На правах рукописи

СТЕПАНОВА Мария Сергеевна

окислительного стресса мозга с помощью

«Коррекция

природных и синтетических антиоксидантов»

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Москва 2009 2

Работа выполнена в лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии Научного Центра неврологии РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Израилевич кандидат биологических наук Казей Василий Игоревич

Ведущая организация: институт биохимии им А.Н. Баха РАН

Защита состоится « 2009 г. в ч. мин. на »

заседании диссертационного учёного совета Д.213.203.13. при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. МиклухоМаклая, д.8, Аграрный факультет РУДН, аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул.

Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан « 2009 г.

»

Учёный секретарь диссертационного совета Д.213.203.13., доктор биологических наук профессор _ Лукашева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Активные формы кислорода (АФК) выполняют в организме разнообразные функции, связанные с регуляцией процессов пролиферации, дифференцировки, клеточной адгезии, свертывания крови, апоптоза, а также защитой организма от чужеродных агентов. Они служат вторичными мессенджерами в многочисленных сигнальных каскадах, инициированных гормонами, цитокинами, факторами роста, влияя на ключевые звенья метаболических процессов в клетке.

Метаболиты кислорода – его активные формы (такие как супероксид радикал, гидроксид-радикал, оксид азота, перекись водорода), а также липидные гидроперекиси могут реагировать с различными клеточными компонентами, что приводит к нарушению клеточных функций. Для предотвращения повреждений в организме существует многоступенчатая система антиоксидантной защиты, включающая как специальные ферменты, так и неферментативные антиоксиданты. В нормальных условиях антиоксидантная система (АОС) способна контролировать и предотвращать негативные последствия действия кислородных радикалов. Однако при избыточном образовании радикалов или нарушении работы антиоксидантной системы возникает дисбаланс между продукцией и нейтрализацией оксидантов. Такое состояние, сопровождающееся усилением деструктивных процессов в тканях, называют окислительным стрессом (ОС).

Свободнорадикальное повреждение клеточных компонентов вовлечено в патогенез многих заболеваний и патологических процессов, таких как ишемическое и реперфузионное повреждение тканей, воспалительные процессы, рак, сосудистые нарушения, атеросклероз, нейродегенеративные заболевания, а также в процессы адаптации и старения (всего более 100) (Halliwell and Gutteridge, 1999).

Для исследования механизмов окислительного стресса при различных заболеваниях применяются методы моделирования этого состояния как in vitro, так и in vivo. В экспериментальных моделях in vivo используют животных с направленно модифицированным генотипом или вызывают состояние окислительного стресса с помощью радикал-продуцирующих агентов и нейротоксинов. Разработка новых моделей, более точно имитирущих свободнорадикальные патологии у человека, является актуальной проблемой, в частности, для таких состояний, как инсульт и нейродегенеративные заболевания.

Для подавления окислительного стресса все чаще используются синтетические антиоксиданты, применение которых нарушает сигнальную роль АФК и ухудшает адаптационные возможности организма. В связи с этим, актуальным является систематическое исследование природных протекторов. Анализ воздействия этих соединений на организм в условиях окислительного стресса является весьма важной задачей. Природные антиоксиданты могут играть существенную роль в предотвращении заболеваний, связанных с окислительным повреждением, а изучение механизмов работы антиоксидантной системы создает возможность для разработки новой стратегии профилактики и лечения этих заболеваний.

Цель исследования: изучение механизмов действия природных протекторов карнозина и N-ацетиласпартилглутамата (NAAG) и их сравнение с синтетическим лекарственным препаратом мексидолом (2этил,6-метил,3-оксипиридина сукцинат) на комбинированных моделях окислительного стресса.

В соответствии с этой целью были поставлены и решены следующие задачи: 1) характеристика последствий пренатальной гипоксии на клеточном уровне и на уровне целого организма; 2) разработка комбинированных моделей окислительного стресса (вызываемого модификацией энергетического обмена и/или нарушением мозгового кровообращения), позволяющих оценить влияние окислительного стресса на неврологические и биохимические характеристики организма исследуемых животных; 3) сравнительный анализ протекторного действия карнозина, мексидола и NAAG в используемых моделях окислительного стресса.

экспериментальные модели окислительного стресса мозга, создаваемые комбинацией ишемического (гипоксического) повреждения и действия нейротоксина 3-НПК. По ряду параметров такие комбинированные модели окислительного стресса в большей степени приближены к ситуациям, возникающим при нейродегенеративных заболеваниях человека. Показано, что карнозин, мексидол и NAAG оказывают защитное действие на мозг экспериментальных животных в условиях окислительного стресса. При этом карнозин и мексидол в одинаковой степени предотвращают развитие окислительных повреждений в мозге и эффективны во всех использованных моделях, в то время как NAAG не полностью предотвращал снижение антиоксидантной активности и развитие окислительных повреждений в мозге и был неэффективен в моделях с использованием 3-НПК.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Разработаны комбинированные модели окислительного стресса, позволяющие выявить и сопоставить неврологическую симптоматику с возникшими метаболическими нарушениями. В диссертации представлены доказательства эффективности карнозина, как модулятора функции нейронов головного мозга, проявляющего свою активность независимо от природы окислительного стресса на различных моделях in vitro и in vivo. Обоснована целесообразность использования карнозина и мексидола как дополнительного терапевтического средства при стандартной лекарственной терапии пациентов в условиях окислительного стресса.

