На правах рукописи

ШАМОВА

Ольга Валерьевна

МОЛЕКУЛЯРНО - КЛЕТОЧНЫЕ ОСНОВЫ РЕАЛИЗАЦИИ

БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ

ЛЕЙКОЦИТОВ

14.03.03 – патологическая физиология

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2013 2

Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук Научные консультанты:

академик РАМН Корнева Елена Андреевна доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, руководитель лаборатории биогеронтологии Кветная Татьяна Викторовна Доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, профессор кафедры патофизиологии Шестакова Светлана Алексеевна Доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет", профессор кафедры биохимии Кулева Надежда Владимировна

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Северо-Западный Государственный медицинский университет имени И.И.

Мечникова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится «» 2013 г. в _ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научноисследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан « _ » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Дыбан П.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование молекулярных механизмов реализации функций системы врожденного иммунитета, привлекает все больший интерес, поскольку эта система не только обеспечивает немедленный ответ организма на вторжение патогенных микроорганизмов, но и участвует во многих других жизненно важных физиологических процессах, направленных на адаптацию организма при различных неблагоприятных воздействиях [Пигаревский, 1978; Маянский А., Маянский Д., 1989; Корнева, 2003;

Кокряков, 1999; Черешнев, Черешнева, 2011; Кlebanoff, Clark, 1978; Lehrer et al,1988 Lehrer, Lu, 2012; Hancock et al., 2012]. Одними из ключевых эффекторных молекул системы врожденного иммунитета являются катионные пептиды, содержащиеся преимущественно в лизосомоподобных гранулах нейтрофилов. Эти пептиды были открыты как соединения, обладающие выраженной антимикробной активностью [Lehrer et al., 1988; Zaslof et al., 1985;

Boman et al., 1990], поэтому за ними закрепилось название «антимикробные пептиды»

(АМП). Позднее было показано, что некоторые АМП нейтрофилов обладают более широким спектром биологической активности: стимулируют хемотаксис макрофагов, нейтрофилов, незрелых дендритных клеток [Huang et al., 1997; Biragyn et al., 2001]; дегрануляцию тучных клеток [Territo et al., 1988], увеличивают проницаемость сосудов и стимулируют их рост [Li et al., 2000]; влияют на функциональную активность и метаболизм тромбоцитов [Tkachenko et al., 1994; 1996] связывают бактериальный липополисахарид [Hancock et al., 1999]; влияют на процессинг IL-1 [Perregaux et al, 2002], ингибируют индуцированный АКТГ стероидогенез в клетках коркового слоя надпочечников, а также индуцированный -меланоцитстимулирующим гормоном синтез альдостерона клетками надпочечников [Zhu et al., 1988;

1991], что дало основание рассматривать эти пептиды как возможные регуляторные молекулы, участвующие в механизмах взаимодействия систем врожденного и приобретенного иммунитета [Yang et al., 2004; Кокряков, 1999; 2006], а также иммунной и нейроэндокринной систем [Bateman et al., 1993].

АМП могут рассматриваться и как перспективная основа для создания новых антибиотических и иммуномодулирующих лекарственных препаратов, а детальное изучение биологических свойств различных представителей этого структурного класса пептидов является актуальным направлением исследований в экспериментальной медицине.

В связи с этим, представляет интерес также поиск и характеристика новых АМП лейкоцитов животных, и исследование эффектов этих пептидов на микроорганизмы, в том числе, устойчивые к традиционно используемым антибиотикам микробного происхождения;

а также на нормальные и опухолевые клетки человека и млекопитающих, что позволяет выявлять ранее неизвестные структуры пептидов, обладающих свойствами, перспективными при разработке новых лекарственных средств.

Нейтрофильные гранулоциты являются доминирующей фракцией циркулирующих в крови лейкоцитов у человека и ряда млекопитающих, а при различных формах патологии (инфекционном процессе, дистрессе и других) происходит высвобождение содержимого их лизосомоподобных гранул во внеклеточное пространство, в том числе, АМП (причем концентрация этих веществ в крови повышается на один-два порядка). Однако, большинство исследований АМП нейтрофилов направлено на изучение их антимикробного действия, а действие их на собственные клетки организма остается малоизученным.

Необходимо отметить, что характер действия АМП на эукариотические клетки во многом зависит от концентраций этих веществ в среде. В концентрациях, в несколько раз больших, чем необходимые для проявления антимикробных эффектов, многие АМП оказывают токсическое действие в отношении собственных клеток организма; как нормальных, так и трансформированных. Уже в конце 80-х годов появились работы, посвященные изучению действия пептидов из семейства дефенсинов на клетки макроорганизма, причем основное внимание было сосредоточено на исследовании их цитотоксической активности в отношении опухолевых клеток в культуре [Lichtenstein et al., 1988, 1991]. Хотя в литературе широко обсуждается возможность создания противоопухолевых агентов на основе АМП [Lizzi et al., 2009; Mader, Hoskin, 2006], имеются лишь немногочисленные и достаточно противоречивые работы по исследованию механизмов цитотоксического действия этих пептидов на опухолевые клетки и выявлению мишеней их действия.

С другой стороны, интерес представляет изучение факторов, ограничивающих повреждающее действие АМП в случаях, когда их концентрация в крови или тканях становится критически высокой. Для дефенсинов человека было показано [Panyutich et al., 1995], что эти пептиды избирательно связываются с белками из семейства ингибиторов сериновых протеиназ (серпинов), а также с некоторыми другими ингибиторами протеиназ, например, альфа2-макроглобулином; причем в результате такого связывания не только отменяются цитотоксические эффекты дефенсинов, но и снижается ингибирующее действие белков в отношении протеиназ. Информация о подобных взаимодействиях АМП, отличных по структуре от дефенсинов, с серпинами практически отсутствует. Исследование в этом направлении актуально не только для понимания механизмов защиты собственных клеток организма от повреждающего действия АМП, но и для анализа возможности участия АМП в регуляции биологической активности белков из семейства серпинов, которые выполняют в организме разнообразные функции, инициируя образование, модификацию и деградацию белков, участвующих в важнейших биохимических каскадах реакций, а также служат переносчиками разнообразных молекул, в том числе гормонов; и, таким образом, связывание с АМП может играть значимую роль в регуляции этих функций.

Циркулирующие в кровяном русле или присутствующие в различных тканях нейтрофилы находятся в окружении других клеток системы врожденного и приобретенного иммунитета, в частности, тех, которые на настоящий момент рассматриваются как основные участники противоопухолевой защиты организма – естественные киллерные клетки и цитотоксические Т-лимфоциты. Осуществляя свои защитные функции, они могут оказаться в непосредственном контакте с биологически активными молекулами, секретируемыми нейтрофилами. Возникает вопрос, могут ли АМП нейтрофилов модулировать активность этих клеток, однако работы в этом направлении практически отсутствуют. Поэтому важной задачей является изучение как прямого цитотоксического действия АМП, так и выяснение воможности их взаимодействия с другими эффекторными звеньями системы врожденного и приобретенного иммунитета.

В последние годы получило развитие одно из актуальных направлений биологии и медицины - изучение пептидов, проникающих в эукариотические клетки (Cell-penetrating peptides). В связи с этим представляют интерес данные о свойстве ряда АМП в низких нецитотоксических концентрациях, проникать через клеточные мембраны, не повреждая клетки, и накапливаться в их цитоплазме [Takeshima et al., 2003; Tomasinsig, et al., 2006].

Пока информация о таких эффектах АМП ограничивается немногочисленными работами.

Однако подобное свойство АМП представляется исключительно важным, так как, попадая в цитоплазму клетки, пептиды могут влиять на разнообразные внутриклеточные процессы, обеспечивающие ее жизнедеятельность. Изучение интернализации пептидных молекул во внутриклеточное пространство имеет и практическое значение, так как эти пептиды могут рассматриваться, как возможные прототипы для создания молекул-переносчиков различных лекарственных средств через мембраны опухолевых клеток.

