WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Учреждение Российской Академий Наук

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

_

на правах рукописи

Куркова Инна Николаевна

Структурно-функциональный анализ каталитического антитела А.17.

Каталитический механизм деградации фосфорорганического пестицида параоксон.

Специальность: 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Учреждении РАН Институте биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Научные руководители:

доктор биологических наук Пономаренко Наталья Александровна кандидат химических наук Смирнов Иван Витальевич

Официальные оппоненты:

Деев Сергей Михайлович доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ИБХ РАН) Демидкина Татьяна Викторовна доктор химических наук, профессор, заведующая лабораторией химических основ биокатализа Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта (ИМБ РАН).

Ведущая организация: Учреждение Российской Академий Наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится « » 2011 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении РАН Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу:

117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан «_» 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук В.А. Олейников

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Поиск эффективного антидота, способного нейтрализовать фосфорорганические токсины (ФОТ), остается актуальной проблемой молекулярной биологии и биотехнологии. Самыми многообещающими среди прочих в этой области являются разработки препаратов на основе ферментов. Ферменты, участвующие в метаболизме ацетилхолина, являются основными мишенями ФОТ в организме человека.

На сегодняшний день бутерилхолинэстераза (BChE) считается перспективным средством антидотной профилактики и лечения отравлений ФОТ. Существующие в данный момент промышленные системы экспресии BChE дороги, недостаточно эффективны и требуют существенного улучшения. В настоящее время рекомбинантные антитела широко применяются как терапевтические агенты и имеют ряд преимуществ перед ферментами в качестве лекарственных средств. Потенциальный антидот на основе каталитического антитела (абзима) будет сочетать в себе свойство фермента способность эффективно осуществлять катализ с низкой иммуногенностью, продолжительным периодом циркуляции в кровотоке и действенными механизмами выведения из организма в составе комплекса антиген-антитело, характерными для молекул иммуноглобулинов.

В связи с этим создание «каталитической» вакцины – каталитического антитела, способного нейтрализовать ФОТ, актуально. Кроме того, изучение механизма катализа подобных искусственных ферментов представляет собой самостоятельную, весьма интересную с точки зрения фундаментальной науки проблему.

Цель работы. Цель настоящего исследования состояла в проведении структурнофункционального анализа каталитического антитела А.17, полученного ранее в лаборатории биокатализа методом фагового дисплея. Вариабельные домены данного антитела были отобраны из полусинтетической библиотеки генов одноцепочечных антител по принципу «механизм-зависимого» связывания с п-нитрофенил 8-метил-8азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонатом (фосфонатом Х), аналогом ФОТ по механизму действия на сериновые гидролазы. Кроме того, самостоятельной задачей представленной работы стало изучение каталитического механизма деградации ФОТ на примере фосфорорганического пестицида параоксон.

Научная новизна и практическая значимость работы. Полученные в результате работы данные позволили существенно продвинуться в понимании структурной организации активного центра искусственно полученного биокатализатора иммуноглобулиновой природы. Впервые разрешена структура как Fab фрагмента каталитического антитела А.17 и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната Х. Комплексное физико-химическое исследование позволило предположить осуществление механизма индуцированного соответствия при взаимодействии А.17 с фосфонатом Х. Изучение функциональной активности абзима позволило выявить его способность ускорять гидролиз фосфорорганического пестицида параоксон. Было показано, что данное превращение осуществляется по пути ковалентного катализа. Полученные результаты могут быть использованы как основа для рационального дизайна с целью улучшения каталитической эффективности имеющейся активности А.17 или при получении новых биокатализаторов. Полученные данные могут иметь биотехнологическое значение.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на 3-ей международной конференции «Ранние события при патологиях человека» (Барбизон, Франция, 2010), 35-м конгрессе FEBS (Гетеборг, Швеция, 2010), 36-м конгрессе FEBS (Турин, Италия, 2011), 21-м IUBMB и 12-м FAOBMB Международном конгрессе Биохимии и Молекулярной биологии (Шанхай, Китай, 2009). По материалам работы вышли 3 статьи в рецензируемых журналах.



Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из разделов введение, обзор литературы, экспериментальная часть, включающая разделы «результаты и их обсуждение» и «материалы и методы», выводы, дополнительные материалы и список цитируемой литературы, содержащий 149 ссылок. В работе содержится рисунка и таблиц.

Содержание работы Одноцепочечное антитело А.17 взаимодействует с фосфорорганическим пестицидом параоксон Каталитическое антитело А.17 было отобрано из фаг-дисплейной библиотеки генов одноцепочечных антител по способности связывать механизм-зависимый ингибитор сериновых гидролаз и ацетилхолинэстеразы фосфонат Х (Рис.1). Методом масс-спектрометрии было показано, что модификации подвергается аминокислотный остаток Tyr37 легкой цепи (Reshetnyak et al, J Am Chem Soc, 2007).

Представлялось значимым и интересным проверить связывание и каталитические функции данного антитела по отношению к ряду ФОТ. На первом этапе настоящей работы было показано, что реакция одноцепочечного антитела А.17 с биотинилированным производным фосфоната Х (Bt-X) ингибируется диизопропилфтор инсектицидом параоксон (Рис. 1). Детекцию взаимодействия проводили с помощью Вестерн блот анализа, результаты приведены на рисунке 2.

составляло 12 часов. Визуализацию ковалентного аддукта с Bt-X осуществляли окрашиванием стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (Strept-HRP). Концентрация антител нормирована по сравнительной окраске антителами, специфичными к с-myc эпитопу на аналогичной мембране.

А.17Y-L37F отрицательный контроль – мутантное одноцепочечное антитело.

полноразмерного антитела А. Для одноцепочечных антител известны проблемы экспрессии, протеолитической лабильности и фолдинга (в том числе склонность к агрегации). Полноразмерное антитело предпочтительнее использовать в качестве терапевтического агента в связи с большим периодом его циркуляции в кровотоке и его способностью запускать гуморальные и клеточные эффекторные механизмы выведения комплексов с антигеном.

При перестановке конструкций одноцепочечных антител в полноразмерные иммуноглобулины класса G специфичность антиген связывающего центра обычно сохраняется, а аффинность может возрастает благодаря бивалентной природе IgG.

В продолжение работы вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей А.17 были переклонированы в вектора для экспрессии в виде полноразмерных легкой и тяжелой цепей в эукариотической системе.

При этом вариабельный фрагмент легкой цепи А.17 был переклонирован для экспрессии в виде полноразмерной каппа 1 цепи иммуноглобулина человека под контролем иммуноглобулинового промотера.