представлены на научной экологической конференции в РУДН 18-19 мая 2004 г. «Актуальные проблемы экологии и природопользования» (Москва, 2004); на Х Международном Симпозиуме по фармакологии церебральной ишемии (Марбург, Германия 2004); Научной конференции "Нейрохимия:

фундаментальные и прикладные аспекты" (Москва, 2005); Международной конференции "Neuroscience 2005" (Вашингтон, 2005); XIII Международной конференции и дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Крым, Украина, 2005); на Международном Конгрессе «Молекулярные основы неврологических и психиатрических заболеваний» (Мартин, Словакия, 2006); на конференции «Структурные функциональные нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, 2007); на III Евро-азиатской конференции, посвященной влиянию отходов производства на здоровье человека (Стамбул, Турция, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 8 статей в журналах по списку ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на _ страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы.

Работа иллюстрирована 32 рисунками и 13 таблицами. Список литературы включает 211 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.Модель пренатальной гипоксии. В опытах использовано потомство, полученное от 15 самок (119 животных). Гипоксической гипоксии подвергали самок крыс на 10 день беременности, создавая в барокамере разрежение, соответствующее подъему на высоту 12 000 м над уровнем моря. Животных выдерживали в условиях гипоксии вплоть до остановки дыхания (180-240 с). Животные получали в постгипоксическом периоде карнозин (100 мг/кг в день в составе питьевой воды ежедневно);

мексидол (100 мг/кг в день в составе питьевой воды ежедневно); NAAG (по мг/кг интраперитонеально дважды - спустя 1 час и 3 часа после гипоксического эпизода).

В физиологических экспериментах крыс в возрасте 22 дней тестировали в «открытом поле», а в возрасте 30 дней проверяли обучаемость животных с помощью Т-образного лабиринта. В Т-образном лабиринте животных обучали находить пищу ежедневно в течение 10 дней (с 30 по день жизни), после чего проводили 2 тестирования на запоминание (в период между 13-15 и 35-38 днями от начала обучения).

В биохимических экспериментах оценивали антиоксидантную устойчивость мембран мозга, используя тест Fe2+-индуцированной хемилюминесценции. Измерение хемилюминесценции гомогенатов мозга проводили на люминометре LKB 1251 (Швеция), оценивая следующие показатели: h (mV) – уровень предобразованных гидроперекисей, (c) – лагпериод (характеризует устойчивость ткани к окислению), а также скорость окисления липидного материала (Федорова и соавт., 1998).

В опытах на нейронах использовали полученную из мозжечка первичную (недифференцированную) культуру гранулярных клеток, исследуя их резистентность к окислительному стрессу, вызываемому перекисью водорода (20 мМ) или NMDA (N-метил-D-аспартата, 100- мкМ).

Моделирование окислительного стресса на суспензии нейронов in vitro. Исследование окислительного стресса на суспензии нейронов мозжечка 9-12 дневных крыс, проводили на проточном цитометре EPICS XL фирмы Beckman Coulter (США). Для регистрации изменения уровня свободных радикалов в клетках использовали карбокси-2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (СDCF-DA, 100 мкМ). Количество мертвых клеток в нейрональной суспензии измеряли в присутствии иодида пропидия (PI). В каждой пробе подвергали анализу 10 000 клеток, повторяя измерения в 3-4 параллельных пробах.

Часть экспериментов (измерение хемилюминесценции гомогенатов мозга крыс и обучение в Т-образном лабиринте ) была выполнена совместно с Добротворской И.С.

2.Модель гипобарической гипоксии, отягощенной нарушением энергетического метаболизма в результате действия нейротоксина 3нитропропионата (3-НПК). В работе использовали 90 половозрелых крыс самцов линии Wistar. В первой серии экспериментов 3-НПК в дозе 30 мг/кг вводили крысам внутрибрюшинно в течение 6 дней после гипоксии. Во второй серии экспериментов после 5-дневного введения 3-НПК на 6 сутки от начала введения, животных подвергали гипобарической гипоксии (см. раздел 1, Материалы и методы). Сразу после восстановления дыхания гипоксических животных случайным образом разделяли на группы (по 10- животных) и вводили им интраперитонеально (однократно) карнозин ( мг/кг массы тела), мексидол (50 мг/кг), мексидол совместно с карнозином (в тех же дозах) или физиологический раствор.