Кортикостатическое действие АМП определяется их свойством связываться с рецепторами к АКТГ на клетках надпочечников в культуре, выступая в роли конкурентных ингибиторов этих гормонов и блокируя АКТГ-индуцированный синтез кортикостероидов [Zhu et al., 1992], а также стимулированный -меланоцитстимулирующим гормоном (-МСГ) синтез альдостерона [Solomon, 1993]. Интересно что кортикостатические эффекты дефесинов наблюдались и на моделях in vivo [Шамова и др, 1993; 1995]. При этом, известно, что рецепторы к производным проопиомеланокортина (АКТГ, -МСГ и другим) имеются и на лейкоцитах (моноцитах, макрофагах, нейтрофилах, лимфоцитах, тучных клетках). Известно также, что -МСГ проявляет спектр эффектов в отношении клеток системы врожденного, а также приобретенного иммунитета: ингибирует фагоцитоз и секрецию хемокинов макрофагами и нейтрофилами; подавляет миграцию нейтрофилов и макрофагов в очаг воспаления;

ингибирует продукцию провоспалительных цитокинов моноцитами и макрофагами, усиливает продукцию факторов, подавляющих воспаление; то есть обладает противовоспалительным действием. В связи с этим представляется важным выяснить, способны ли АМП модулировать эффекты -МСГ, обусловливающие его противовоспалительное действие.

Работа в этом направлении позволит сформировать представления об участии антимикробных пептидов нейтрофильных гранулоцитов, как в процессах взаимодействия систем врожденного и приобретенного иммунитета, так и в процессах нейроиммуномодуляции.

В гранулах нейтрофилов каждого из изученных видов млекопитающих содержится спектр катионных пептидов, имеющих различную структуру и разную степень антибиотической и других форм биологической активности. Например, из шести дефенсинов кролика два пептида NP-1 и NP-2 имеют выраженные антибиотические эффекты, в то время как два других, NP-3a и NP-3b демонстрируют кортикостатическую активность, а NP-4 и имеют низкую антимикробную и кортикостатическую активности. Таким образом, можно предположить, что разнообразие АМП в нейтрофильных гранулоцитах обусловлено тем, что различные АМП выполняют разные функции, и каждое вещество играет определенную роль в развитии конкретных патологических процессов - некоторые участвуют в прямой инактивации микроорганизмов, в то время как другие обладают свойствами биомодуляторов, влияя на активность эффекторных молекул различных систем организма.

Целью работы являлись поиск и характеристика новых антимикробных пептидов лейкоцитов животных и изучение молекулярно-клеточных основ реализации биологической активности пептидов (бактенецинов, аципенсинов, протегрина, дефенсинов) в защитных реакциях, развивающихся при различных патологических процессах (инфекционном процессе, воспалении, опухолевом росте).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Осуществить поиск, выделение, очистку и анализ физико-химических свойств новых антимикробных пептидов (АМП) из клеток крови животных: рыб (осетра, севрюги), млекопитающих (домашней козы); изучить антимикробное действие этих пептидов.

2. Оценить цитотоксическое действие различных по структуре и механизмам антимикробного действия АМП (протегрина 1, бактенецинов, аципенсинов) на опухолевые и нормальные клетки в культуре. Исследовать эффекты действия пептидов протегрина и бактенецина на цитотоксическую активность естественных киллерных клеток в отношении опухолевых клеток в культуре.

3. Исследовать механизмы действия АМП на культивируемые клетки: изучить динамику цитотоксического действия; исследовать возможность участия антимикробных пептидов в инициации процесса апоптоза клеток; изучить процесс транслокации пептидов (протегрина, бактенецина), несущих флуоресцентную метку, в опухолевые клетки; оценить зависимость этого процеса от температуры и энергетического обмена клеток-мишеней, а также роль эндоцитоза в этом процессе.

4. Изучить влияние факторов, ограничивающих цитотоксическое действие пептидов, в частности, исследовать взаимодействие АМП с белками-серпинами и возможность модулирования в результате такого взаимодействия биологической активности пептидов, с одной стороны, и функциональной активности серпинов, с другой.

5. Изучить эффекты АМП, имеющих низкую токсичность для эукариотических клеток, на пролиферативную активность фибробластов кожи человека и скорость заживления кожных ран у экспериментальных животных.

6. Провести исследование влияния дефенсинов на эффекты -меланоцитстимулирующего гормона (-МСГ), обусловливающие его противовоспалительное действие: изучить влияние пептидов на опосредованное -МСГ ингибирование фагоцитоза и секрецию интелейкина 1 нейтрофилами, а также на способность -МСГ подавлять миграцию нейтрофилов в очаг воспаления на модели экспериментального асептичекого воспаления у мышей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Открыты и охарактеризованы по физико-химическим и функциональным свойствам новые антимикробные пептиды системы врожденного иммунитета животных: бактенецины ChBac5, ChBac3.4, mini-ChBac7.5N, mini-ChBac7.5N из лейкоцитов козы; аципенсины из лейкоцитов русского осетра (Ас 1, Ас 2, Ас 3, Ас 4, Ас 5, Ас 6) и севрюги (Ас 2 и Ас 3).

2. Открытые антимикробные пептиды (бактенецины, аципенсины) и протегрин проявляют высокую антимикробную активность, в том числе и в отношении антибиотикоустойчивых штаммов. Антибактериальная активность бактенецинов повышается при их совместном применении с другими антибиотическими агентами (рифампицином, наночастицами серебра). Антимикробное действие бактенецинов и аципенсинов реализуется без существенного нарушения барьерной функции цитоплазматической мембраны Е.coli MLp; пептид ChBac3.4, отличающийся повышенной гидрофобностью молекулы, оказывает более выраженное повреждающее действие на цитоплазматическую мембрану E.coli.

3. Исследуемые в работе антимикробные пептиды проявляют ЛПС-связывающую активность.

4. Пептиды протегрин 1, бактенецин ChВас3.4 (но не ChBac5, mini-ChBac7.5N, miniChBac7.5N, аципенсины), в концентрациях, превышающих антимикробные, токсичны для клеток млекопитающих - опухолевых и некоторых типов нормальных клеток. Механизм токсического действия мембраноактивного пептида протегрина 1 не связан с инициацией процесса апоптоза в клетках. Токсическое действие бактенецина ChBac3.4, имевшего менее выраженное действие на мембраны бактерий, зависит от концентрации пептида: клеточная гибель при низких концентрациях сопровождается преимущественной инициацией апоптоза, а при высоких – некроза. АМП могут проявлять и опосредованное противоопухолевое действие, усиливая активность естественных киллерных клеток.

5. Протегрин 1 и бактенецин ChBac5 в нетоксических концентрациях проникают в эукариотические клетки, не повреждая их мембран, что подтверждает возможность модулирования ими внутриклеточных процессов, а также позволяет рассматривать перспективы их использования в качестве молекул-переносчиков, служащих для доставки лекарственных препаратов в клетки.

6. Дефенсины, протегрин взаимодействуют с белками из семейства серпинов (1антитрипсином, транскортином) и модулируют функциональную активность этих белков, что позволяет предположить значимую роль этих АМП в регуляции активности серпинов при развитии патологических процессов (воспаление, инфекция, дистресс), когда концентрация АМП в плазме крови высока.

7. Пептиды бактенецины стимулируют пролиферацию эукариотических клеток, ускоряют заживление ран, оцениваемое по скорости снижения площади раневой поверхности у экспериментальных животных.

8. В низких концентрациях АМП (дефенсины) модулируют некоторые эффекты меланокортинов, в частности, -МСГ, что позволяет предположить определенную роль этих пептидов во взаимодействии иммунной и нейроэндокринной систем при инфекционном процессе и стрессе.

9. Исследованные АМП проявляют спектр различных видов биологической активности и являются перспективными кандидатами для создания на их основе лекарственных препаратов для коррекции некоторых форм патологии, связанных с развитием воспалительных процессов, иммунодефицитов и опухолевого роста.

Научная новизна Получены приоритетные данные о новых антимикробных пептидах из лейкоцитов домашней козы и двух видов осетровых рыб: изучена антимикробная активность бактенецинов козы (ChBac3.4, ChBac5, mini-ChBac7.5 и mini-ChBac7.5) и аципенсинов осетровых рыб (Ас1, Ас2, Ас6), в том числе в отношении антибиотикоустойчивых клинических изолятов; впервые выявлены синергические эффекты антимикробного действия исследуемых бактенецинов при их совместном применении с наночастицами серебра.