Экспрессионный вектор с сайтами клонирования вариабельного фрагмента легкой цепи антитела (pSV40/Zeo2 Lch) был получен модификацией вектора pSV40/Zeo (Invitrogen). Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность лидерного пептида для легких цепей антитела (L prom leader MVSTPQFLVFLLFWIPASRG), был синтезирован методом ПЦР с использованием трех олигонуклеотидов с перекрывающимися последовательностями. Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность константного региона каппа 1легкой цепи иммуноглобулина человека (kappa chain), был получен амплификацией с помощью ПЦР, используя геномную ДНК человека в качестве матрицы и пару специфических праймеров. Участок ДНК, кодирующий вариабельный фрагмент легкой цепи антитела А.17 (Vl A.17), амплифицировали с помощью ПЦР с использованием плазмиды pHEN2, несущей нуклеотидную последовательность, кодирующую scFvА.17 (pHEN2A.17), в качестве матрицы и пары специфических праймеров.

В свою очередь, вариабельный фрагмент тяжелой цепи А.17 был переклонирован для экспрессии в виде полноразмерной гамма 1 цепи иммуноглобулина человека также под контролем иммуноглобулинового промотера.

Экспрессионный вектор с сайтами клонирования вариабельного фрагмента легкой цепи антитела (pcDNA.1.3.HygroНch) был получен модификацией вектора pcDNA.1.3.Hygro (Invitrogen). Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность лидерного пептида для тяжелых цепей антитела (H prom leader MERHWIFLSLLSVIAGVHS), был синтезирован методом ПЦР с использованием трех олигонуклеотидов с перекрывающимися последовательностями. Фрагмент ДНК, кодирующий последовательность константного региона гамма 1 тяжелой цепи иммуноглобулина человека (gamma chain), был амплифицирован с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК человека и две пары специфических праймеров.

ПЦР-амплификацию фрагмента ДНК, кодирующего вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела А.17 (Vh A.17), осуществляли с использованием в качестве матрицы pHEN2A.17 и специфических праймеров.

pcDNA.1.3Hygro Нch А.17 представлена на рис.3.

Рис. 3. Схема генетических конструкций для экспрессии полноразмерных легкой и тяжелой цепей антитела А.17 в эукариотической системе.

Полученными генетическими конструкциями была проведена ко-трансфекция клеточных линий CHO-К1 и миеломы NSObcl2. В результате селекции с использованием антибиотиков зеоцин и гигромицин были получены 5 стабильно продуцирующих клонов трансфектом. Уровень продукции рекомбинантных антител оценивали методом ИФА по схеме sandwich ELISA. Для каждого клона были подобраны оптимальные условия экспрессии. Для лучшего клона 2В5 из трансфектом клеток линии СНО-К1 среда DMEM, содержащая 2% фетальной сыворотки, и среда Pro-CHO4 (Lonza) являются оптимальными, концентрация человеческих антител в культуральной среде достигает максимума на 8 день и составляет 10 мг/мл. Для лучшего клона 2G3 из трансфектом клеток линии NSO-bcl2 оптимальной является среда DMEM-RPMI (Gibco) 50% на 50%, содержащая 2% фетальной сыворотки. Концентрация человеческих антител в этой культуральной среде достигает 18 мг/мл на 8 день.

Затем была разработана система экспрессии антитела А.17 в препаративных количествах. Для этого были использованы культуральные флаконы большой площади ( и 225 см2), роллеры (1700 см2) и спиннеры с микроносителями. Оптимальной по соотношению «выход целевого белка затраты» и чистоте финального продукта была признана экспрессия в культуральных флаконах площадью 225 см2 на бессывороточной среде Pro-CHO4, в процессе культивирования удалось добиться уровня экспрессии мг антитела с литра для клона 2В5 клеточной линии CHO.

Культуральную среду собирали, центрифугировали, супернатант фильтровали через бумажные фильтры. Осветленную культуральную среду подвергали ультрафильтрации на приборе Pellicon (Millipore) на мембранах 300 кДа. При этом отделяли остатки клеточного дебриса и высокомолекулярные соединения. Далее фильтрат концентрировали на мембранах 30 кДа в 10 20 раз по объему и переводили под буферный раствор PBS. Полученный концентрат был последовательно очищен методом аффинной хроматографии на колонках с иммобилизованным белком А и иммобилизованными антителами козы, специфичными к иммуноглобулинам человека, после чего осуществляли гель-фильтрацию на колонке Superdex 200 (Amersham). Выход целевого белка оценивался методом ИФА и составил 70%. Чистоту полученного продукта оценивали с использованием денатурирующего электрофореза в 12% ПААГ в восстанавливающих условиях с последующей окраской Кумассии синим R250, чистота достигала 95% (Рис.

восстанавливающих условиях с последующей окраской Кумассии синим R250 (А) и Вестерн-блот анализ (Б) очищенного препарата полноразмерного рекомбинантного антитела А.17 из среды культивирования трансфектомы 2В5 клеточной линии СНО. Визуализацию осуществляли с использованием антител козы, специфичных к Fc фрагменту Сравнение функциональной активности одноцепочечного и полноразмерного антитела А. Анализ реакционной способности показал, что вариабельные фрагменты легких и тяжелых цепей А.17, экспрессированные в составе полноразмерного антитела человека, сохранили способность взаимодействовать с небиотинилированным фосфонатом Х.

Оценка кинетических параметров этого взаимодействия с использованием схемы Китца-Вилсона показала, что реакционная способность полноразмерного антитела значительно выше по сравнению с опубликованными ранее данными для одноцепочечного антитела (таблица 1).

Таблица 1. Кинетические параметры реакции одноцепочечного и полноразмерного антитела A.17 с фосфонатом Х (по схеме Китца-Вилсона). Измерение проводили при 37оС, концентрация активных центров A.17 1 мкМ, концентрацию фосфоната Х варьировали от 10 до 100 мкM.

При этом эффективность модификации полноразмерного антитела увеличилась более чем в 10 раз по сравнению с одноцепочечным А.17. Такое увеличиние эффективности модификации достигается за счет образования более прочного нековалентного комплекса антитела с фосфонатом Х, что, по всей видимости, связано с лучшей стабилизацией антиген-связывающего участка полноразмерного антитела. Незначительное снижение к2, т.е. скорости перехода обратимого комплекса с ингибитором в ковалентный, возможно связано с тем, что константные участки легких и тяжелых цепей ограничивают подвижность вариабельных участков молекулы в активном центре.

Методом масс-спектрометрии MALDI было установлено, что ковалентная модификация полноразмерного антитела А.17 фосфонатом Х происходит по тому же пептидному участку легкой цепи иммуноглобулина, что и в случае одноцепочечного антитела.

Было показано, что полноразмерное антитело сохранило способность взаимодействия с биотинилированным производным фосфоната Х и субстратную специфичность по отношению к аналогам ФОТ, сравнимую с одноцепочечным А.17. В обоих случаях модификация фосфонатом Bt-X ингибируется ДФФ, АЭБСФ и параоксоном, тогда как ингибирование отсутствует в случае экотиофата (Рис.5). Интересно, что химические структуры экотиофата и параоксона довольно схожи. Отсутствие взаимодействия с экотиофатом может быть объяснено различными свойствами химических связей P-S и P-O. По-видимому, нуклеофильная атака со стороны гидроксила боковой группы Tyr легкой цепи антитела оказывается более эффективной в случае более поляризованной связи Р-О. Возможно также, что продуктивному позиционированию молекулы экотиофата в активном центре А.17 мешает его заряженная боковая группа. Полученные данные демонстрируют субстратную селективность активного центра изучаемого искусственного биокатализатора.

