WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ПОДОСОКОРСКАЯ ОЛЬГА АНДРЕЕВНА

НОВЫЕ АНАЭРОБНЫЕ ТЕРМОФИЛЬНЫЕ

ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

Специальность 03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель: Бонч-Осмоловская Елизавета Александровна доктор биологических наук

Официальные оппоненты: Горленко Владимир Михайлович доктор биологических наук, профессор, ИНМИ РАН, Зав. лабораторией Щербакова Виктория Артуровна кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (ИБФМ РАН), Зав. лабораторией Московский государственный университет

Ведущая организация:

им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

Защита состоится «20» февраля 2013 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 при ИНМИ РАН по адресу: 117312, Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН

Автореферат диссертации разослан « » января 2013 г.

Ученый секретарь Хижняк Т.В.

диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Целлюлоза - основной компонент клеточных стенок растений, является самым распространенным (исключая ископаемые ресурсы) источником органического углерода на Земле (Coughlan, 1990). Кристаллическая структура целлюлозы обуславливает ее исключительную устойчивость к различным внешним факторам среды и необходимость синергетического действия нескольких типов гидролитических ферментов (целлюлаз) для ее полного гидролиза. Тем не менее, в природе происходит эффективная деструкция целлюлозы за счет деятельности грибов и бактерий, которые участвуют, таким образом, в минерализации органического вещества и глобальном цикле углерода. При этом доступность кислорода, по всей видимости, играет одну из ключевых ролей в стратегии разложения целлюлозы микроорганизмами. В аэробных условиях значительная роль в этом процессе принадлежит грибам, хотя среди аэробных бактерий также есть целлюлолитические представители (Cellulomonas fimi, Streptomyces cellulolyticus и др.). Аэробные целлюлолитики характеризуются высокими урожаями клеток и наличием неассоциированных целлюлазных систем (Рабинович и Мельник, 2000). В анаэробных условиях целлюлозу расщепляют, как правило, бактерии, которые синтезируют мультидоменные гидролитические ферменты, связанные с клетками, либо надмолекулярные комплексы – целлюлосомы. В то же время открытым остается вопрос о способности факультативно анаэробных микроорганизмов разлагать целлюлозу, поскольку за исключением нескольких мезофильных бактерий - Cellulomonas terrae (An et al., 2005), Telmatobacter bradus (Pankratov et al., 2012) для абсолютного большинства представителей этой физиологической группы рост на целлюлозе не показан.

Работы по изучению целлюлолитических микроорганизмов были начаты еще в середине прошлого века. Однако повышенный интерес к данной группе был вызван топливным кризисом 70-х гг., поскольку низкая себестоимость и повсеместное присутствие целлюлозного сырья делает его доступным ресурсом для производства топлива (Lynd et al., 2002). С тех пор был изучен целый ряд мезофильных и термофильных микроорганизмов, способных с разной степенью эффективности гидролизовать целлюлозу (Beguin et al., 1994; Schwarz, 2000; Blumer-Schuette et al., 2008). К настоящему времени целлюлазы уже нашли успешное применение во многих отраслях промышленности и сельском хозяйстве (Hongpattarakere, 2002;

Sukumaran et al., 2005). Вместе с тем, использование именно термофильных представителей и их термостабильных ферментов позволяет избежать загрязнения нежелательной микрофлорой (Vielle & Zeikus, 2001). Кроме того, воздействие высоких температур способствует увеличению доступности трудногидролизуемых нерастворимых веществ (Niehaus et al., 1999) и делает возможным проведение консолидированной биообработки сырья (Consolidated Bioprocessing, CBP, Lynd et al., 2002).

К началу наших исследований большинство описанных термофильных целлюлолитических бактерий относились к типам Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes. Среди архей рост на целлюлозе был показан только для одного гипертермофильного представителя – Desulfuroccocus fermentans (Perevalova et al., 2005). Помимо изучения биоразнообразия целлюлолитических микроорганизмов, многочисленные исследования, проводимые в настоящее время, направлены на попытки увеличения скорости и эффективности микробного разложения целлюлозы. У ряда микроорганизмов исследована структура и функции отдельных ферментов и целлюлазных систем в целом, проведено клонирование и экспрессия целлюлаз (Zverlov et al., 1998; Berger et al., 2006; Raman et al., 2009; Olson et al., 2010). Однако фундаментальное понимание процесса микробного разложения целлюлозы остается неполным, а энергетические проблемы - нерешенными (Lynd et al., 2002).