Получены новые данные об эффектах действия антимикробных пептидов нейтрофильных гранулоцитов на различные эукариотические клетки: нормальные и опухолевые клетки человека и животных. Впервые описан обогащенный пролином пептид из семейства бактенецинов - ChBac3.4, обладающий, наряду с антимикробным, и цитотоксическим действием в отношении опухолевых клеток, и исследован механизм его действия. Получены новые данные о механизме цитотоксических эффектов протегрина 1 (PG1). Изучены особенности процесса проникновения PG1 и бактенецина ChBac5 в эукариотические клетки.

Впервые показано, что пептиды протегрин и бактенецин ChBac5 стимулируют цитотоксическую активность спленоцитов в отношении опухолевых клеток.

Получена новая информация о взаимодействии различных АМП с белками-серпинами.

Впервые получены данные свидетельствующие о способности бактенецинов ChBac5 и mini-ChBac7.5 из лейкоцитов козы стимулировать пролиферацию фибробластов кожи человека; впервые показано свойство ChBac5 ускорять процесс заживления ран у экспериментальных животных.

Впервые исследовано свойство дефенсинов влиять на ряд эффектов -меланоцитстимулирующего гормона, обусловливающих его противовоспалительное действие.

Теоретическое и практическое значение Изучение антимикробных пептидов системы врожденного иммунитета, как многофункциональных молекул, участвующих в реализации защитных реакций при развитии различных патологических процессов, позволяет расшифровать ряд ранее неизвестных молекулярных механизмов функционирования эффекторных звеньев врожденного иммунитета. Анализ антимикробной активности пептидов in vitro позволяет понять молекулярные механизмы реализации их функциональной активности в фаголизосомах фагоцитирующих клеток и на поверхности слизистых и кожных покровов. Результаты исследования цитотоксической активности пептидов открывают возможности для оценки их противоопухолевого действия. Эффекты действия АМП на процесс заживления кожных ран демонстрируют роль изученных пептидов в развитии репаративных процессов.

Известно, что резистентность патогенных микроорганизмов к традиционно используемым антибиотикам стремительно растет, появляется необходимость создания новых противомикробных и иммуностимулирующих лекарственных препаратов. Одними из кандидатов на роль подобных препаратов являются антимикробные пептиды животного происхождения. Данная работа предоставляет информацию о различных видах функциональной активности антимикробных пептидов, что позволяет оценить как положительные, так и возможные негативные эффекты применения АМП при различных формах патологии. Демонстрация антимикробной, противоопухолевой и других вариантов биологической активности новых АМП, полученных из лейкоцитов животных, в частности, бактенецинов из лейкоцитов козы, позволяет рассматривать их, как кандидатные молекулы для разработки антимикробных, противоопухолевых или иммуномодулирующих лекарственных препаратов нового поколения.

Проведенные исследования являют собой шаги на пути разработки новых антибиотических лекарственных препаратов, активных в отношении антибиотикоустойчивых штаммов бактерий, в том числе и новых препаратов с антимикробным и ранозаживляющим действием.

Личный вклад в проведенные исследования Личный вклад автора в выполненную работу включает самостоятельное планирование и проведение экспериментальных исследований, анализ полученных данных и их теоретическое обобщение. Написание статей осуществлялось либо самим автором, либо при активном его участии. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Данные, составляющие основное содержание работы и касающиеся выделения, очистки, характеристики биологической активности пептидов, получены автором лично.

Первичные структуры полученных новых антимикробных пептидов определяли в совместных исследованиях с лабораториями профессора Р. Лерера (Prof. Robert Lehrer, Калифорнийский университет Лос-Анжелеса, США); д.х.н., профессора Т.В. Овчинниковой (Институт Биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН);

профессора Р. Хоффманна (Prof. Ralf Hoffmann, Университет г. Лейпцига, ФРГ).

Математическое моделирование структур ChBac3.4 и ChBac5 выполнено И.А.Елисеевым на оборудовании Лаборатории прикладной математики и механики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

Апробация диссертации состоялась 21.02.2011 г. на заседании научной конференции Отдела общей патологии и патологической физиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН (г. Санкт-Петербург).

Основные положения диссертации были представлены на Гордоновских научных конференциях «Антимикробные пептиды», проводимых 15-20 мая 2011 г. (г. Барга, Италия), 29 апреля - 4 мая 2007 г. (г. Барга, Италия), 27 апреля - 2 мая 2003 г. (г. Барга, Италия), 18- марта 2001 г. (г. Вентура, США), 25-30 апреля 1999 г. (г. Барга, Италия), 2-7 марта 1997 г. (г.

Вентура, США); на I, II и III международных симпозиумах “Interaction of the nervous and immune systems in health and disease”, проводимых 31 мая –2 июня, 2007 г., 16-19 июня г. и 7-10 июня 2011 г., в г. Санкт-Петербурге; на Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии “X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова” 14–17 ноября г. (Москва-Пущино); на конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов», посвященной 85-летию со дня рождения академика И.П. Ашмарина, 15 сентября (Москва, 2010 г.); международной научной конференции по биоорганическй химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвящённой 75 летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 28 сентября–2 октября 2009г.); Семинаре-Презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология – 2003» 24-25 ноября 2003 г., Пущино; конференции, посвященной памяти П.М. Альбицкого «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов", 9-10 октября 2003 г.; III съезде Биохимического общества, Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002; Х конференции «Нейроиммунология», СПб, 28-31 мая, 2001 г.; конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», 18-20 декабря, 2000 г., Санкт-Петербург.

По теме работы опубликовано 42 печатных работы, в том числе 24 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Благодарности: профессору, д.х.н. Т.В. Овчинниковой (Институт Биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН за определение первичной структуры аципенсинов и минибактенецинов; ЦКП «Аналитическая спектрометрия» за предоставленную воможность использования оборудования Центра, ЦКП «Материаловедение и диагностика в переовых технологиях» (Санкт-Петербург), где выполнялась проточная цитометрия, и сотрудникам Института Цитологии РАН В.В.Зенину за помощь в проведении экспериментов с использованием проточной цитометрии и анализа полученных данных, Г.А. Сакуте и Г.И. Штейну за консультативную помощь; сотрудникам ГосНИИ ОЧБ Н.И. Колодкину за синтез пепидов и Г.В. Александрову за консультативную помощь, сотруднику РНИИТО им Р.Р. Вредена Г.Е. Афиногенову и сотруднику ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН Е.И.Ермоленко за предоставленные штаммы микроорганизмов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 343 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, их обсуждения, общего заключения и выводов. В диссертации 14 таблиц и 69 рисунков. Прилагаемый список литературы содержит 475 наименований, в том числе 50 отечественных и 425 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Антимикробные пептиды. В работе использовали природные пептиды, выделенные из лейкоцитов животных (бактенецины козы, аципенсины осетра и севрюги, дефенсины человека и кролика), а также их химически синтезированные аналоги. Химически синтезированный протегрин 1 (PG1) был любезно предоставлен профессором Р.Лерером (Калифорнийский университет Лос-Анджелеса, США). Синтез бактенецинов ChBac3.4, miniBac7.5N, ChBac5 был выполнен сотрудником ГосНИИ ОЧБ Н.И.Колодкиным.

Химически синтезированные miniBac7.5N и аципенсин 6 синтезированы в лаборатории профессора Р. Хоффмана (Университет г. Лейпцига, ФРГ).

Выделение и очистку дефенсинов человека из лейкоцитов крови здоровых доноров выполняли с использованием препаративной процедуры, описанной в статье [Harwig et al., 1994]. Выделение и очистку дефенсинов из экстракта лейкоцитов кролика, полученных из перитонеального экссудата, осуществляли, как описано ранее [Шамова и др., 1993].

Идентификацию дефенсинов и оценку их чистоты проводили с помощью массспектрометрии MALDI TOF на оборудовании ЦКП «Аналитическая спектрометрия», аналитического электрофореза (ЭФ) и аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ).

Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитов домашней козы.

Лейкоцитарную массу, обогащенную нейтрофилами, получали из цельной крови взрослых здоровых коз (Capra hircus). Экстракцию белков и пептидов проводили 10 % уксусной кислотой. Экстракты высушивали, перерастворяли в 0.05 М трис-HCl буфере рН 7.4 и проводили расщепление предшественников кателицидинов с помощью 0.1 мкМ эластазы.