Рис. 5. Вестерн блот анализ ингибирования связывания одноцепочечного (scFvА.17) и полноразмерного антитела А.17 с биотинилированным проводили в течение часа при 37 С, объем реакционной смеси 20 мкл. Прединкубация осуществлялась при 37оС. Время прединкубации составляло 1 час для всех ингибиторов, кроме экотиофата и параоксона. Для последних время прединкубации составляло 12 часов. А.17Y-L37F отрицательный контроль – мутантное одноцепочечное антителами, специфическими к Fc фрагменту тяжелой цепи антитела человека, на той же мембране в случае полноразмерного антитела.

Для изучения молекулярных основ механизма катализа абзима перспективным представлялось проведение рентгеноструктурного анализа Fab фрагмента этого антитела.

Структурный анализ антитела А. Кристаллизация осуществлялась в лаборатории П. Массона в Гренобле, Франция.

Детальный анализ структуры был произведен в сотрудничестве с профессором А. Трамонтано (Дэвис, Калифорния), профессором А. Фрибуле (Компьень, Франция) и лабораторией профессора А.Г. Габибова в рамках проекта НАТО «Наука для мира». Структуры Fab фрагмента антитела А.17 и его аддукта с остатком фосфоната Х были установлены с разрешением 1.5 и 1.36 соответственно. Координаты атомов и экспериментальные структурные факторы депонированы в Банк белковых структур (Protein Data Bank) с идентификационным кодом 2XZA и 2XZC.

Пространственная структура Fab фрагмента антитела А. Антигенсвязывающий центр антитела образован тремя -тяжами вариабельного фрагмента легкой и четырьмя -тяжами вариабельного фрагмента тяжелой цепи. Совместно они образуют глубокую полость, в формировании стенки которой так же участвует петля Leu99-Gly110 тяжелой цепи. Полость пространственно разделена на две «камеры» (Рис.6А-В). В составе верхней камеры выделяется группа ароматических аминокислотных остатков, в том числе пять тирозинов (Tyr-H33, 53, 59; Tyr-L33, 50) и триптофан Trp-L92. Подобные кластеры тирозиновых аминокислотных остатков являются характерной чертой антител, специфичных к ДНК и другим фосфорным эфирам.

Нижняя камера содержит ароматические аминокислотные остатки Phe-L100, Trp-H48 и Trp-H109, формирующие гидрофобный карман, и Tyr-L37, находящийся на дне полости (Рис.6Г). Боковая цепь Tyr-L37 ориентирована в сторону CDR3 тяжелой цепи. Такое глубинное, скрытое от растворителя, расположение реакционного тирозина согласуется с его повышенной нуклеофильностью. Суммарная глубина антигенсвязывающего кармана составляет 15. Столь глубокий активный центр нетипичен для каталитических антител и более характерен для каталитических центров холинэстераз, в частности бутирилхолинэстеразы (Рис. 7).

Петля Leu99 Gly110 тяжелой цепи, содержащая остатки His-H104, Asn-H105 и Trp-H109, представляет собой неупорядоченную структуру с В-фактором сравнении со средним В-фактрором 19 2. Низкий уровень упорядоченности, повидимому, связан со слабым взаимодействием аминокислотных остатков этой петли с коровыми структурами.

отображением ароматических аминокислотных остатков, формирующих стены верхней и нижней камер, а так же тирозина 37 легкой цепи в Fabфрагменте А.17 (Г). Легкая цепь показана серым, Рис.7. Сравнение глубин полостей активных центров биокатализаторов различной природы.

TEPC-15 и 49G7 эстеролитических антител, 33F12 альдолазное антитело, AChE и BChE ацетил- и бутерил- холин эстеразы. В каждом случае глубина активного центра соответствует высоте пирамиды, вписанной в полость активного центра таким образом, что ее вершина совпадает с реакционным остатком, а основание лежит в плоскости, проведенной через три аминокислотных остатка ближайших ко входу в активный центр биокатализатора.

Пространственная структура Fab фрагмента антитела А.17, модифицированного фосфонатом Х При анализе структуры ковалентного аддукта Fab фрагмента антитела А.17 с остатком фосфоната Х было установлено, что длина связи Р-О составяет 1.6. Фенильная группа фосфоната направлена к поверхности вариабельного участка легкой цепи, в то время как его тропинольная группа обращена к поверхности вариабельного участка тяжелой цепи. Абсолютная конфигурация аддукта Р(S). Учитывая, что фосфонилирование может осуществляться только в одном направлении (подход фосфоната Х к реакционному тирозину возможен только в единственной пространственной ориентации из-за конфигурации активного центра), каталитическое антитело обладает стереоспецифичностью по отношению к его Р(R) энантиомеру. Таким образом, вероятнее всего при взаимодействии А.17 с фосфонатом Х реализуется SN2 механизм реакции. Фенольное кольцо фосфоната в составе ковалентного аддукта погружено в карман, образованный основной цепью Gly-L90 Thr-L91 и боковыми цепями Ser-L35, Trp-L92, Pro-L98, PheL100, и при этом осуществляет Т-стэккинг взаимодействие с Trp-L92 и Phe-L100 (Рис.

8А). Одновременно с модификацией тирозина индуцируется вращение фенильной группы фосфоната на угол 2 равный 20°, сдвиг Trp-L92 на 0.4 и вращение вокруг PheL100C на 10°. Благодаря этим изменениям угол, образованный C-C-C боковой цепи Tyr-L37, уменьшается на 5° по сравнению с исходной позицией. Высвобождение этого напряжения может являться движущей силой при дефосфорилировании Tyr-L37.

Атом азота тропинольного кольца фосфоната формирует сильную водородную связь (2.79 ) с атомом кислорода основной цепи аминокислотного остатка Asn-H (Рис. 8А). За счет этого сильного взаимодействия петля CDR3 варибельного участка тяжелой цепи стабилизируется в уникальной конформации, В-фактор становиться равным 25 2. Атом кислорода связи Р-О прочно соединен водородной связью с молекулой воды w614 (2.55 ). Таким образом, связь Р-О оказывается сильно поляризованной, следствием чего является повышенная электрофильность атома фосфора. Сгусток электронной плотности непосредственно за фосфонилированным тирозином смоделирован как кластер молекул воды. Этот кластер располагается на расстоянии меньшем, чем от атома фосфора, и представляется потенциальным участником возможной гидролитической атаки аддукта тирозина. Tyr-Н34 так же может играть значительную роль при фосфорилировании за счет стекинг-взаимодействия между его ароматическим кольцом и п-нитрофенольной уходящей группой.