Вышесказанное свидетельствует об актуальности изучения термофильных целлюлолитических микроорганизмов как с научной, так и с прикладной точек зрения. В то же время данные о малом количестве культивируемых прокариот относительно их общего числа (Amann et al., 1995) и недостаточная изученность микробного разнообразия термальных мест обитания прямо указывают на возможность выделения новых термофильных целлюлолитических микроорганизмов. Они, в свою очередь, могут прояснить роль этой группы в занимаемых эконишах и оказаться потенциальным источником ценных ферментов.

Цели и задачи исследования Целью работы было обнаружение, выделение и характеристика новых термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов и их ферментов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) изучение разнообразия термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов из различных термальных местообитаний;

2) характеристика новых термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов;

3) первичная характеристика целлюлолитической активности у представителей новых таксонов.

Научная новизна и практическая значимость работы Из наземных, подземных и морских термальных мест обитания было выделено 30 штаммов анаэробных целлюлолитических прокариот, относящихся к различным таксонам. Из них 26 штаммов оказались термофильными организмами.

Описаны новые виды экстремально термофильных целлюлолитических бактерий типа Thermotogae – Thermosipho affectus sp. nov. и Fervidobacterium riparium sp. nov.

Для представителей данных родов способность к росту на целлюлозе была показана впервые. Для представителей типа Thermotogae в целом впервые был продемонстрирован рост на микрокристаллической целлюлозе.

Выделена новая умеренно термофильная целлюлолитическая бактерия ‘Melioribacter roseus’ gen. nov., sp. nov., отнесенная к новому семейству ‘Melioribacteraceae’. Предложен новый тип ‘Ignavibacteriae’, включающий класс Ignavibacteria, порядок Ignavibacterales и два семейства ‘Melioribacteraceae’ и Ignavibacteraceae.

Описан новый род термотолерантной бактерии – Ornatilinea apprima gen. nov., sp.

nov. Впервые показан рост на целлюлозе, в том числе микрокристаллической, у представителей класса Anaerolinea типа Chloroflexi.

Частично охарактеризованы штаммы анаэробных целлюлолитических бактерий родов Thermotoga, Caldicellulosiruptor и Clostridium, представляющие новые виды.

Кроме того, получены новые штаммы ряда известных целлюлолитических микроорганизмов, расширяющие представления об их распространении и физиологии.

В результате работы создана коллекция анаэробных целлюлолитических микроорганизмов (30 штаммов 22 видов), способных разлагать целлюлозу и другие полисахариды в широком диапазоне температуры (20 - 92°С), рН (5.0 – 9.5) и солености среды (0 - 8%). Новые микроорганизмы являются продуцентами термостабильных целлюлаз, которые могут быть устойчивы и к действию других физико-химических факторов.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о большом разнообразии термофильных целлюлолитических микроорганизмов, которые могут играть существенную роль в процессах разложения целлюлозы в природе при высоких температурах, и демонстрируют, что способность разлагать целлюлозу широко распространена у представителей различных филогенетических групп.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на международных конференциях “Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles 2010”, “Extremophiles 2010”, “Thermophiles 2011”, “Extremophiles 2012”, “ISME 2012”, “Copper in Biology 2012”, а также на Конкурсе научных работ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН в 2011 году и Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» в 2010 и 2012 году.

Публикации Материалы диссертации опубликованы в 17 печатных работах: экспериментальных статьях, 1 коллективной монографии и 11 тезисах конференций.

Место проведения работы и благодарности Основная работа выполнялась в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук.

Секвенирование последовательностей полных геномов и генов 16S рРНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре «Биоинженерия» РАН.

Электронную микроскопию чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и ИБФМ РАН (г. Пущино). Определение хинонов проводили в ИБФМ РАН (г. Пущино).

Состав жирных кислот и фосфолипидов проводили в РГУ нефти и газа им. И.М.

Губкина.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. БончОсмоловской Е.А. и к.б.н. Кубланову И.В. за практическую помощь, ценные советы, полезную критику и постоянное внимание на всех этапах выполнения работы.

Также автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам, принимавшим активное участие в работе на разных ее этапах.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и включает 43 рисунка и 12 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы, результаты исследований и их обсуждение, выводов и списка литературы, который включает 300 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследования служили термофильные целлюлолитические микроорганизмы, выделенные из наземных горячих источников кальдеры Узон, Долины гейзеров, Паужетки (Камчатка), Байкальского региона, Кунашира (Курильские о-ва), о-ва Сан-Мигель (Азоры, Португалия); глубоководных морских гидротерм (бассейн Гуаймас и Срединно-Атлантический хребет); глубинных термальных мест обитания (скважины Томской области и г. Кисловодск).