Полученный материал подвергали ультрафильтрации через фильтр “Amicon” YM- (НОММ 10кДа) для отделения низкомолекулярной фракции полипептидов, которую концентировали, наносили на электрофоретическую колонку и проводили препаративный электрофорез в кислой среде при непрерывной элюции пептидов из геля. Фракции, в которых выявлялась антимикробная активность, разделяли с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке Vydak C-18 при элюции пептидов с использованием градиента концентраций вода – ацетонитрил с 0.1% трифторуксусной кислотой или 0.13 % гептафтормасляной кислотой.

Оценку чистоты полученных индивидуальных фракций пептидов, обладающих антимикробной активностью, проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI TOF, а также аналитической ОФ ВЭЖХ и ЭФ. Частичная первичная структура выделенных пептидов - бактенецинов ChBac5 и ChBac3.4 - была расшифрована в лаборатории пептидного сиквенса Калифорнийскго университета Лос-Анджелеса с помощью пептидного сиквенса по Эдману; полная первичная структура ChBac5 была установлена в лаборатории профессора Р. Лерера Калифорнийскго университета Лос-Анджелеса с помощью клонирования гена пептида; аминокислотная последовательность С-концевого участка ChBac3.4 была определена в лаборатории профессора Р. Хоффмана в университете г.

Лейпцига с использованием масс-спектрометрических методов. Первичная структура минибактенецинов была установлена в лаборатории профессора Т.В. Овчинниковой в Институте Биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитов Русского осетра и севрюги. Лейкоцитарную массу, получали из крови русского осетра Acipenser gueldenstadti и севрюги Acipenser stellatus, проводили экстракцию белков и пептидов 10 % уксусной кислотой, затем экстракты подвергали ультрафильтрации. Материал, содержащий полипептиды с молекулярной массой менее 10-12 кДа, наносили на электрофоретическую колонку и проводили препаративный электрофорез в кислой среде при непрерывной элюции пептидов из геля. Фракции, в которых выявлялась антимикробная активность, разделяли с помощью ОФ ВЭЖХ. Частичная первичная структура очищенных пептидов была расшифрована с помощью пептидного сиквенса по Эдману в лаборатории профессора Т.В.

Овчинниковой в Институте Биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А.

Овчинникова РАН; в этой же лаборатории была установлена полная первичная структура пептидов с помощью клонирования гена гистона Н2А исследуемых рыб.

Электрофоретические методы. Для оценки электрофоретической подвижности пептидов по направлению к катоду в кислой среде использовали метод электрофореза в кислой буферной системе в присутствии мочевины [Panyim, Chalkley,1969]. Этод метод, а также метод электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия [Schagger, Von Jagow, 1987] применяли для анализа спектра катионных белков и пептидов в экстрактах из лейкоцитов человека и животных, и в белковых фракциях, полученных на разных стадиях выделения и очистки пептидов; для оценки гомогенности очищенных индивидуальных фракций антимикробных пептидов. Препаративный электрофорез в кислой буферной системе при непрерывной элюции белков и пептидов из полиакриламидного геля проводили в 12.5% полиакриламидном геле в кислой буферной системе в присутствии мочевины [Harwig et al.,1993] в аппарате для препаративного электрофореза (Bio-Rad, США).

спектрофотометрическими методами, используя коэффициенты молярной экстинкции при длине волны 280 нм для ChBac3.4 и 257 нм для ChBac5, который из ароматических аминокислот содержит только фенилаланин. Кроме того, концентрацию белка определяли по методу Бредфорд.

Оценку антимикробной активности методом серийных разведений пептидов в питательной среде, содержащей микроорганизмы, проводили в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий (включая золотистый стафилококк, устойчивый к метициллину, и ряд антибиотикоустойчивых клинических изолятов бактерий), а также грибов рода Candida (метод в модификации Tossi et al., 1997). Штаммы микроорганизмов были предоставлены сотрудниками Калифорнийского университета ЛосАнджелеса (США), университета г. Триеста (Италия), Отдела генетики микроорганизмов ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН, ФГБУ РНИИ Травматологии и ортопедии им. Р.Р. Вредена Минсоцразвития России, Военно-медицинской Академии им. С.М. Кирова МО РФ.

Определяли минимальные ингибирующие концентрации (МИК) и затем минимальные бактерицидные концентрации. Эксперименты проводили в помещениях, оснащенными всеми необходимыми средствами защиты для работы с используемыми штаммами.

Метод радиальной диффузии пептидов в агарозных гелях, содержащих микроорганизмы, использовали, как описано Лерером и соавт. [Lehrer et al., 1991].

Изучение совместного антимикробного действия пептидов и других антибиотических агентов с целью выявления синергических эффектов осуществляли с помощью серийных разведений пептидов в среде, содержащей микроорганизмы, по методу «Шахматной доски» («Сheckerboard titrations»), определяя индексы фракционных ингибирующих концентраций (иФИК; FIC index - fractional inhibitory concentration index) [Jacobs, 1996]. При иФИК 0,5, совместное действие препаратов рассматривали, как синергическое, иФИК=1, как аддитивное; иФИК > 2 – антагонистическое. Наночастицы серебра были синтезированы и охарактеризованы сотрудниками НИИ Химии силикатов им. Гребенщикова РАН.

Оценка изменения проницаемости мембран E.coli ML35p для хромогенных маркеров под действием пептидов. Принцип метода и особенности штамма E.coli ML35p описаны ранее [Lehrer et al., 1989; Orlov et al., 2001; Артамонов и др., 2008]. О состоянии внешней и цитоплазматической мембран E.coli ML35p судили по их проницаемости для хромогенных маркеров - нитроцефина (внешняя мембрана) и о-нитрофенил--D-галактопиранозида (ONPG) (цитоплазматическая мембрана). Измерение оптической плотности растворов при длине волны 486 нм и 420 нм проводили с помощью спектрофотометра SpectraMax фирмы Molecular Devices при температуре 37оС и периодическом встряхивании планшетов.

Данные обрабатывали в программе Sigma Plot 9. На графиках представлены результаты типичного эксперимента, каждая точка является средним арифметическим из трех значений, полученных для параллельных проб. Эксперименты повторяли минимум 3 раза, характер кривых был аналогичным во всех проведенных сериях экспериментов.

Молекулярное моделирование. Математическое моделирование структур пептидов выполнено И.А.Елисеевым на оборудовании Лаборатории прикладной математики и механики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета. Гидрофобные свойства пептидов были оценены с использованием программы Matlab. Удельные разности свободных энергий для аминокислот с учетом пептидной связи были взяты из работы Wimley, White, 1996.

Оценку антимикробной активности методом подсчета колоний проводили по стандартной схеме, но в ряде экспериментов использовали условия (состав инкубационной среды, количество КОЕ на мл), аналогичные описанным в вышеизложенной методике;

вместо растворов субстратов (нитроцефина или ONPG) добавляли равные объемы Н2О.

Оценку липополисахарид-связывающей активности пептидов осуществляли с помощью Лимулюс теста (Quantitative Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate; Lonza, США) с использованием методов и подходов, описанных в статье Zhao et al., 2001. Cерийные разведения пептидов инкубировали с липополисахаридом E.coli в конечной концентрации 0.5 Ед/мл в течение 30 мин при 37 оС. Затем в лунки планшета вносили субстрат и инубировали его при 37 оС в термостатируемой камере спектрофотометра, измеряя оптическую плотность раствора при 405 нм; вычисляли разницу величин оптической плотности в начале инкубации и через 6 мин – OD405. Долю связанного ЛПС (в процентах) определяли по формуле: % связанного ЛПС = (ЛПС без пептида) –(ЛПС с пептидом) / (ЛПС без пептида), где = OD405(пептид (или вода) с ЛПС) - OD405(пептид (или вода) без ЛПС). Строили кривые зависимости доли связанного ЛПС (в %) от концентрации пептидов в инкубационной среде (программа Sigma Plot 9) и определяли ЭК50 (эффективная концентрация 50%: концентрация пептидов, при которой 50% ЛПС находится в связанном состоянии).

Анализ гемолитической активности пептидов проводили, как описано [Taylor et al., 2000], используя эритроциты человека, полученные по стандартной методике из крови здоровых доноров.