Сайт-направленный мутагенез антитела А.17. Функциональный анализ антитела А.17 и его мутантов Основываясь на данных, полученных в результате структурного анализа, был проведен рациональный дизайн вариантов мутагенеза абзима с целью детализации особенностей его каталитического механизма.

Рис.8. (А) Наложение активных центров Fab A.17 (зеленый цвет) и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната Х (синий), иллюстрирующее изменения в положении аминокислотных остатков Tyr-L37, Trp-L92, Phe-L100 и петли CDR3 тяжелой цепи (His-H104, Asn-H105, Ala-H107 и Trp-H109). Остаток фосфоната показан красным. (Б) Кластер молекул воды в активном центре фосфонилированного Fab A.17. Молекула воды w614 образует прочную Н-связь с кислородом Р=О фосфонила. В свою очередь Tyr-H34 стабилизирует группу из 6 молекул воды, формирующих сеть Н-связей. Легкая цепь антитела показана серым цветом, тяжелая голубым, остаток фосфоната – зеленым. Водородные связи обозначены пунктирными линиями.

Было предложено провести замену на аланин аминокислотных остатков петли CDR3 тяжелой цепи His-H104 и Asn-H105, участвующего в формировании Н-связи с азотом тропинольного кольца в структуре модифицированного фосфонатом Fabфрагмента. В данном случае стабилизация обеспечивается формированием водородной связи между основной цепью 105-го остатка и азотом тропинольного кольца, тем не менее, замена боковой цепи этого и соседнего аминокислотных остатков может опосредованно повлиять на стабилизации за счет вторичных взаимодействий. Мутагенез 33 и тирозинов легкой цепи антитела с заменой на фенилаланин для одноцепочечного антитела был осуществлен ранее (Reshetnyak et al., J Am Chem Soc, 2007). Позиции для замены были определены аминокислотными остатками, модифицирующимися фосфонатом Х в реакционных клонах (Y-L33 – во всех клонах, кроме А.17, Y-L37 в клоне А.17), отобранных из библиотеки scFv. В настоящей работе эти мутантные варианты легких цепей А.17 были переклонированы в виде полноразмерных легких и тяжелых цепей для экспрессии в эукариотической системе.

Мутагенез аминокислотных остатков петли CDR3 тяжелой цепи осуществляли, используя в качестве матрицы последовательность одноцепочечного антитела А.17 в фагемиде pHEN2. Фрагменты ДНК, содержащие замены аминокислотных остатков, получали методом удлинения перекрывающихся ПЦР-продуктов. Далее вариабельные фрагменты мутантных легких и тяжелых цепей были переклонированы в виде полноразмерных легких и тяжелых цепей для экспрессии в эукариотической системе аналогично цепям дикого типа антитела А.17. Полученными генетическими конструкциями была проведена ко-трансфекция клеточной линии CHO-К1. Селекцию и отбор стабильно продуцирующих клонов трансфектом осуществляли аналогично описанной выше процедуре для трансфектом, продуцирующих антитело А.17 дикого типа. Для каждого клона были подобраны оптимальные условия экспрессии. Уровень продукции рекомбинантных антител в культуральных флаконах площадью 225 см2 для лучших клонов, экспрессирующих А.17Н-Н104А, составил 6 мг с литра бессывороточной среды Pro-CHO на 8 день экспрессии, для А.17N-H105A 2 мг/литра, для А.17D-H106A 0,6 мг/литра, для А.17Y-L33F и А.17Y-L37F 6 и 8 мг/литра соответственно. Для очистки целевых белков использовали протокол, разработанный ранее для полноразмерного антитела А.17 дикого типа. Выход целевого белка варьировался в пределах 60-70%, чистота препаратов мутантных полноразмерных антител составляла 95% (оценивали с использованием денатурирующего электрофореза в 12% ПААГ в восстанавливающих условиях с последующей окраской Кумассии синим R250).

Результаты Вестерн блот анализа взаимодействия мутантных антител с BtХ и ингибирования ковалентного мечения в присутствии ингибиторов демонстрируют сходный характер модификации с абзимом дикого типа (Рис.9). Замена тирозина 37 легкой цепи на фенилаланин приводит к полной потере способности каталитического антитела ковалентно модифицироваться фосфонатом Х и его биотинилированным аналогом (Рис.9, таблица 2). Анализ кинетики взаимодействия мутантных антител с фосфонатом по схеме Китца-Вилсона (таблица 2) показал, что в случае мутанта А.17Н-Н104А, эффективность модификации снизилась в два раза. При этом константа KДис практически не изменилась, т.е. замена боковой цепи 104 остатка практически не сказывается на стадии формирования обратимого комплекса антитела с субстратом. В то же время k2 снизилась почти в два раза. Следует отметить, что в немодифицированном активном центре боковая цепь His-H104 электростатически взаимодействует с боковой группой AspH106 (расстояние 3.2, мостик через молекулу воды). Из анализа структурных данных известно, что в нативном Fab петля H-CDR3 находится в разупорядоченном состоянии, т.е. указанное взаимодействие не фиксирует положение петли в целом. После модификации индольное кольцо гистидина разворачивается, разрывая контакт со 106 остатком.

В то же время возникает новое взаимодействие с Thr-H100, которое, наряду с заякориванием тропинольного кольца фосфоната основной цепью 105 остатка и стабилизацией фенильной группы за счет стэккинг-взаимодействий в гидрофобном кармане активного центра, вносит вклад в стабилизацию петли CDR3. Вероятно, невозможность формирований этой связи в случае замены боковой цепи His на короткую алифатическую группу затрудняет переход обратимого комплекса в ковалентный по сравнению с диким типом.

смеси 20 мкл. Прединкубация осуществлялась при 37оС. Время прединкубации составляло 1 час для всех ингибиторов, кроме экотиофата и параоксона. Для последних время прединкубации составляло Таблица 2. Кинетические параметры реакции A.17, его мутантов и BChE с фосфонатом Х (по схеме Китца-Вилсона).

полученные для BChE согласуются с ранее опубликованными (Tramontano A et al. Appl Biochem *Данные, Biotechnol. 2000).

Как отмечалось ранее, в стабилизации остатка фосфоната участвует основная цепь 105 аминокислотного остатка тяжелой цепи. При замене его боковой цепи на Ala KДис практически не изменилась, в то время как константа k2 возросла по сравнению с диким типом. Анализ структуры показал, что в немодифицированном активном центре боковая цепь Asp-H105 сетью водородных связей взаимодействует с реакционным TyrL37. Разрыв этого взаимодействия должен облегчить перестановки, необходимые для позиционирования субстрата в активном центре абзима и формирования ковалентного комплекса. В активном центре мутантного А.17N-H105A такая сеть контактов отсутствует. Кроме того, замена боковой цепи на метильную должна стерически облегчить перестройки, необходимые для формирования контакта основной цепи с тропинольным кольцом фосфоната.

