На правах рукописи

ПАНЬКОВ

Александр Сергеевич

МИКРОБИОЦЕНОЗ ДЫХАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

И МЕЖМИКРОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

ПРИ ГРИППЕ

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Оренбург – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Усвяцов Борис Яковлевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Габидуллин ГБОУ ВПО «Башкирский Зайнулла Гайнулинович государственный медицинский университет», Минздрава России доктор медицинских наук, доцент, Черкасов ИКВС УрО РАН Сергей Викторович доктор медицинских наук, профессор, Потатуркина-Нестерова ФГБОУ ВПО «Ульяновский Наталия Иосифовна государственный университет»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Челябинская Государственная Медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «25» апреля 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, в конференц-зале (аудитория №205), тел. (3532) 40-35-62, факс: (3532) 77-24e-mail: [email protected], официальный сайт: http://orgma.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА.

Автореферат разослан « »2013 г, автореферат и текст объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации в сети интернет « » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Немцева Наталия Вячеславовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Проблема гриппа - одна из актуальных научных проблем последнего столетия. Многоликость и непредсказуемость этой инфекции обусловлена множеством подтипов основного возбудителя - вируса гриппа A и его чрезвычайной изменчивостью. (Киселев О.И., Цыбалова Л.М., 2005). Трудности в борьбе с гриппозной инфекцией обусловлены многими факторами, прежде всего неполной картиной патогенеза и выраженными микробиологическими нарушениями на слизистых оболочках верхних дыхательных путей, которые ухудшают развитие заболевания и приводят к возникновению бактериальных осложнений.

Роль микрофлоры дыхательных путей в развитии бактериальных осложнений очевидна, хотя и не совсем ясна. Изучению микробной экологии дыхательных путей в последние годы уделяли достаточно большое внимание (Сологуб Т.В., Ледванов М.Ю., Малый В.П. и соавт., 2009). К сожалению, в большинстве публикаций нет четких указаний, какие отделы дыхательного тракта подвергались исследованию (Ермолина Г.Б., 2003). Немногочисленные публикации последних лет описывают состояние микробиоценоза верхних дыхательных путей при острых и хронических бактериальных процессах, а изменения микрофлоры респираторного тракта при гриппе подробно не рассматривалось (Миронов А.Ю. и соавт., 2000; Вавилова В.П. и соавт., 2002).

Формирование инфекционного процесса зависит не только от взаимодействия возбудителя заболевания с макроорганизмом, но и от особенностей симбиоза бактерий и вирусов, обитающих в нем (Medzhitov R., Janeway C., 2000).

Большинство исследователей считают, что вирусо-бактериальные инфекции протекают значительно тяжелее, чем вирусные или бактериальные (Adam H., 2007).

Частое сочетанное течение вирусных и бактериальных инфекций создает большие трудности в оценке роли микробных ассоциаций при инфекционном процессе. При гриппе эта проблема стоит остро, так как основную группу осложнений составляют бактериальные инфекции (McCullers J.A., 2003).

Малоизученными остаются межбактериальные и особенно вирусобактериальные взаимодействия, открывающие одну из сторон возникновения бактериальных осложнений при гриппе.

В литературе нет единого представления о механизмах влияния бактерий на вирусы и вирусов на бактерии. Есть лишь единичные работы, которые касаются выделения ассоциаций вирусов и бактерий из того или иного биотопа (Набока Ю.Л., 2006, Колобухина Л.В., 2001).

В связи с этим особое значение приобретает изучение межмикробных взаимодействий при гриппе, которое позволит раскрыть определенные звенья механизма развития бактериальных осложнений и разработать методы их прогнозирования.

Указанный комплекс нерешенных проблем определяет актуальность проведенных исследований.

Цель исследования: изучить изменения микрофлоры дыхательных путей при гриппе с учетом межмикробных взаимодействий для прогнозирования течения заболевания и развития бактериальных осложнений.

Задачи исследования:

Оценить количественные и качественные изменения бактериальной микрофлоры верхних дыхательных путей при гриппе.

Выявить особенности межбактериальных взаимодействий в условиях ассоциаций микробиоценоза верхних дыхательных путей при гриппе.

Изучить особенности вирусо-бактериальных взаимодействий в условиях ассоциации.

Определить роль межмикробных взаимодействий в патогенезе бактериальных осложнений при гриппе.

Разработать способ прогнозирования бактериальных осложнений с учетом особенностей межмикробных взаимодействий в биоценозе верхних дыхательных путей.