Получение первичных накопительных культур целлюлолитиков Накопительные культуры в источниках получали путем инкубации флаконов с добавленной в них целлюлозой, как это было описано ранее (Kublanov et al., 2009).

Время инкубации составляло от 1 до 7 суток. В лабораторных условиях накопительные культуры получали путем анаэробного внесения образцов воды, осадков или матов (0.5 мл) в пробирки Хангейта, содержащие минеральную среду. В качестве субстратов использовали различные типы целлюлозы: фильтровальную бумагу (ФБ), опилки, аморфную (АМЦ), микрокристаллическую (МКЦ) или карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). Посевы инкубировали при температуре и рН, близких к таковым в источниках.

Накопительные и чистые культуры целлюлолитических микроорганизмов культивировали на минеральных средах, описанных в публикациях (2, 3, 4) с добавлением дрожжевого экстракта (0.05-0.1 г/л) в качестве источника факторов роста. Органические субстраты добавляли в концентрации 20 мМ или 2 г/л.

Растворимые акцепторы электронов вносили в концентрации от 2 до 10 мМ непосредственно перед инокуляцией, а элементную серу (5 г/л) и оксид Fe(III) ( мМ) - перед стерилизацией. Среду готовили аэробно и разливали в пробирки с ватными пробками либо анаэробно. В последнем случае среду с резазурином (0. г/л) кипятили, охлаждали под током чистого N2 и добавляли Na2S*9H2O (0.3 г/л), в качестве восстановителя. рН доводили до нужного значения 6 н растворами HCl или NaOH, после чего под током азота среду разливали по пробиркам и герметично закрывали пробками из бутиловой резины. Стерилизацию сред проводили при 1 или 0.5 (при наличии в среде S0) ати. Среду с аморфным оксидом железа готовили без добавления восстановителя и резазурина.

Получение чистых культур.

Чистые культуры целлюлолитиков получали анаэробно, методом предельных разведений в жидкой среде, либо выделением отдельных колоний на агаровых столбиках (1.5-2.5%) с использованием КМЦ и МКЦ в качестве субстрата. Чистоту культур проверяли микроскопически, а также геносистематическими методами.

Микроскопия.

Наблюдение за ростом и подсчет клеток проводили с помощью светового микроскопа Микмед-1 (ЛОМО, Россия) и Olympus CX-41 (Япония). При наличии в среде Fe(III) его нерастворимые в воде формы растворяли в оксалатном буфере (Гаврилов и др., 2003), разведение учитывали при подсчете. Тонкое строение клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963), с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Япония).

Целлюлазная активность.

Целлюлазную активность коллекционных и выделенных в данной работе штаммов детектировали на агаризованных средах и методом зимографии с использованием красителя Конго красного. Определение концентрации редуцирующих сахаров, высвободившихся в ходе гидролиза целлюлозы, определяли динитросалициловым методом (ДНС, DNS).

Хемотаксономические методы Состав жирных кислот, фосфолипидов и хинонов чистых культур микроорганизмов определяли, как это описано в публикации (5).

Геносистематические методы.

Выделение ДНК проводили согласно Park, 2007. Очистку ПЦР продуктов из реакционной смеси или агарозного геля проводили с помощью коммерческого кита фирмы Евроген (Россия). Содержание Г+Ц пар оснований в ДНК определяли по кривым плавления (Marmur & Doty, 1962) или по данным анализа полного генома.

ДНК-ДНК гибридизацию проводили методом оптической реассоциации (De Ley et al., 1970). Амплификацию генов 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ) и секвенирование полученных ампликонов проводили согласно описанным ранее методикам (Kublanov et al., 2009). Сравнение генов 16S рРНК с последовательностями, представленными в базах данных GenBank и EzTaxon server (Kim et al., 2012), проводили с помощью алгоритма BLAST (Altshul et al., 1990).

Построение филогенетических дендрограмм проводили с помощью различных алгоритмов, заложенных в программах MEGA 4 и MEGA 5.05 (Tamura et al., 2007, 2011) и ARB (Ludwig et al., 2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разнообразие анаэробных целлюлолитических прокариот и первичная Поиск и выделение термофильных целлюлолитических микроорганизмов проводили, используя в большинстве случаев образцы свежих проб и полевые накопительные культуры, полученные в ходе рейсов и экспедиций в 2008-2012 гг. в области с высокой геотермальной активностью – Камчатка, Кунашир, Байкальская рифтовая зона, Азорские острова, Срединно-Атлантический хребет, бассейн Гуаймас (Табл. 1). Кроме того, для посева использовались свежие образцы воды из нефтепоисковых скважин Томской области (отбор в 2009 и 2012 гг.), а также две пробы осадков, отобранные ранее (экспедиции 2005 г. на о-в Кунашир и 2003 г. в Байкальский регион). Как правило, выбор проб для выделения целлюлолитических микроорганизмов определялся наличием в месте отбора высшей растительности с признаками ее активного разложения либо мощных микробных обрастаний.