Культивируемые клетки. В работе использовали следующие клеточные линии:

клетки эритромиелоидной лейкемии человека К-562, клетки гистиоцитарной лимфомы человека U-937, клетки промиелоцитарной лейкемии человека HL-60, клетки эпителиоидной карциномы легкого человека А-549, клетки эпидермоидной карциномы человека А-431, остеосаркомы человека MG-63, а также нетрансформированные клетки: нормальные фибробласты кожи человека, первичные миобласты крыс, фибробласты легкого эмбриона человека MRC-5. Культура миобластов крыс была любезно предоставлена сотрудником ИНЦ РАН Г.А.Сакута;

фибробластов, полученных из кожи человека - сотрудником отдела иммунологии НИИЭМ СЗО РАМН А.С. Трулевым, остальные клеточные линии были из коллекции клеточных культур ИНЦ РАН.

Нейтрофилы и мононуклеарные лейкоциты периферической крови человека получали из крови здоровых доноров по стандартной методике [Фримель, 1979].

Оценку жизнеспособности клеток и интенсивности их пролиферации проводили с помощью МТТ-теста [Mossamann, 1983]. При изучении токсичности пептидов клетки монослойных культур высеивали в планшеты (10000 клеток на лунку) за 20 часов до внесения пептидов, клетки суспензионных линий вносили непосредственно перед добавлением к ним пептидов в разных концентрациях и помещали в СО2 инкубатор на 6, или 48 часов. Для построения графиков и расчета медианной ингибирующей концентрации пептидов (ИК50) использовали программу Sigma Plot 9. При проведении статистической обработки подсчитывали среднее арифметическое и среднеквадратичное отклонение. При изучении влияния пептидов на пролиферацию фибробластов кожи человека клетки высеивали в стерильный планшет по 10000 клеток на лунку в среде ДМЕМ с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой и добавляли серийные разведения пептидов в той же среде. Планшеты с клетками и пептидами инкубировали в CO2 инкубаторе в течение часов при 37оС, затем оценивали интенсивность пролиферации фибробластов, расчитывая относительный коэффициент пролиферации («OD540опыт»/«OD540контроль» [Pal et al., 2006]).

МТТ-тест был выбран для оценки пролиферации, так как адекватность данного метода для этой цели, в том числе и для изучения пролиферации фибробластов, была показана в ряде работ, где сопоставлялись результаты, полученные с использованием различных методов и подходов [Riss, Moravec, 1996; Boza et al., 2010; Vega-Avila, Pugsley, 2011].

Кроме того, для оценки жизнеспособности клеток после их обработки пептидами применяли маркер клеточной гибели – краситель трипановый синий, подсчитывая число погибших клеток, включивших краситель, в камере Горяева.

Оценку доли клеток, вступивших на путь апоптоза и некроза производили с помощью набора реагентов «Annexin V-Cy3 Apoptosis Detection kit» (Sigma, США). Клетки (1 млн/мл) инкубировали с разными концентрациями пептида в течение 2 часов при 37 оС.

Контрольные пробы инкубировали в тех же условиях, но без добавления пептидов. По окончании инкубации клетки обрабатывали в соответствии с рекомендациями производителей набора и подсчитывали под люминесцентным микроскопом количество клеток, включивших тот или иной краситель, определяя, таким образом, количество живых клеток; клеток, погибших по пути некроза; и клеток, находящихся на ранней стадии апоптоза. Анализировали несколько полей зрения, подсчитывая не менее 500 клеток.

Результаты выражали в процентах от общего количества клеток и представляли как средние арифметические по данным трех экспериментов ± среднеквадратичное отклонение.

Определение ферментативной активности каспазы 3 выполняли колориметрическим методом по скорости расщепления синтетического субстрата Ac-DEVD-pNA с помощью набора «Caspase 3 Assay Kit» (Sigma, США). Клетки (1 млн/мл) инкубировали с разными концентрациями пептида в течение 3 часов при 37 оС, в трех параллелях. По окончании инкубации клетки обрабатывали в соответствии с рекомендациями изготовителей набора и измеряли оптическую плотность при 405 нм. На графиках результаты измерения активности представляли в процентах от контроля (клетки без пептида).

Конъюгацию протегрина 1 и бактенецина 5 с флюоресцентным красителем BODIPY FL SE (4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene, Sucinimidil Ester (Molecular Probes, США)); возбужд. 503 нм; испуск. 512 нм), США) проводили в 0,05 М натрий-фосфатном буфере рН 6.5 в течение 24 часов на холоду (молярное соотношение пептид : краситель = 1 :

5). В данных условиях присоединение метки ведется по N-концевой аминокислоте [Gaudrialt, Vincent, 1992]. Далее проводили очистку меченого продукта от непрореагировавшего пептида и других нежелательных продуктов реакции с помощью ВЭЖХ. Идентификацию меченых пептидов и оценку их чистоты проводили с помощью масс-спектрометрии (MALDI TOF). Концентрацию пептидов, конъюгированных с BODIPY FL, определяли спектрофотометрически согласно рекомендациям производителя флуорофора и, учитывая, что на одну молекулу пептида приходится одна молекула BODIPY FL. Антимикробная и цитотоксическая активность протегрина-BODIPY и бактенецина-BODIPY практически не отличалась от активности исходных немеченых пептидов.

Конъюгацию дефенсина человека HNP-1 с биотином осуществляли по той же схеме и в тех же условиях, как и вышеописанную конъюгацию пептидов с флуорофором.

Использовали длинноцепочечный вариант биотина (NHS-LC-biotin, Pierce, США).

Конъюгацию PG1I с I125 проводили с использованием Na125I (Pierce Chemicals, США) и Iodobeads (Pierce Chemicals) по методике, предложенной Лерером и соавт. [Lehrer et al., 1988]. После проведения конъюгации из проб удаляли свободный йод, подвергая их очистке с помощью картриджа Sep-Pak C-18. Работу выполняли в помещении, сертифицированном для работы с радиоактивными веществами, и с соблюдением соответствующих правил (работа выполнялась в Калифорнийском университете Лос-Анджелеса, США). Далее полученные пробы подвергали дополнительной очистке с помощью ОФ ВЭЖХ для разделения моно-йодированного, ди-йодированного и немеченого пептида. В экспериментах использовали моно-йодированные пептиды. Количество клеток бактерий в 1 мл суспензии определяли по оптической плотности суспензии, предварительно построив калибровочные кривые, отражающие зависимость оптической плотности суспензий от количества колониеобразующих единиц, определенного методом подсчета колоний.

Методы изучения действия пептидов, несущих флуоресцентную метку, на клетки:

Конфокальная микроскопия. За процессом связывания протегрина-BODIPY и бактенецина-BODIPY с клетками-мишенями и проникновения пептидов в клетки наблюдали с помощью конфокальной микроскопии на микроскопе LEICA TCS SL (Германия). К суспензиям клеток (50 тыс./пробу) добавляли меченые пептиды до конечной концентрации 1-10 мкМ, или равный объем среды для контрольных проби инкубировали при 37оС 30 мин, 1 ч или 2 ч. Затем клетки осаждали центрифугированием, промывали ЗФР, и препараты (без фиксации) немедленно использовали для микроскопического исследования. Кроме того, препараты использовали для приготовления мазков, которые окрашивали по МайГрюнвальду и анализировали с помощью световой микроскопии.

Проточная цитометрия. Интернализацию меченых пептидов в клетки-мишени оценивали количественно с помощью проточной цитометрии на приборе ACR1000 (Brucker). Клетки инкубировали с пептидами в различных условиях: при 37оС; при 4оС (на ледяной бане); в присутствии 0.1% азида натрия и 50 мM 2-дезоксиглюкозы или 10 мкМ винбластина, или мкМ цитохалазина В, или 0.25 мМ метилциклодекстрина. Перечисленные реагенты вносили в клеточные суспензии за 1 час до внесения пептидов. Концентрации вносимых веществ подбирали с учетом данных литературы [Drin et al., 2002; Takeshima et al., 2003; Tomasinsig et al., 2006], предварительно проверив, что в этих концентрациях они не вызывали гибель клеток. После внесения пептидов инкубацию продолжали в течение часа; затем клетки отмывали ЗФР и за три минуты до измерения к клеткам добавляли раствор трипанового синего до конечной концентрации 40 мкг/мл [Van Amersfoort, Van Strijp, 1994], который служил в качестве «гасителя» флюоресценции BODIPY FL, и, не проникая внутрь живых клеток, элиминировал сигнал от пептидов-BODIPY, находящихся на поверхности клетокмишеней. Для оценки доли погибших клеток использовали иодид пропидия. Проточная цитометрия выполнялась в ЦКП «Материаловедение и диагностика в передовых технологиях».