Эффективность модификации А.17 фосфонатом Х на порядок выше таковой для BChE и сравнима с тем же параметром для других сериновых гидролаз. Этот факт весьма примечателен, учитывая примитивность устройства активного центра искусственного фермента в сравнении с каталитическим аппаратом сериновых гидролаз.

Анализируя данные структуры Fab A.17, можно предположить, что активный центр этого каталитического антитела должен обладать значительной степенью подвижности. Одним из подходов к изучению конформационных изменений при взаимодействии белковых молекул с лигандами различной природы является измерение термодинамических характеристик исследуемого взаимодействия методом изотермальной микрокалориметрии (метод ITC Isothermal Titration Calorimetry). Измерения производились В.Миткевичем в институте молекулярной биологии им. Энгельгарта РАН, Москва на приборе MicroCal iTC200 (MicroCal, Northampton, MA) как описано (Mitkevich et al. Nucleic Acids Res. 2006).

Нами была изучена термодинамика взаимодействия антитела А.17, двух его мутантов и BChE с фосфонатом Х. Реальная (для А.17 Y-L37F) и наблюдаемые (для всех прочих белков) KДис, а также стехиометрия взаимодействия и изменение энтальпии системы были установлены методом нелинейной регрессии. Экспериментальные данные наилучшим образом описываются моделью «один лиганд один лигандсвязывающий центр». Расчеты производились с учетом того, что за время проведения эксперимента фосфонилирование проходит количественно. Термодинамические параметры взаимодействия А.17 фосфонатом Х представлены в таблице 3.

Из приведенных данных видно, что реакция модификации антитела А.17 фосфонатом Х является термодинамически выгодной. Полученные значения термодинамических параметров сопоставимы с соответствующими значениями, полученными методом ITC для связывания других антител с гаптенами. Кроме того, порядок величин совпадает с кинетически рассчитанными значениями.

Таблица 3. Термодинамические параметры взаимодействия антитела А.17, его мутантов и BChE с фосфонатом Х, установленные методом ITC.

Все измерения производились три-четыре раза в буфере PBS, pH 7.4; bKДис – константа диссоциации для комплекса A.17Y-L37F с фосфонатом Х и кажущаяся KДис для комплекса других белков с фосфонатом;

H – изменение энтальпии; стандартное отклонение не превышало 15%; dTS – изменение энтропии;

рассчитано из уравнения G=H-TS; eG – изменение свободной энергии; рассчитано из уравнения G=RTlnKa.

Сравнение данных, полученных для полностью неактивного мутанта А.17YL37F, с результатами для антитела дикого типа и BChE, обнаруживает сходство термодинамических параметров взаимодействия названных белков с фосфонатом Х. В связи с этим можно предположить, что вклад ковалентной стадии взаимодействия, отсутствующей в случае А.17Y-L37F, в интегральную величину изменения энтальпии невысок.

Очень малое изменение энтальпии системы при фосфонилировании может объясняться тем, что энергия, необходимая для разрушения связи Р-ОАр, компенсируется энергией, высвобождающейся при образовании сходной по природе связи с остатком тирозина (серина 198 в случае BChE). При реакции модификации антитела А.17 фосфонатом вклад в изменение энергии системы так же вносят нековалентная стабилизация субстрата и энергия отхода уходящей группы. Последней составляющей можно пренебречь как незначительной, что было установлено в контрольных экспериментах измерения термодинамики связывания А.17 и его фосфонилированного фосфонатом Х производного с п-нитрофенолом. Таким образом, можно заключить, что наблюдаемые изменения термодинамических параметров системы относятся в основном к нековалентной стадии взаимодействия абзим-фосфонат и отражают конформационные изменения абзима при первичном связывании с молекулой фосфоната, поддерживая гипотезу использования антителом А.17 механизма индуцированного соответствия.

Снижение температуры измерения от 37 до 10оС приводит к уменьшению величины изменения энтальпии реакции модификации А.17 фосфонатом Х в три раза. На основании анализа температурной зависимости H было рассчитано изменение теплоемкости Cp, равное -70 кал*моль-1 K-1. По изменению теплоемкости можно рассчитать изменение площади белковой поверхности, доступной растворителю, используя эмпирическую формулу:

Cp = 0.27Aар + 0.4Aнеар, где Aар и Aнеар площади закрытых от растворителя гидрофобных и гидрофильных участков белковой молекулы, измеренные в 2.

дает с величиной, рассчитанной по кристаллической структуре (240 2).

В отличие от абзима дикого типа, изменение энтальпии при взаимодействии полностью неактивного мутанта А.17Y-L37F с фосфонатом Х не зависит от температуры.

Близкое к нулю значение Cp для реакции модификации мутантного абзима свидетельствует о несущественных изменениях площади поверхности антитела, доступной растворителю, что полностью согласуется с данными об отсутствии ковалентного взаимодействия А.17Y-L37F с фосфонатом Х.

Для мутанта А.17Н-Н104А наблюдаемая методом ITC KДис при взаимодействии с фосфонатом Х оказалась близкой по значению к той же величине для белка дикого типа (кинетические KДис также совпадают), однако, вклад Н отличается. В случае мутантного антитела реакция модификации более энтальпийно выгодная. Как отмечалось ранее, боковая цепь H-H104 стабилизирована связью с D-H106 в немодифицированном активном центре и с Т-Н100 в фосфонилированном А.17 посредством Н-связей. При замене гистидина на аланин энергетический вклад этих связей отсутствует, что приводит к наблюдаемому эффекту.

Взаимодействие антитела А.17 с пестицидом параоксон Как отмечалось ранее, модификация антитела А.17 фосфонатом Х ингибируется в присутствии параоксона. Изучение взаимодействия с параоксоном представляется интересным, поскольку он является распространенным пестицидом и существует проблема профилактики отравлений этим соединением.

Наличие п-нитрофенольной уходящей группы в молекуле субстрата позволяет оценить кинетику взаимодействия антитела с параоксоном спектрофотометрически.

Было показано, что скорость реакции линейно зависит от количества добавленного абзима (Рис. 10). Скорость реакция значительно ниже, чем в случае фосфоната Х. За время наблюдения (трое суток) не происходит выхода экспериментальной кривой на плато, и продукт образуется в количестве, превышающем число активных центров антитела, оттитрованных в реакции с фосфонатом Х. Кроме того, скорость реакции антитела А.17 с параоксоном линейно возрастает с увеличением концентрации добавленного гидроксиламина (Рис. 11). Гидроксиламин, обладая большей нуклеофильностью, конкурирует с водой на стадии дефосфорилирования. Приведенные факты свидетельствуют о том, что реакция А.17 с параоксоном является каталитической и проходит через стадию образования ковалетного интермедиата.