Научная новизна. Проведено комплексное изучение микросимбиоценоза верхних дыхательных путей с учетом экспрессии факторов патогенности и персистенции. Выявлен высокий патогенный и персистентный потенциал микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек верхних дыхательных путей больных гриппом.

Выявлено, что микросимбиоценоз верхних дыхательных путей при гриппе характеризуется более сложной популяционной структурой и менее сопряженными связями в ассоциациях, чем микросимбиоценоз верхних дыхательных путей здоровых людей.

Показаны различия в таксономическом составе и экспрессии факторов патогенности микрофлоры верхних дыхательных путей при гриппе А/Оренбург/4/2009 (H1N1)v и сезонном гриппе.

Анализ результатов исследования микросимбиоценоза верхних дыхательных путей выявил особенности межбактериальных взаимодействий при гриппе. Микроорганизмы, выделенные со слизистых оболочек верхних дыхательных путей от больных гриппом, реже образовывали ассоциации, чем микроорганизмы, выделенные из биоценоза верхних дыхательных путей здоровых людей. У больных с бактериальными осложнениями микроорганизмы верхних дыхательных путей чаще формировали ассоциации, чем микрофлора верхних дыхательных путей при гриппе без осложнений. Выявлена модификация свойств выделенных микроорганизмов в условиях бактериальной ассоциации. Показано, что в ассоциации микроорганизмы верхних дыхательных путей у больных гриппом активно влияют друг на друга, стимулируя факторы патогенности и персистенции.

Получены новые знания по микросимбиоценозу верхних дыхательных путей при гриппе с учетом изменения свойств симбионтов в условиях вирусобактериальных ассоциаций. Обнаружено взаимное влияние вируса гриппа В и Staphylococcus aureus в вирусо-бактериальной ассоциации на культуре клеток MDCK. Установлено повышение факторов патогенности как S. aureus, так и вируса гриппа в условиях вирусо-бактериальной ассоциации.

Проведенные исследования позволили подобрать методический ключ к изучению модификации свойств бактерий и вирусов на модели вирусобактериальной ассоциации и рассматривать патогенез гриппа, учитывая роль симбиоза вирусов и бактерий в реализации механизмов постгриппозных осложнений.

Разработан способ прогнозирования бактериального осложнения после гриппа (Патент РФ № 2452960).

Впервые с микробиологических позиций расширено представление о течении гриппа и механизме развития бактериальных осложнений после гриппа.

Получен патент РФ на изобретение № 2452960 «Способ прогнозирования развития бактериального осложнения стафилококковой этиологии после гриппа».

Практическая ценность работы заключается в обосновании целесообразности использования полученных данных о микросимбиоценозе верхних дыхательных путей с учетом особенностей межмикробных взаимодействий при гриппе для прогнозирования бактериальных осложнений, что позволит уменьшить их количество и длительность течения заболевания.

Внедрение результатов исследования в практику По результатам исследования разработано информационно-методическое письмо «Прогнозирование бактериальных осложнений стафилококковой этиологии при гриппе» (Министерство здравоохранения Оренбургской области, 4.07.2011), которое распространено по территории Оренбургской области.

Предложенные в нем практические рекомендации используются в работе врачей МБУЗ «ГКИБ» г. Оренбурга (акт внедрения от 20.08.2012 г.) и вирусологической лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области" (акт внедрения от 20.08.2012 г.).

Результаты работы включены в программу обучения студентов Оренбургской государственной медицинской академии на кафедрах микробиологии и эпидемиологии и инфекционных болезней (акты внедрения от 27.08.2012 г.).

Для гриппозной инфекции в остром периоде заболевания характерны значительные нарушения микросимбиоценоза верхних дыхательных путей, которые проявляются изменением таксономического состава микрофлоры, повышением уровня экспрессии факторов патогенности и персистенции.

Вирусо-бактериальные взаимоотношения при гриппе in vitro и in vivo характеризуются взаимным усилением факторов патогенности и персистенции ассоциантов, что способствует дисбиозу верхних дыхательных путей с преобладанием патогенной флоры и развитию бактериальных осложнений.

Усиление экспрессии факторов патогенности вируса гриппа и золотистого стафилококка в ассоциации является важным звеном патогенеза заболевания и может быть использовано для прогнозирования его течения.

Основные материалы диссертационного исследования доложены на:

шестой Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов», г. Оренбург, 2009; Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, г. Москва, 2009, 2010, 2011; V Международной Пироговской научной медицинской конференции, г. Москва, 2010; VIII межрегиональной научнопрактической конференции эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов и паразитологов, г. Оренбург, 2010; в комиссии по внедрению новых достижений в практику здравоохранения при министерстве здравоохранения Оренбургской области, г. Оренбург, 2011; VIII mezinrodni vdecko – praktick conference «Dny vdy – 2012», Praha, 2012.