Оценка влияния 1-антитрипсина (ААТ) на цитотоксическую активность пептидов. Пептид в концентрации 200 мкг/мл (100 мкМ) инкубировали с ААТ, взятым в концентрациях от 12.5 до 80 мкМ, в течение часа, затем по 10 мкл полученных смесей вносили в лунки планшетов, в которых находилось по 90 мкл клеточных суспензий (10 тыс.

клеток на лунку). В контрольные пробы вносили по 10 мкл пептида (100 мкМ) без ААТ, либо по 10 мкл среды, либо по 10 мкл ААТ (80 мкМ) без пептида. Планшеты оставляли на 24 часа в СО2 инкубаторе, затем проводили оценку жизнеспособности клеток с помощью МТТ теста.

Влияние пептидов на антипротеазную активность 1-антритрипсина изучали, анализируя способность ААТ ингибировать ферментативную реакцию, катализируемую эластазой из лейкоцитов человека, после инкубирования ААТ с антимикробными пептидами.

Активность эластазы оценивали по методу Visser and Blont, 1972 с использованием рнитрофениловый эфира бутилтреокси-L-аланина в качестве субстрата. Пептиды в разных концентрациях инкубировали с 20 мкМ ААТ в течение 1 часа, затем вносили по 10 мкл полученных смесей пептидов с ААТ в лунки планшета, добавляли по 80 мкл буфера и по мкл эластазы (6 мкМ). Контролями служили: 1) пробы, содержащие ААТ и эластазу, но без пептидов; 2) пробы, содержащие только эластазу; 3) пробы, содержащие только буфер.

После добавления субстрата детектировали появление продукта реакции, проводя измерение оптической плотности растворов при длине волны 405 нм.

Выявление связанного с серпинами биотинилированного дефенсина на мембранах изучали с использованием дот-блот теста. Серпины наносили на нитроцеллюлозную мембрану.

После полного высыхания капли мембрану обрабатывали по стандартной методике, используемой при проведении дот-блоттинга. Однако, вместо антител мембрану обрабатывали биотинилированным дефенсином. Связавшийся с иммобилизованными на мембране серпинами дефенсин выявляли с помощью меченного пероксидазой авидина. Контролем служили мембраны, на которые вместо исследуемых серпинов наносили человеческий сывороточный альбумин или буфер.

Определение уровня свободного кортизола в присутствии транскортина и дефенсина. Транскортин (Affiland, Бельгия) в конечной концентрации 1 мкМ инкубировали с дефенсином человека HNP-1, взятым в разных концентрациях, при 37 оС в течение 1 ч (контрольные пробы, инкубировавшиеся в тех же условиях, содержали транскортин без добавления дефенсина). Затем к пробам добавляли кортизол (гидрокортизон, Sigma (США)) и инкубировали еще 30 мин (включив дополнительный контроль - пробы, содержащие только кортизол). Далее, для отделения несвязавшегося с транскортином кортизола, пробы подвергали микродиализу. В верхнюю камеру диализной ячейки вносили пробы после инкубации. В нижнюю камеру, отделенную от верхней диализной мембраной (мембрана с НОММ 3.5 кДа), вносили по 200 мкл среды RPMI-1640. Материал, прошедший через мембрану в нижнюю камеру и содержащий свободный кортизол, отбирали и определяли в нем концентрацию кортизола с использованием ИФА (Алкор Био, Россия).

Оценка влияния пептидов на цитотоксическую активность спленоцитов крысы в отношении клеток К-562. Спленоциты крыс получали с помощью с применением стандартной методики [Фримель, 1979]. Цитотоксическую активность спленоцитов определяли по их способности лизировать клетки К-562 in vitro. Для количественной оценки цитотоксической активности использовали набор для оперделения цитотоксичности фирмы Invitrogen (Cell-mediated cytotoxicity kit, Invitrogen, США) и проводили эксперимент в соответствии с рекомендациями производителя набора. Клетки-мишени преинкубировали с зеленым флюоресцентным красителем DiOC18 (3,3'-диоктадецилоксакарбоцианин перхлорат), связывающимся с компонентами клеточных мембран, после чего к ним добавляли спленоциты (эффекторы), расчитав их количество так, чтобы получить соотношение эффектор:мишень 50:1, 20:1 или 5:1, и инкубировали в течение 20 часов в СО2инкубаторе при 37 С, 5% СО2. Контрольные пробы содержали 1) клетки-мишени без клетокэффекторов и пептидов; 2) клетки-мишени с пептидами, но без клеток-эффекторов; 3) клетки-эффекторы. После инкубации добавляли пропидиум иодид. Далее с испольованием флюоресцентного микроскопа подсчитывали число мертвых и живых клеток-мишеней.

Использовали по три параллельные пробы, в каждой пробе подсчитывали клетки в нескольких полях зрения, чтобы общее количество клеток-мишеней составляло 250-300.

Исследование влияния дефенсинов на противовоспалительные эффекты -МСГ проводили с использованием экспериментальных моделей, описанных в работе Геттинга и соавт. [Getting et al, 1999] и применяли сходные концентрации меланокортина.

Экспериментальные животные. Эксперименты выполнены на взрослых мышахсамцах гибридах 1 поколения (СВА x C57Bl6) F1, массой 18-22 г, полученных из питомника РАМН «Рапполово» (Санкт-Петербург). Условия работы с животными соответствовали правилам Европейской Конвенции ЕТ/S 129, 1986 и директивам 86/609 ЕSС.

Изучение эффектов дефенсинов на вызванное введением -МСГ ингибирование миграции нейтрофилов в очаг воспаления у мышей проводили на модели асептического воспаления, вызванного внутрибрюшинным введением стерильного 0.3% раствора крахмала (на физ. растворе). Животные были разделены на следующие группы: 1). мыши, которым в/бр вводили -МСГ фирмы Sigma, США (10 мкг на животное) за 20 мин до в/бр инъекции раствора крахмала; 2). мыши, которым в/бр вводили дефенсин (10 мкг на животное) за мин до введения раствора крахмала; 3). мыши, которым в/бр вводили дефенсин, далее через 20 мин вводили -МСГ и еще через 20 мин вводили раствор крахмала; 4). контрольная группа: мыши, которым в/бр вводили 100 мкл физ. раствора за 20 мин до введения раствора крахмала. Каждая группа включала 6 животных, эксперимент повторяли 3 раза. В экспериментах использовали дефенсин кролика NP-3b (или кортикостатин 2), являющийся одним из наиболее активных кортикостатинов. Через 6 ч после введения крахмала мышей умерщвляли с помощью декапитации. Количество клеток в перитонеальном экссудате подсчитывали в камере Горяева. Кроме того, экссудаты использовали для приготовления мазков, на которых затем подсчитывали относительное количество нейтрофилов и макрофагов.

Оценка влияния дефенсина человека HNP-1 на вызванное -МСГ угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов человека. Суспензии нейтрофилов человека в среде RPMI-1640 (1 млн клеток в 250 мкл среды) инкубировали при 37 оС 1 час. Далее к клеточным суспензиям добавляли: 1-я и 2-я группы:

-МСГ до конечной концентрации мкМ или 2 мкМ, соответственно, затем, через 30 мин, суспензию меченых FITC латексных частиц; 2-я и 3-я группы: дефенсин человека HNP-1 до конечной концентрации 1 мкМ и мкМ, соответственно, затем, через 30 мин, суспензию латексных частиц; 4-я, 5-я и 6-я группы: дефенсин до конечной концентрации 1 мкМ (4-я, 5-я группы) и 2 мкМ (6-я гр.), через 15 мин -МСГ до конечной концентрации 1 мкМ (4-я гр.) и 2 мкМ (5-я, 6-я гр.), затем, через 30 мин, латексные частицы; 7-я контрольная группа – клетки, к которым добавляли латексные частицы без введения гормона или дефенсина. Инкубацию нейтрофилов с латексными частицами вели в течение 2 часов, затем количество клеток, фагоцитировавших флюоресцентные частицы, подсчитывли с помощью флюоресцентного микроскопа.