Рис.10. Кинетические кривые взаимодействия параоксона и фосфоната Х антителом А.17. (А) Различные концентрации антитела инкубировали с 200 мкМ параоксона. (Б) Одинаковая концентрация антитела инкубировалась с 200 мкМ параоксона или фосфоната Х. Все реакции проводили в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.4, содержащем 0,02% азида натрия, при 37оС. За ходом реакций следили спектрофотометрически по высвобождению п-нитрофенола. Каждая кривая построена за вычетом фонового распада субстрата в растворе того же состава, но без добавления антитела. Количество п-нитрофенола, образующегося при инкубации антитела А. с параоксоном, превышает число активных центров антитела, оттитрованных в реакции с фосфонатом Х.

Общую схему катализы для абзима можно представить следующим образом Aт-Tyr + OPX [Aт-Tyr * OPX] Aт-Tyr-OP + X- Aт-Tyr-ОН + OP-Nu, где Ат - антитело, ОРХ - фосфорорганическая молекула, Х - уходящая группа, Nu – нуклеофил.

Элементарные константы взаимодействия антитела А.17 с параоксоном приведены на Рис. 11. Таким образом, стадия дефосфорилирования является скоростьлимитирующей для всего процесса. Следовательно, ковалентный интермедиат должен накапливаться в процессе реакции. Присутствие ковалентного интермедиата, доказывающее, что гидролиз параоксона антителом А.17 проходит по механизму ковалентного катализа, было подтверждено методом масс-спектрометрии (Рис.12). После инкубации антитела с параоксоном в течение 16 часов на масс-спектре полноразмерного антитела появлялся пик, разница массы которого с массой пика немодифицированного абзима составляет 135Да, что соответствует весу остатка параоксона. Интересно отметить, что дефосфонилирование антитела, модифицированного фосфонатом Х, при инкубации с гидроксиламином в тех же условиях не происходит.

Рис.11. Определение кинетических констант гидролиза пестицида параоксон антителом А.17 в присутствии гидроксиламина.

Рис. 12. ESI-FTICR-MS масс-спектр полноразмерного антитела А.17, модифицированного параоксоном. Молекулярная масса первого пика соответствуют Так же не удалось реактивировать фосфонилированное фосфонатом антитело в присутствии классического реактиватора холин эстераз моноизонитрозоацетона (MINA).

Несмотря на свою химическую схожесть, эти два фосфоэфира обладают различной стабильностью Р-О связи, причем активный центр А.17 способствует гидролизу только Tyr-OP производного параоксона. Антитело, нацело модифицированное фосфонатом Х, и неактивный по отношению к фосфонату мутант А.17Y-L37F не взаимодействуют с параоксонам (Рис.13), указывая на участие в катализе гидролиза параоксона того же реакционного остатка, что и в случае фосфонилирования фосфонатом.

Таким образом, каталитическое антитело, полученное отбором по способности ковалентно связываться с одним фосфорорганическим веществом, фосфонатом Х, демонстрирует способность к каталитическому гидролизу другого, близкого к нему соединения, параоксона.

Детализация механизма катализа абзима А. Основываясь на данных структурного анализа и изучении термодинамики реакции, можно предположить, что каталитическое антитело А.17 преимущественно использует принцип индуцированного соответствия при взаимодействии с фосфонатом Х и другими фосфорорганическими веществами. В качестве альтернативной модели взаимодействия для большинства изученных каталитических антител доказан механизм выбора одного из предсуществующих конформеров. Современный взгляд на проблему описания механизма взаимодействия белок-лиганд сводится к тому, что для подавляющего большинства белков одновременно осуществляются обе модели, но с различными вкладами.

Для детализации каталитического механизма антитела А.17, наряду со стационарной, была изучена предстационарная кинетика его взаимодействия с фосфонатом Х.

Измерения проводились Н. Кузнецовым в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирской отделения РАН, Новосибирск на приборе SX.18MV (Applied Photophysics, Великобритания). Для детекции элементарных стадий взаимодействия абзима с субстратами использовали метод «остановленного потока». За реакцией следили по изменению внутренней флуоресценции триптофана в молекуле абзима при длинах волн ex280 нм и em330 нм. Количественную обработку результатов кинетических экспериментов осуществляли с помощью пакета программ DynaFit software (BioKin, США). Полученные данные представлены на рисунке 14.Во всех расчетах фосфонат Х рассматривался как полностью P(R) энантиомер.

Из представленных экспериментальных данных видно, что при взаимодействии антитело – фосфонат Х наблюдались значительные изменения внутренней флуоресценции абзима, которые могут быть оценены количественно как функция от времени (Рис.

14Б, В). Каждая экспериментальная кривая была независимо аппроксимирована к виду кривой с одной экспонентой для получения значения наблюдаемой константы скорости kнабл. Зависимость наблюдаемой константы скорости kнабл имела гиперболический вид и описывалась уравнением (1) соответствующим механизму индуцированного соответствия:

Aт + OPX (Aт•OPX)1 (Aт•OPX)2.

kнабл = k-2 + KДис*[ОРХ]*k2 / (KДис*[ОРХ]+1), где ОРХ-лиганд.

Рис.14. Описание механизма модификации антитела А.17 фосфонатом Х. А - экспериментальные и расчетные кривые взаимодействия А.17 и фосфоната Х. Качество выбранной модели оценивалось статистически (врезки). Б – эксперимантальная кривая изменения триптофановой флуоресценции антитела А.17 в зависимости от концентрации добавленного фосфоната Х, полученная в условиях предстационарной кинетики. В зависимость наблюдаемой константы взаимодействия А.17 с фосфонатом Х kobs от концентрации субстрата и элементарные константы взаимодействия.

Представленная схема включает стадии связывания субстрата и перестройку комплекса абзим/субстрат. Стадии образования ковалентного комплекса и отхода пнитрофенола по изменению флуоресценции триптофана разрешить не удалось. Для подтверждения правомерности выбранного механизма модель взаимодействия абзима с субстратом, представленная на схеме, была подвергнута статистической проверке, выявившей, что представленная модель действительно содержит минимально возможное число стадий, и представленные кинетические данные не могут быть описаны более простой схемой.

Таким образом, анализ предстационарной кинетики взаимодействия А.17 с фосфонатом Х наряду с данными структурного анализа и изучением термодинамики процесса указывает на реализацию антителом механизма индуцированного соответствия.

Тем не менее, полученные результаты не исключают возможности осуществления модификации абзима по альтернативному пути взаимодействия.

Пример каталитического антитела А.17 раскрывает альтернативный способ решения проблемы реорганизации белковой структуры для выполнения каталитической функции. В его структуре повышенная нуклеофильность остатка Y-L37 обеспечивается скрытым от растворителя положением в глубоком активном центре. Наличие длинной подвижной петли НCDR3 А.17 обеспечивает эффективные перестройки в полости активного центра в непосредственной близости от боковой цепи реакционного тирозина.

Неупорядоченная структура этой петли, образуя своего рода гибкую стену кармана активного центра, облегчает миграцию лиганда в нижнюю камеру.