В течение всего эксперимента ежедневно проводили регистрацию веса животных и оценку развития неврологических нарушений, вызванных действием 3-НПК с помощью 5-балльной шкалы оценки неврологических симптомов (Beal, 1994; Guyot et al, 1997, Федорова и соавт., 2002). На 7-е сутки животных декапитировали и использовали серое вещество головного мозга для выделения митохондриальной фракции, проводимого методом дифференциального центрифугирования. В митохондриальной фракции определяли активности супероксиддисмутазы (СОД), моноаминоксидазы В (МАО В) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ). Активность супероксиддисмутазы определяли по подавлению скорости восстановления нитросинего тетразолия при генерации супероксидного анион-радикала в процессе окисления ксантина ксантиноксидазой. За единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимое для 50% подавления восстановления нитросинего тетразолия в условиях проведения реакции (Mishra, Fridovich, 1972). Активность МАО В определяли, используя в качестве субстрата бензиламин (Gallant et al, 2000). Активность СДГ определяли по скорости феназинметасульфата при ферментативном окислении сукцината натрия (Кривченкова, 1977).

3.Модель ишемии, отягощенной нарушением энергетического метаболизма в результате действия нейротоксина 3-нитропроприоната (3-НПК). Моделирование 3-сосудистой глобальной ишемии головного мозга (Pulsinelli, Brierley, 1979; Fedorova et al, 2002) осуществлялось в два этапа: на первый день проводили пережигание левой позвоночной артерии, на второй день создавали 15-минутную окклюзию обеих сонных артерий с последующей 5-дневной реперфузией. Забой животных проводили на 7 день эксперимента. В течение 5-ти дней реперфузии животные получали 3-НПК, 30 мг/кг, i.p. ежедневно. Карнозин вводили (100 мг/кг, i.p.) по следующей схеме: в начале реперфузии (в течение 1 мин), через 4, 8 и 24 часа после операции, далее – ежедневно, 1 раз в сутки в течение 3 дней. NAAG (5 мг/кг, i.p.) вводили животным за 30 мин до ишемии и на следующие сутки после операции.

Неврологическую симптоматику животных оценивали по 5-балльной шкале признаков (Beal, 1994; Guyot et al, 1997, Федорова и соавт., 2002) сразу после выхода животных из наркоза, и затем через 4, 8 и 24 часа и далее ежедневно в течение всего периода реперфузии. В митохондриальной фракции серого вещества больших полушарий головного мозга проводили измерение активности супероксиддисмутазы (СОД), моноаминооксидазы В (МАО В) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ). В гомогенате мозга в условиях Fe2+-индуцированной хемилюминесценции измеряли уровень окисления (v) и лаг-период (), характеризующий общую окислительную резистентность образцов (Fedorova et al, 1999).

Статистическую обработку данных проводили по критерию КрускалаУоллиса, с последующим анализом с помощью критерия Данна.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика модели пренатальной гипоксии. Животные, перенесшие пренатальный гипоксический эпизод, в первые дни жизни отличались пониженной массой тела и были менее подвижны по сравнению с интактной группой. Нейроны, выделенные из мозга животных, перенесших гипоксию, отличались повышенным уровнем флуоресценции DCF, что свидетельствует о повышенном уровне свободнорадикальных процессов в мозге этих животных. Для оценки устойчивости мозга животных к окислительному стрессу, нейроны, изолированные из мозжечка 12-дневных животных подвергали действию перекиси водорода, что приводило к резкому возрастанию уровня свободных радикалов (рис. 1А). Нейроны гипоксической группы животных были более чувствительны к воздействию перекиси водорода. При воздействии перекиси водорода наблюдалось также увеличение количества мертвых клеток (рис. 1Б).

% интенсивно окрашенных по DCF Рис. 1. Увеличение процента клеток с повышенным уровнем АФК (А) и количества мертвых клеток (Б) при воздействии перекиси водорода (20 мМ в течение 20 мин) на нейроны. «*» соответствует достоверному отличию от контроля; «#» соответствует достоверному отличию от группы интактных животных.

Инкубация клеток с агонистом ионотропных глутаматных рецепторов NMDA также вызывала значительный прирост уровня АФК (рис. 2).

течение 60 мин) на нейроны Таким образом, в нервных клетках мозга, формировавшегося в условиях окислительного стресса, вызванного перенесенным гипоксическим эпизодом, наблюдался повышенный уровень АФК, и, вследствие этого, снижалась устойчивость к воздействию специфических и неспецифических индукторов окислительного стресса. Мы предположили, что это связано с истощением антиоксидантной защиты в тканях мозга.

При анализе устойчивости тканей мозга к окислению мы обнаружили, что в мозге животных гипоксической группы существенно увеличивается уровень предобразованных гидроперекисей, возрастает скорость окисления и резко уменьшался лаг-период окисления, характеризующий общую антиоксидантную активность тканей мозга, по сравнению с контрольными параметрами (таблица 1).

Полученные результаты указывают на системные изменения биохимических параметров мозга потомства, перенесшего пренатальную гипоксию, выражающиеся в существенном ослаблении эндогенной системы антиоксидантной защиты и приводящую к усиленной гибели нейронов в условиях индуцированного стресса.

хемилюминесценции гомогенатов серого вещества мозга различных групп животных.

Параметры Fe2+-индуцированной хемилюминесценции