Оценка эффектов дефенсинов человека HNP-1 и HNP-4 на супрессивное действие -МСГ на секрецию ИЛ-1 мононуклеарными клетками человека, стимулированную введением в культуру клеток липополисахарида. К мононуклеарам периферической крови человека добавляли -МСГ (1 мкМ) и дефенсины человека HNP-2 или HNP-4 в концентрации 1 мкМ и ЛПС (Sigma, США) или равный объем среды и инкубировали пробы (по три параллели) при 37 оС в атмосфере СО2 в течении 20 ч. Кроме того, в эксперименте имелись следующие группы: 1) клетки, инкубировавшиеся без добавления, гормона, пептидов и ЛПС; 2) клетки, инкубировашиеся в присутствии ЛПС, но без а-МСГ и пептидов;

3) клетки, инкубировашиеся в присутствии ЛПС и -МСГ, но без пептидов; 4) клетки, инкубировашиеся с -МСГ без ЛПС и пептидов; 5) клетки, инкубировашиеся с пептидами без ЛПС и без -МСГ. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием и определяли концентрацию ИЛ-1 в супернатантах с помощью ИФА (набор реактивов фирмы «ООО Цитокин», Россия).

Оценка влияния пептидов на процесс заживления кожной раны у мышей.

Экспериментальным животным под легким эфирным наркозом наносили по две полнослойные кожные раны в области спины, используя одноразовые круглые скальпели для биопсий диаметром 6 мм («Stiefel», Германия). В 1-й, 2-й, 4-й, 6-й и 8-й день эксперимента на поверхность ран наносили раствор ChВас5 в концентрации 2 или 10 мкМ; животным контрольной группы по той же схеме наносили растворитель. Для определения площади раневой поверхности, начиная со второго дня после воздействия, животных фотографировали цифровой фотокамерой, изображения переносили на компьютер, калибровали и измеряли площадь раневого дефекта с помощью программы ImageJ 1.44p (NIH, USA). Результаты выражали в процентах от исходной площади в контрольной группе и представляли как среднее арифметическое значение и среднеквадратичное отклонение (n=6).

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов программ Excel, Statistica 6.0 и Sigma Plot 11. Достоверность различий между группами (Р) оценивали по tкритерию Стьюдента или по U-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. Во всех расчетах за достоверный принимали 95% уровень значимости (Р * - Данные представлены, как минимальные ингибирующие концентрации пептидов (МИК) в µM;

пептиды инкубировали с микроорганизмами в одном случае, в 10 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7.4, в другом случае в 10 мМ Na-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 100 mM NaCl. Данные представлены как средние арифметические+среднеквадратичное отклонение (n=9). В скобках приведены данные, полученные при оценке активности пептидов, выделенных из лейкоцитов; без скобок - с использованием химически синтезированных пептидов.

При исследовании антимикробной активности бактенецинов с помощью метода серийных разведений в питательной среде показано, что бактенецины ChBac3.4, miniChBac7.5N, mini-ChBac7.5N и ChBac5 проявляют высокую антимикробную активность против грамотрицательных бактерий, причем активность этих пептидов в отношении клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp, Acinetobacter baumannii, устойчивых к ряду традиционно используемых в медицине антибиотикам, высока и практически не отличается от таковой в отношении лабораторных штаммов (Таблица 2).

Таблица 2. Минимальные концентрации пептидов, ингибирующие рост микроорганизмов (МИК), мкМ*.

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa клинический изолят Acinetobacter baumannii клинический изолят * - метод серийных разведений антибиотических препаратов в питательной среде, содержащей микроорганизмы. Представлены медианы, полученные из 5-6 экспериментов, выполненных в 3-х параллелях.

В результате исследования активности бактенецинов в отношении грамположительных бактерий показано, что ChBac5, mini-ChBac7.5N, mini-ChBac7.5N демонстрируют высокую активность против Listeria monocytogenes и Miсrococcus luteus, но сниженную активность против исследованных штаммов стафилококков. Пептид ChBac3.4 обладает более высокой активностью в отношении стафилококков по сравнению с другими бактенецинами.

Минимальные бактерицидные концентрации (МБК) пептидов в отношении большинства штаммов бактерий при использовании ChBac3.4 и ChBac5 в два раза, а в случае mini-ChBac7.5 и в 4-8 раз превышали их минимальные ингибирующие концентрации (МИК); для PG1 МБК были равны или в два раза превышали МИК.

Выраженной активности в отношении грибов рода Candida исследуемых пролинбогатых пептидов не выявлено, в то время как протегрин 1 ее проявляет.

Известные к настоящему времени обогащенные пролином пептиды (ОПП) системы врожденного иммунитета животных (как ОПП беспозвоночных, так и пептиды млекопитающих) обладают высокой антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий и сниженной в отношении грамположительных [Otvos et al., 2000; Gennaro et al., 2002]. В наших экспериментах показано, что в среде с низкой ионной силой исследуемые обогащенные пролином бактенецины активны против широкого спектра микроорганизмов, в то время как в присутствии хлорида натрия в концентрации, близкой к его концентрации в биологических жидкостях, или в питательной среде, тоже содержащей NaCl, они заметно теряют активность в отношении стафилококков. Такой эффект может частично объясняться сниженим связывания пептидов с поверхностью бактериальных клеток за счет электростатического взаимодействия, имеющего место на первой стадии осуществления антимикробного действия пептидов.

Исследование второй стадии взаимодействия АМП с бактерией – проникновения их через бактериальные мембраны с нарушением или без нарушения целостности мембран – является одной из важнейших характеристик АМП. Для большинства АМП мишенью антимикробного действия являются именно бактериальные мембраны – пептиды вызывают их быструю и необратимую дезинтеграцию. Однако некоторые АМП действуют иначе, и инактивируют микроорганизмы, нарушая внутриклеточные процессы, не затрагивая существенно целостности микробных мембран. К таким пептидам относятся обогащенные пролином АМП насекомых, бактенецин 7 быка, которые, проникая в клетки, связываются с белком-шапероном DnaK и блокируют систему фолдинга белка [Otvos et al., 2005; Scocchi et al., 2009]. Однако в более высоких концентрациях, в несколько раз превышающих МИК, ОПП млекопитающих вызывают и повреждение мембран бактерий [Podda et all., 2006]. Изучение влияния рассматриваемых бактенецинов на проницаемость наружной и цитоплазматической мембран E.coli ML35p показало, что наибольшие отличия наблюдаются для действия пептидов на цитоплазматическую мембрану бактерии: увеличение ее проницаемости для маркерной молекулы в присутствии ChBac5 наблюдается через 45-50 мин (Рис. 3); в присутствии ChBac3.4 в той же концентрации эффект наблюдается уже через 20 мин; PG-1 вызывает быстрое и выраженное влияние на проницаемость цитоплазматической мембраны, уже через 2-3 мин, а mini-ChBac7.5N и mini-ChBac7.5N не оказывают действия на этот процесс.

Чтобы выяснить, как изменялась жизнеспособность бактерии при увеличении проницаемости ее мембраны под действием пептидов, использовали метод подсчета колоний, позволяющий оценить количество жизнеспособных микроорганизмов в динамике, который проводили параллельно с опытом по изучению влияния пептидов на проницаемость цитоплазматической мембраны E.coli ML35p, в тех же условиях (Рис. 3В). ChBac3. демонстрирует более выраженное и быстрореализуемое действие в отношении мембран E.coli, чем ChBac5 и мини-бактенецины. Такое действие на бактериальные мембраны не характерно для описанных в литературе обогащенных пролином АМП. Чтобы выяснить причину наблюдаемых различий в действии пептидов на мембраны бактерий проведено сравнение гидрофобных свойств молекул ChBac3.4 и ChBac5, так как определение этого Наружная мембрана E.coli ML35p A 0, 0, 0, 0, 0, Рисунок 3. Динамика антимикробного действия батенецинов и протегрина 1 в A, Б - кинетика изменения проницаемости мембран E.coli ML35p для хромогенных маркеров при действии антимикробных пептидов (концентрации пептидов в два раза превышали их МИК для E.coli). В – влияние пептидов на жизнеспособность бактерии (метод подсчета колоний). По оси ординат – время инкубации пептидов с бактерией, в минутах; по оси абсцисс - оптическая плотность раствора, содержащего продукты гидролиза хромогенных субстратов, при длине волны 486 нм (А) и 420 нм (Б);

количество колониеобразующих единиц бактерии (В). Контролем служили пробы, параметра является одной из важных характеристик белковых молекул и позволяет сделать предположение о воможности встраивания этих молекул в липидные мембраны. Показано, что расчетная разность свободных энергий ChBac3.4 в воде и в н-октаноле (среде, моделирующей мембрану) составляет -16±5 Дж/моль, в то время как соответствующая величина для ChBac5 составляет 700±280 Дж/моль, что позволяет предположить большее сродство ChBac3.4 к липидным мембранам по сравнению с ChBac5. Таким образом, более выраженное действие пептида ChBac3.4, наблюдаемое в эксперименте, по-видимому, определяется гидрофобными свойствами его молекулы, обусловливающими его облегченное встраивание в липидные бислои, требующее значительно меньших затрат энергии, чем в случае ChBac5.