Уникальные свойства примитивного активного центра антитела А.17, способного к катализу, являются моделью сочетания белковой динамики и реактивности. Сама по себе иммуноглобулиновая структура абзима накладывает строгие границы подвижности его структуры. Однако принцип получения искусственного фермента может быть приложен сходным образом к любой другой белковой матрице.

Полученные результаты могут быть использованы как основа для рационального дизайна с целью улучшения каталитической эффективности имеющейся активности А.17 или при получении новых биокатализаторов. Полученные данные могут иметь биотехнологическое значение.

На основе последовательностей вариабельных доменов одноцепочечного антитела А.17 создано и проэкспрессировано в клетках линии СНО-К1 полноразмерное антитело. Показано, что полученное полноразмерное антитело способно ковалентно связываться с п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонатом (Х) и гидролизовать пестицид параоксон.

Произведен структурный анализ Fab фрагмента каталитического антитела А.17 и его ковалентного аддукта с остатком фосфоната Х. Основываясь на структурных данных, был осуществлен мутагенез ряда аминокислотных остатков антитела с целью выявления их роли в каталитической активности абзима. Показано, что замены аминокислотных остатков, участвующих в стабилизации CDR-H3, влияют на скорость реакции фосфонилирования антитела фосфонатом Х и слабо сказываются на стадии связывания субстрата.

По совокупности данных структурного анализа, изучения термодинамики и быстрой кинетики показано, что взаимодействие А.17 с фосфонатом Х осуществляется по механизму индуцированного соответствия.

Установлено, что гидролиз пестицида параоксон антителом А.17 проходит через стадию образования фосфотирозинового ковалетного интермедиата с аминокислотным остатком Y-L37. Показано, что стадия дефосфорилирования является скорость-лимитирующей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1. Smirnov I*, Carletti E*, Kurkova I*, Nachon F, Nicolet Y, Mitkevich V, Dbat H, Avalle B, Belogurov A, Kuznetsov N, Reshetnyak A, Masson P, Tonevitsky A, Ponomarenko N, Makarov A, Friboulet A, Tramontano A, Gabibov A. Reactibodies generated by kinetic selection couple chemical reactivity with favorable protein dynamics. Proc Natl Acad Sci U S A. Опубликовано онлайн Сентябрь 2011.

*авторы внесли равный вклад в работу Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В., Дронина М.А., Казначеева А.В., Куркова И.Н., Белогуров А.А., Фрибуле A., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г., Бобик Т.В. Экспрессия каталитических антител в эукариотических системах. Молекулярная биология (Моск), том 45, № 1, Январь-Февраль 2011, С. 86-95.

3. Куркова И.Н., Решетняк А.В., Дурова О.М., Кнорре В.Д., Трамонтано А., Фрибуле А., Пономаренко Н.А., член-корр. РАН Габибов А.Г., Смирнов И.В.. Антитела-антидоты для нейтрализации фосфорорганических соединений.

Доклады Академии Наук, том 425, № 4, Апрель 2009, С. 549-552.

Опубликованные материалы конференций и доклады 1. Kurkova I, Carletti E, Smirnov I, Fribulet A, Tramontano A, Gabibov A. A17 catalytic antibody converting P-O bonds. III International meeting "Early events in human patologies" 29 May-1 June 2010, Barbizone, France 2. Smirnov IV, Kurkova IN, Carletti E, Masson P, Belogurov AA Jr, Ponomarenko NA, Tramontano A, Friboulet A, Gabibov AG. Promiscuity of binding/catalysis of antibodies antidotes toward chemical weapons. 35th FEBS Congress June 26–July 1, 2010, Gteborg, 3. Smirnov I.V., Ilushin D.G., Durova O.M., Kurkova I.N., Masson P., Ponomarenko N.A.

and Gabibov A.G. Biological scavengers of organophosphorous poisons. 21st IUBMB and 12th FAOBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, July 30August 7, 2009, Shanghai, China.

Методические аспекты работы рассмотрены в статьях 1. Belogurov AA, Kurkova IN, Friboulet A, Thomas D, Misikov VK, Zakharova MY, Suchkov SV, Kotov SV, Alehin AI,.Avalle B, Morse HC 3d, Gabibov AG, Ponomarenko NA Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies:

novel biomarker for multiple sclerosis. J Immol. 2008 Jan 15;180(2):1258-67.

2. Белогуров AA, Куркова ИН, Мисиков ВК, Сучков СВ, Телегин ГБ, Алехин АИ, Доклады Академии Наук, том 425, № 2, Март 2009, С. 251-255.

3. Ponomarenko NA, Durova OM, Vorobiev II, Belogurov AA, Kurkova IN, Petrenko AG, Telegin GB, Suchkov SV, Kiselev SL, Lagarkova MA, Govorun VM, Serebryakova MV,.Avalle B,.Tornatore P,.Karavanov A, Morse HC 3d, Thomas D, Friboulet A, Gabibov AG. Autoantibodies to myelin basic protein catalyze site-specific degradation of their antigen. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Jan 10;103(2):281-6.





Похожие работы:

«ЩАПОВА Елена Владимировна ВСЕРОССИЙСКОЕ ХОРОВОЕ ОБЩЕСТВО В ИСТОРИИ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ МУЗЫКАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ XX СТОЛЕТИЯ ВТОРОЙ ПОЛОВИНЫ Специальность 17.00.02 – Музыкальное искусство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Ростов-на-Дону – 2013 2 Работа выполнена на кафедре хорового дирижирования Академии хорового искусства имени В.С. Попова Научный руководитель : доктор искусствоведения, профессор Ефимова Наталья Ильинична Официальные...»

«Яблоков Александр Сергеевич ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАБОТЫ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ УСТАНОВОК ПЛАВУЧИХ КРАНОВ ЗА СЧЕТ ПРИМЕНЕНИЯ ГИДРОТРАНСФОРМАТОРОВ В МЕХАНИЗМЕ ПОДЪЕМА Специальность 05.08.05 – Судовые энергетические установки и их элементы (главные и вспомогательные) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Нижний Новгород – 2011 Работа выполнена в Федеральном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волжская...»

«ШУПЛЕЦОВА Юлия Александровна ФРАЗЕОЛОГИЧЕСКИЕ ЕДИНИЦЫ В ПЕСЕННОМ ФОЛЬКЛОРЕ КУРГАНСКОЙ ОБЛАСТИ: СТРУКТУРНО-СЕМАНТИЧЕСКИЙ И ЛИНГВОКУЛЬТУРОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТЫ Специальность 10.02.01 – Русский язык АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Челябинск – 2008 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Челябинский государственный педагогический университет Научный руководитель : доктор...»

«ПАЩЕНКОВ МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ НА ОСНОВЕ МУРАМИЛПЕПТИДОВ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК: ОТ ЭКСПЕРИМЕНТА К КЛИНИКЕ 03.03.03 – Иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва, 2013 г. Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Государственный научный центр Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства Научный консультант : Доктор медицинских наук, профессор Пинегин Борис...»

