,78 см2, а в контрольной 14,47±8,57 см2 (t=0,63; p=0,534).

Длительность существования ТЯ составила при ПТБ от 1 месяца до 15 лет в среднем 2,33±3,58 лет (95%ДИ–[1,62;3,04]), при ВБ от 1 месяца до 35 лет в среднем 5,63±10,87 года (95%ДИ-[3,03;8,23]) (табл. 2).

Длительность ТЯ, лет Примечание: 2=3,2; p=0,526.

Обследование пациентов выполнено в отделениях общей хирургии совместно с ангиохирургом и терапевтом. Среди пациентов 144 (87,3%) ранее прошли курс лечения в отделениях сосудистой хирургии, а 21 (12,7%) человек госпитализированы впервые. Причинами отказов от радикального оперативного лечения были в 72 (43,63%) случаях наличие ТЯ с явлениями присоединившейся инфекции, тяжелая сопутствующая патология у 61 (36,96%) больного и отказ (5,45%) человек от операции, 23 (13,94%) пациента ранее перенесли операции на венозной системе нижних конечностей. Критериями исключения из исследования были больные с ТЯ смешанного генеза с облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей, сахарным диабетом.

использованием радиохирургического аппарата «Surgitron» (США) в режиме резания и коагуляции, под местной анестезией 2%-ным раствором новокаина.

Высокочастотный ток (3,8 МГц), производимый прибором, проходит через тело, не вызывая болезненных сокращений мышц или стимуляции нервных окончаний.

Радиохирургический разрез производится без давления на ткань, легким движением, сводя к минимуму повреждение ткани, при этом отсутствует ожог тканей. Иссечение некротических и рубцово-измененных тканей выполнялось однократно перед процедурой имплантации клеточных культур.

На следующем этапе с целью ускорения репаративных процессов в области ТЯ у всех больных основной группы использовалась культура дермальных фибробластов человека на подложке, культивированные в условиях Проблемной научно-исследовательской лаборатории трансплантологии БГМУ. Материалом для получения культур клеток служила пуповина (плацента), полученная при родовспоможении. После фрагментации и ферментативной обработки материла 0,25%-ным трипсином в течение 15 минут получали первичную культуру фибробластов. Первичную культуру под микробиологическим и морфологическим контролем пассировали. В качестве культуральной среды использовали среду Игла в модификации Дюльбеко или среду Игла с двойным набором аминокислот с добавлением антибиотиков, 2% глутамина и 5% телячьей эмбриональной сыворотки. Культивирование проводили в условиях абсолютной влажности, при температуре 37°С, 5-6% СО2 Для трансплантации использовали культуры 4- 17 пассажей.

Трансплантация культуры фибробластов производилась двумя путями. При помощи тонкой иглы, отступя от края язвенного дефекта на 0,5 см, соблюдая все положения асептики и антисептики, внутридермально вводилась взвесь культуры, содержащая от 1 до 4 млн. клеток, в зависимости от площади ТЯ.

Поверхность язвенного дефекта орошалась взвесью из клеточной культуры, содержащей от 1 до 7 млн. клеток, и закрывалась БДПП, разработанным в Проблемной научно-исследовательской лаборатории трансплантологии ГОУ ВПО БГМУ.

Комбинированное БДПП, представляющее высокопористую пластину бежевого цвета толщиной 6-8 мм, изготовлено методом сублимации из смеси растворов природного биополимера коллагена (на основе 2% раствора коллагена (ФСП 42-0282-1221-01) производства филиала "Иммунопрепарат" ФГУП НПО "Микроген" МЗСР РФ), хитозана и коллагенолитического фермента дигестазы (коллагеназы, получаемой из гепатопанкреаса крабов промысловых видов, производства филиала "Иммунопрепарат" ФГУП НПО "Микроген" МЗСР РФ ферментный препарат «Коллагеназа КК»). Смешанная полимерная матрица позволяет использовать достоинства обоих биополимеров.

Покрытие без дополнительных усилий фиксируется на влажной ТЯ за счет высокой степени адгезии коллагена. Благодаря губчатому строению при аппликации на рану сорбирует раневой экссудат и под его воздействием превращается в гидрофильный гель, заполняющий всю полость ТЯ. Под влиянием экссудата и клеточных элементов тканей коллагеновый гель постепенно лизируется, освобождая дигестазу, а продукты коллагенолизиса, включаясь в процессы раневого метаболизма, стимулируют репаративную регенерацию. Коллаген поддерживает влажную среду в ране, стимулирует синтез нового коллагена, ускоряет регенерацию. Дигестаза лизирует патологически измененный коллаген и некротические массы, разрушает оболочку бактерий.

Повязки не нужно менять, они полностью рассасываются, делая процесс перевязки максимально комфортным. Повторное наложение осуществляется по мере ее лизиса. Вследствие значительного уменьшения количества травматичных перевязок, сокращается частота инфицирования язвенного дефекта.

Контактная планиметрия осуществлялась во время перевязок с помощью двухслойного стерильного целлофанового листа, с последующим ручным подсчетом площади ТЯ в см2 по методу R.W.Sessions и вычислением скорости заживления ТЯ в см2 в сутки. С целью объективной оценки выраженности нарушений микроциркуляции в зоне ТЯ применяли метод ЛДФ (ЛАКК-02).

Бактериологическое исследование включало качественное и количественное изучение микрофлоры в динамике по стандартным методикам. Цитологическое исследование проводилось методом по М.П. Покровской и М.С. Макарову в модификации Д.М. Штейнберга с составлением цитограммы. Гистологическое исследование - методом поверхностных биопсий по М.Ф. Камаеву с окрашиванием препаратов гематоксилин - эозином и по Ван - Гизону.

Методы статистического анализа Статистическая обработка данных исследования проводилась с помощью программного обеспечения STATISTICA for Windows (версии 6.0).

Количественные данные нормально распределенных признаков представлены в виде средней арифметической (М), стандартного отклонения (), ошибки репрезентативности (m). При парном сравнении нормально распределенных количественных признаков применялся критерий Стьюдента (t). Для множественных сравнений в трех и более зависимых группах использовался однофакторный дисперсионный анализ повторных изменений с последующим сравнением в группах по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони. При сравнении качественных признаков использовался двусторонний вариант критерия 2 (хи-квадрат). Проверка статистических гипотез заключалась в сравнивании полученного уровня значимости (р) с пороговым уровнем 0,05. При