Основные результаты диссертации опубликованы в 22 печатных работах, из которых 11 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, а также 1 патент РФ на изобретение и информационно-методическое письмо.

Диссертация изложена на 241 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована таблицами и 56 рисунками. Библиографический указатель содержит отечественных и 174 зарубежных источников.

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательной учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации согласно плана НИР (№ государственной регистрации темы 0120.0 809351).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для выполнения поставленной цели были сформированы 2 группы людей. Первую группу составили (n-318) больные гриппом, в трудоспособном возрасте от 17 до 60 лет. Из них 278 больных эпидемическим гриппом, а 40 больные гриппом А/Оренбург/4/2009 (H1N1)v. Вторую группу (n-37) составили здоровые люди, у которых последние 2 месяца не было острых заболеваний и обострений хронических заболеваний. Больные гриппом находились на лечении в МБУЗ ГКИБ г. Оренбурга.

Диагноз «Грипп» ставился на основании анамнестических, эпидемиологических, клинических данных. Помимо клинического обследования всем больным проводились рутинные методы лабораторной диагностики: общий анализ крови (ОАК), общий анализ мочи (ОАМ). Диагноз гриппа подтверждался вирусологически, путем забора материала из носа и зева, его посева в культуру клеток MDCK и выделения вируса гриппа, а также постановкой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) с использованием меченых флюорохромом специфических противогриппозных антител1.

Больным по показаниям проводилось инструментальное обследование:

рентгенография органов грудной клетки, электрокардиография (ЭКГ), ультразвуковое исследование внутренних органов (УЗИ).

Выделение и идентификация вируса гриппа проводилось в вирусологической лаборатории Федерального государственного учреждения здравоохранении «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области»

при консультировании заведующего вирусологической лаборатории Скворцова В.О.

Было изучено 653 штаммов микроорганизмов, выделенных со слизистой оболочки носа и слизистой оболочки миндалин, из которых микроорганизмов выделено от больных гриппом, а 123 - от здоровых людей.

Выделение и идентификацию штаммов проводили на основании общепринятых методов (Биргер М.О., 1982; Шапиро А.В. с соавт., 1984).

Дальнейшая идентификация до вида проводилась с помощью дифференциально-диагностических тест-систем STAPHYtest, STREPTOtest, ENTEROtest, NEFERMtest (LaChema, Чехия)1. У выделенных микроорганизмов изучали факторы патогенности (гемолитическую, лецитовителлазную активности), колонизации (лизоцимную активность) и персистенции (антилизоцимную активность) по общепринятым методикам (Биргер М.О., 1982; Бухарин О.В. с соавт., 1999). Для группировки таксонов выделенной микрофлоры использовался метод кластерного анализа, позволяющий определить близость бактерий в ассоциациях (Мандель И.Д., 1988). Степень сопряженности связей бактерий в ассоциациях определяли с помощью коэффициента Жаккара, являющегося наиболее достоверным показателем экологического сходства различных видов микроорганизмов: q = c x l00 / (а + b - с), где с - число выборок, содержащих оба таксона; а - число выборок, содержащих один таксон; b -число выборок, содержащих другой таксон (Зубков М.Н., 1995).

Для изучения факторов патогенности в условиях межбактериальных взаимодействий был использован метод перекрестного посева штаммовсимбионтов (Хуснутдинова Л.М., 2004)2. Для изучения вирусо-бактериальных взаимодействий была разработана экспериментальная модель (Патент РФ от 10.06.2012, № 2452960). Изучено взаимодействие вируса гриппа В и S. aureus in vitro (в культуре клеток). Было изучено 40 штаммов S. aureus, выделенных со слизистой оболочки верхних дыхательных путей больных гриппом людей.

Тампон с исследуемым материалом (слизистый секрет из носоглотки больного гриппом) засевали на чашки Петри с 5% кровяным агаром методом секторов по Gould, выделяли чистую культуру S. aureus (Методические рекомендациями по выделению и идентификации бактерий рода Staphylococcus. - Москва, 1990).

У выделенных штаммов S. aureus определяли по известным методикам гемолитическую активность (ГА) и антилизоцимную активность (АЛА). Вирус гриппа В выделялся в период эпидемического сезона.

Выделение и идентификация микроорганизмов проводилась автором совместно с сотрудниками бактериаологической лаборатории МБУЗ ГКИБ г. Оренбурга, заведующая лабораторией А.Р. Миронова.