«ГАВРИКОВ АЛЕКСЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного назначения 03.00.23. – биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2006 год 2 Работа выполнена в производственной лаборатории Закрытого Акционерного Общества Мосагроген (ЗАО Мосагроген). Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор...»

«Баззаев Александр Казбекович Локально-одномерные разностные схемы для уравнения диффузии дробного порядка с краевыми условиями третьего рода Специальность 01.01.07 вычислительная математика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва2013 Работа выполнена на кафедре прикладной математики математического факультета...»

«ЦЫРО Светлана Геннадьевна РЕГИОНАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВЗВЕШЕННЫХ ЧАСТИЦ В ЕВРОПЕ Специальность 25.00.30 – метеорология, климатология, агрометеорология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Санкт-Петербург 2008 Работа выполнена в Главной геофизической обсерватории им. А. И. Воейкова Научный руководитель : кандидат физико-математических...»

«УДК 523.44 Нароенков Сергей Александрович Исследование комплексов малых тел Солнечной системы, сближающихся с планетами Земной группы 01.03.01 – Астрометрия и небесная механика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Санкт-Петербург – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте астрономии РАН Научный руководитель...»

«ШЕРЕМЕТОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА ПЕДАГОГИЧЕСКАЯ ПОДДЕРЖКА УСПЕШНОСТИ В ОБУЧЕНИИ РУССКОМУ ЯЗЫКУ МЛАДШИХ ШКОЛЬНИКОВ 13.00.02 – теория и методика обучения и воспитания (русский язык, уровень начального образования) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Челябинск – 2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Шадринский государственный педагогический институт Научный руководитель доктор педагогических наук, профессор Качалова Людмила Павловна...»

«ДЖИОЕВА ЦИАЛА ГЕОРГИЕВНА ФОРМИРОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ МЕЖНАЦИОНАЛЬНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ У СТУДЕНТОВ ВУЗА (на примере Республики Южная Осетия) Специальность: 13.00.01 – общая педагогика, история педагогики и образования АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Владикавказ 2009 Работа выполнена в ГОУ ВПО Юго-Осетинский государственный университет им А.А.Тибилова Научный руководитель : доктор педагогических наук Джагаева Татьяна Ерастовна...»

«Косова Вера Алексеевна Системная значимость словообразовательных категорий в русском языке Специальность 10.02.01 – русский язык АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора филологических наук Казань – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный консультант – доктор филологических наук, профессор Балалыкина Эмилия...»

«Андреев Олег Олегович Логико-языковые средства описания моделей логического разграничения доступа Специальность 05.13.19 — методы и системы защиты информации, информационная безопасность Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре вычислительной математики Механико-математического факультета и в...»

«УДК 628.953.2 Середа Олеся Васильевна ОДНОМОДОВЫЕ СВЕТОВОДЫ ИЗ КРИСТАЛЛОВ ГАЛОГЕНИДОВ СЕРЕБРА ДЛЯ СРЕДНЕГО ИНФРАКРАСНОГО ДИАПАЗОНА 01.04.21 Лазерная физика АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель к.ф.-м.н. Бутвина Л.Н. Москва. 2008г. Работа выполнена в...»

«СВИСТУНОВА ЛЮДМИЛА ЮРЬЕВНА ПАРЛАМЕНТСКИЕ СЛУШАНИЯ КАК ОРГАНИЗАЦИОННО-ПРАВОВАЯ ФОРМА ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЗАКОНОДАТЕЛЬНОГО (ПРЕДСТАВИТЕЛЬНОГО) ОРГАНА ГОСУДАРСТВЕННОЙ ВЛАСТИ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 12.00.02 — конституционное право; конституционный судебный процесс; муниципальное право АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук САРАТОВ - 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего...»

«Луховицкий Лев Всеволодович ОСНОВНОЕ БОГОСЛОВСКО-ПОЛЕМИЧЕСКОЕ СОЧИНЕНИЕ ПАТРИАРХА НИКИФОРА КОНСТАНТИНОПОЛЬСКОГО APOLOGETICUS ATQUE ANTIRRHETICI: ОПЫТ КОМПЛЕКСНОГО ИСТОРИКО-ФИЛОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Специальность 10.02.14 – классическая филология. Византийская и новогреческая филология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре византийской и новогреческой филологии филологического факультета...»

«Нефедова Евгения Викторовна УЧАСТИЕ РОССИИ В ИНИЦИАТИВЕ СЕВЕРНОЕ ИЗМЕРЕНИЕ В КОНТЕКСТЕ ОТНОШЕНИЙ СО СТРАНАМИ СЕВЕРНОЙ ЕВРОПЫ (1997-2006 ГГ.) 07.00.02 – Отечественная история АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата исторических наук Томск – 2009 Работа выполнена на кафедре отечественной истории ГОУ ВПО Томский государственный университет Научный руководитель : доктор исторических наук, профессор Зиновьев Василий Павлович Официальные оппоненты : доктор...»

«ШАМБОРСКИЙ Виктор Николаевич РАЦИОНАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ, АЛГОРИТМЫ ДИАГНОСТИКИ И АНАЛИЗА ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ОДОНТОГЕННОГО ОСТЕОМИЕЛИТА ЧЕЛЮСТЕЙ Специальность: 03.01.09 - Математическая биология, биоинформатика (медицинские наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Курск - 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Юго-Западный государственный университет на кафедре биомедицинской инженерии Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор...»

«УДК 537.312.6 КАТАЕВА Елена Алексеевна МЕХАНИЗМЫ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА И СТРУКТУРА МЕТАЛЛУГЛЕРОДНЫХ НАНОКОМПОЗИТОВ, СОДЕРЖАЩИХ W, Cr и Nb 01.04.07 – Физика конденсированного состояния АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва, 2011 Работа выполнена в Институте общей физики им. А.М.Прохорова РАН Научный руководитель : кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатория низких температур ИОФАН РАН,...»

«МАКСИМОВА МАРИЯ ВИКТОРОВНА КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ И ЛЕЧЕНИЕ БОЛЬНЫХ СЕРОРЕЗИСТЕНТНЫМ СИФИЛИСОМ 14.00.11 – кожные и венерические болезни 14.00.36 – аллергология и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2007 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и...»

«ЗАИКА ВАЛЕНТИН ВИКТОРОВИЧ ФАУНА И НАСЕЛЕНИЕ АМФИБИОНТНЫХ НАСЕКОМЫХ (INSECTA ECTOGNATHA: EPHEMEROPTERA, PLECOPTERA, TRICHOPTERA, ODONATA) ВОДНЫХ ПОТОКОВ АЛТАЕ-САЯНСКОЙ ГОРНОЙ ОБЛАСТИ 03.02.04 — зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Томск-2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тувинском институте комплексного освоения природных ресурсов Сибирского отделения РАН (Кызыл) Официальные...»






 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.