Можно предполо-жить, что более высокая активность ChBac3.4 в отношении грамположительных бактерий по сравнению ChBac5 связана с его большим повреждающим действием на мембраны бактерий.

Антимикробное действие пептидов другой группы - аципенсинов, в целом, сходно с действием бактенецинов. В среде с низкой ионной силой их активность значительно выше, чем в среде с концентрацией хлорида натрия, близкой к таковой в биологических жидкостях.

В таблице 3 представлены данные оценки антимикробной активности аципенсинов 1, 2 и 6, которые являлись преобладающими фракциями аципенсинов, полученных из лейкоцитов осетра. По характеру активности аципенсины 1 и 2 близки и к АМП из нейтрофилов человека – альфа-дефенсинам, действие которых также зависит от ионной силы среды [Lehrer, Ganz, 2002]. В таблице приведены и данные, полученные нами для дефенсина HNPего активность в отношении большинства исследованных микроорганизмов, за исключением Listeria monocytogenes, падает в среде с 100 мМ NaCl.

Таблица 3. Антимикробная активность аципенсинов Ас 1, Ас 2 и Ас 6*.

* - Данные представлены, как минимальные ингибирующие концентрации пептидов (МИК) в µM; пептиды инкубировали с микроорганизмами в одном случае, в 10 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7.4, в другом случае в 10 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 100 mM NaCl. Для сравнения приводятся данные, полученные для дефенсина HNP-1 из нейтрофилов человека. Использованы пептиды, выделенные из лейкоцитов. Приведены средние арифметические ± среднеквадратичное отклонение (n = 6).

Антимикробные эффекты химически синтезированного аципенсина 6 были выражены лишь в отношении грамотрицательных бактерий. Так, МИК, полученные методом радиальной диффузии (в среде с низкой ионной силой) составляли для Esсherichia coli M- – 3.4 ± 1.2 мкМ; для Esсherichia coli ATCC 25923 – 13.7 ± 3.5 мкМ; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 – 4.92 ± 0.9 мкМ; Aeromonas sp. – 4.55 ± 1.2 мкМ; Staphylococcus aureus SG - > 20 мкМ; Staphylococcus aureus 710 A > 20 мкМ; антибиотикоустойчивые клинические изоляты Klebsiella pneumoniae – 3.24 ± 0.6 мкМ; Pseudomonas aeruginosa - > 20 мкМ.

На Рис. 4 представлены данные, свидетельствующие о том, что характер антимикробного действия аципенсинов сходен с действием бактенецинов, то есть в концентрациях, близких к МИК, они не нарушают целостности цитоплазматической мембраны бактерии E.coli ML35p.

0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, По оси ординат - оптическая плотность раствора, содержащего продукты гидролиза хромогенных маркеров при длине волны 486 и 420 нм; по оси абсцисс – время инкубации пептидов с бактерией, в минутах. Контролем служили пробы, содержащие бактерии, но в которые вместо пептидов добавляли равные объемы буфера.

Таким образом, исследуемые антимикробные пептиды (протегрины, бактенецины, аципенсины) проявляют высокую антимикробную активность в диапазоне концентраций (микромолярных, субмикромолярных) 0.5-4 мкМ, в том числе и в отношении антибиотикоустойчивых штаммов. Спектр их активности и характер действия на микроорганизмы различен: протегрин 1 характеризуется широким спектром активности и его действие сопровождается повреждением мембран; обогащенные пролином бактенецины активны преимущественно против грамотрицательных бактерий. Аципенсины, как и бактенецины вызывают гибель микроорганизмов без заметного повреждения их мембран.

Совместное действие бактенецинов и других антибиотических агентов.

Использование комбинаций лекарственных препаратов часто приводит к повышению их эффективности и снижает действующие концентрации, что позволяет уменьшить и вероятность проявления побочных эффектов. В данной работе использовали комбинации обогащенных пролином бактенецинов и небелковых соединений, обладающих антимикробной активностью (гентамицина, оксациллина, рифампицина и наночастиц серебра). При применении ChBac3.4 в комбинации с наночастицами серебра наблюдаются синергические эффекты в отношении штаммов E.coli ML35p (индекс фракционных ингибирующих концентраций (иФИК) – 0.5), E.coli ATCC 25922 (иФИК - 0.5) а также клинического изолята Pseudomonas aeruginosa, устойчивого к традиционно используемым в клинике антибиотикам (иФИК- 0.5). При использовании mini-ChBac7.5N в комбинации с наночастицами серебра показано наличие синергических эффектов в отношении этих штаммов микроорганизмов (иФИК-0.5). В отношении штамма Staphylococcus aureus SG 511 установлено наличие аддитивного эффекта для комбинаций наночастиц серебра с ChBac3.4, и mini-ChBac7.5N с наночастицами серебра (иФИК-1). При совместном действии mini-ChBac7.5N и рифампицина или ChBac3.4 и рифампицина наблюдаются синергические эффекты в отношении штаммов E.coli ML35p и E.coli ATCC 25922 (иФИК – 0.5). При совместном действии этих пептидов с гентамицином и оксациллином на те же штаммы синергическое действие не выявляется.

Оценка липополисахарид-связывающей активности пептидов.

Одним из важных функциональных свойств антимикробных пептидов является их свойство связывать липополисахарид (ЛПС), являющийся структурным компонентом наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Связывание антимикробных пептидов с ЛПС происходит на первой стадии контакта пептидов с микроорганизмами, и от характера этого связывания во многом зависит эффективность антимикробного действия АМП.

ЛПС-связывающую активность исследуемых АМП оценивали, используя методы и подходы, наиболее часто используемые для характеристики этого свойства у природных АМП и описанные в статье [Zhao et al., 2001], то есть, вычисляя ЭК50 (эффективную концентрацию, при которой 50% ЛПС находится в связанном с пептидом состоянии). ЭК PG1, ChBa3.4, ChBac5 находится в диапазоне 2.5 - 5 х 10-6 М, мини-бактенецины демонстрируют несколько более низкую активность (Табл. 4).

Таблица 4. Липополисахарид-связывающая активность пептидов Более детально исследована ЛПС-связывающая активность PG1 поскольку она наиболее выражена. Установлено, что более эффективно PG1 связывается с липидом А, входящим в состав молекулы ЛПС E.coli, по сравнению с полноразмерным липополисахаридом (ЭК50 = 1.1 х 10-7 М). По предположению N. Schiller и R. Lehrer [2001], PG электростатически связывается с двумя отрицательно заряженными фосфатными группами, в остатках глюкозамина, входящих в состав липида А. Изучение ЛПС-связывющей активности протегрина оказалось важным для понимания причин устойчивости некоторых бактерий к его антимикробному действию. Хотя спектр активности пептида широк, существуют некоторые бактерии, устойчивые к его действию. К числу таких микроорганизмов принадлежит Burkholderia cepacia, бактерия, которая обнаруживается в легких больных муковисцидозом, хронической гранулематозной болезнью, что считают одной из причин неблагоприятного исхода этих заболеваний [Govan, Deretic, 1996; Speert, 2001].

Минимальная ингибирующая концентрация PG1 для этой бактерии составляет 32 мкМ, в то время как его МИК для большинства других бактерий находится в диапазоне 1-3 мкМ.

Чтобы получить информацию о причине устойчивости бактерии к действию протегрина нами было исследовано связывание пептида с поверхностью бактериальных клеток. В экспериментах применяли меченый I125 аналог PG1, для сравнения использовали Pseudomonas aeruginosa – бактерию, чувствительную к действию PG1. При инкубации меченного I125 PG1' с B. cepacia или P.aeruginosa в течение часа количество молекул пептида на одну бактерию значительно выше для P.aeruginosa, чем для B.cepacia при концентрации