Микробиологические исследования проведены автором в лаборатории экологии микроорганизмов ИКВС УрО РАН, руководитель – д.м.н., профессор Б.Я. Усвяцов Выделенные изоляты вируса гриппа В хранились в вирусологической лаборатории в замороженном состоянии при – 200С в течение 1 года (до начала следующего эпидемического сезона) и общедоступны для различных исследований (Методические рекомендации «Выделение вируса гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация, 2006).

Модель ассоциации вируса гриппа В и S. aureus воспроизводили на культуре клеток MDCK. На первом этапе формировали монослой клеток MDCK.

Ростовая среда готовилась по общепринятой методике: к 19 мл среды DMEM (без сыворотки) добавляли 0,5 мл бычьего альбумина (V фракция), 0,5 мл 1 M HEPES-буфера, 0,4 мл TPCK-трипсина (до конечной концентрации 2,0 мкг/мл).

TPCK-трипсин из 1 ампулы предварительно регидратировали в 2 мл стерильной дистиллированной воды и добавляли в среду в указанном выше количестве.

В подготовленную среду добавляли 30 мкл концентрированного раствора пенициллина и стрептомицина. Затем к 1 мл взвеси клеток MDCK (в концентрации 400 тыс. клеток/мл) добавляли 2 мл ростовой среды. Для формирования монослоя клеток MDCK пробы инкубировали в термостате 48 часов при 37 0С.

Затем ростовую среду сливали и 2-3 раза отмывали средой DMEM, после чего среду DMEM удаляли. Параллельно готовили опытную и контрольную пробы.

В опытной пробе и контроле в монослой клеток MDCK вносили 0,1 мл вируса гриппа В в концентрации 4 агглютинирующие единицы (АЕ) на 1 мл 1 % суспензии эритроцитов. Для адсорбции вируса на культуре клеток MDCK пробы инкубировали в термостате 60 минут при 370С. В контроле в монослой клеток MDCK вместо вируса добавляли 0,1 мл физиологического раствора и также инкубировали 60 минут в термостате при 370С. Затем в опытную пробу и контроль 1 добавляли 0,1 мл 106 взвеси S. aureus и 1 мл среды DMEM, поддерживающей рост культуры клеток. При добавлении к 0,1 мл 106 КОЕ/мл взвеси S. aureus 1 мл среды DMEM получается конечная концентрация стафилококка 1х106 КОЕ/мл. Опытную и контрольные пробы инкубировали 48 часов при 370С. После cоинкубирования в опыте и контроле определяют у S. aureus гемолитическую и антилизоцимную активность. У вируса гриппа были определены гемагглютинирующая способность вируса, цитопатическое действие (Методические рекомендациями по выделению и идентификации бактерий рода Staphylococcus. - Москва, 1990) и способность к репродукции. Количественное определение вируса гриппа проводили методом ПЦР в режиме реального времени аппаратом Rotor Gene 6000 (Инструкция по применению набора реагентов для выявления РНК вируса гриппа А (Influenza virus A) и гриппа В (Influenza virus B) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Influenza virus A/BFL. Утверждена приказом Росздравнадзора от 05.06.09. № 4481-Пр/09)1.

Для оценки эффективности способа прогнозирования осложнений после гриппа проведено обследование 85 больных, у которых выделен S. aureus со слизистой оболочки верхних дыхательных путей.

Для проведения клинической апробации предложенного способа прогнозирования бактериальных осложнений после гриппа была изучена микрофлора верхних дыхательных путей и мокроты, выделенная от больных пневмонией осложнившей грипп, и проведен сравнительный анализ с микрофлорой верхних дыхательных путей больных гриппом без бактериальных осложнений. Было исследовано 12 больных постгриппозной пневмонией. Забор материала со слизистой ротоглотки проводился с помощью стерильного тампона на 1-2 день заболевания. Мокроту у больных собирали с момента ее появления (на 4-5 день болезни) согласно методическим рекомендациям (МУ 4.2.2039-05 «Методы контроля.

Биологические и микробиологические факторы. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории». – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2006). Пневмония подтверждалась рентгенологически.

Было обследовано 13 больных людей с первичной внебольничной пневмонией, от которых со слизистых оболочек верхних дыхательных путей выделено 34 штамма микроорганизма.

Данные по видовому составу и биологическим свойствам микрофлоры верхних дыхательных путей были подвергнуты статистической обработке в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Exel 2003 и лицензионных программ «Биостат» (Гланц С, 1999) путем подсчета средней арифметической (М) и средней ошибки средней арифметической (m), среднеквадратичного отклонения () и показателей достоверности различий с помощью вычисления критерия Стьюдента (t) с последующим