Первичную оценку роста и активности целлюлолитических прокариот в накопительных культурах проводили, учитывая урожай клеток при росте на различных типах целлюлозы и используя метод зимографии для определения активности целлюлаз, вырабатываемых микроорганизмами. В последнем случае в качестве положительных контролей были использованы экстремально термофильные целлюлолитические микроорганизмы Dictyoglomus thermophilum, штамм 1445d и Caldicellulosiruptor kronotskyensis штамм 2002, выделенные ранее в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ.

В результате для ряда накопительных культур методом зимографии была продемонстрирована активность эндоглюканаз, что в дальнейшем способствовало выделению из них чистых культур целлюлолитиков. Так, например, связанные с клетками целлюлазы удалось детектировать в полевых накопительных культурах 2319opik, 2310opik и 2307opik, полученных непосредственно в горячих источниках о-ва Кунашир в 2011 г. (Рис. 1). В лабораторных условиях из них были выделены штаммы целлюлолитических бактерий родов Caldicellulosiruptor, Fervidobacterium, Dictyoglomus (Табл. 1). Стоит отметить, что в целом, для накопительных культур была характерна высокая активность в образцах клеток и значительно меньшая в супернатанте, что хорошо соотносится с литературными данными об ассоциированности целлюлаз большинства анаэробных прокариот с клетками (Lynd et al., 2002). Кроме того, характерным было то, что детектируемые методом зимографии эндоглюканазы обладали более высоким оптимумом активности по сравнению с вырабатывающими их продуцентами. Наглядным примером может служить штамм 2319opik, для которого нами было показано, что вырабатываемые эндоглюканазы, ассоциированные с клеточными стенками, активны при температуре 85С, а максимум роста для штамма – 75С. Более того, после прогревания при 96С в течение 10 мин активность данных ферментов снижалась незначительно. Тем не менее, после прогревания при 96оС в течение 30 мин ферменты инактивировались полностью. (Рис. 2). Таким образом, исследование целлюлазной активности накопительных культур и выделенных в данной работе штаммов термофильных микроорганизмов позволило обнаружить ряд закономерностей и показало эффективность использования метода зимографии как ценного инструмента выявления наиболее активных целлюлолитических агентов.

Рисунок 1. Зимограмма. Субстрат КМЦ. Инкубация 2 часа, при 75°C в 40 мМ Трис, рН 8.8, 5 мМ CaCl2.

Всего из образцов воды, осадков и матов различных по физико-химическим характеристикам термальных источников удалось выделить 30 штаммов анаэробных микроорганизмов, способных расти на целлюлозе и ее производных (Табл. 1). По физиологии они существенно отличались между собой: среди них присутствовали мезофильных (оптимум роста в области умеренных температур) бактерии и термофильных (оптимум роста выше 50°С) прокариот, в том числе 6 штаммов гипертермофильных (оптимум роста выше термофильных (оптимум роста выше 65°С) и 2 штамма умеренно термофильных микроорганизмов. Большинство изолятов принадлежали к группе строгих анаэробов, однако, для 2 штаммов был характерен факультативно анаэробный образ жизни. По отношению к рН среди выделенных ацидофильные, нейтрофильные, а также слабо алкалофильные представители. С точки зрения филогении полученные штаммы относились к 6 глубоким Инкубация 1 час, при 85°C в 50 мМ МОПС, филогенетическим линиям - археям типа рН 7.43, 5 мМ CaCl2. Образцы прогревали Crenarchaeota и бактериям типов при 96°С в течение 30 мин либо не Thermotogae, Dictyoglomi, Firmicutes, прогревали.

Chloroflexi и нового типа – ‘Ignavibacteriae’.

Таблица 1. Основные характеристики штаммов, исследованных в данной работе.

– Сокращения: МКЦ – микрокристаллическая целлюлоза, КМЦ – карбоксиметилцеллюлоза, ФБ – фильтровальная бумага, АМЦ – аморфная целлюлоза, ВТП – Верхнее термальное поле - жирным шрифтом обозначены представители новых таксонов Гипертермофильные археи, выделенные на микрокристаллической и карбоксиметилцеллюлозе, принадлежали родам Desulfurococcus и Fervidicoccus.

Экстремально и гипертермофильные бактерии были представлены организмами, хорошо известными своими целлюлолитическими способностями (роды Caldicellulosiruptor, Dictyoglomus), а также бактериями порядка Thermoanaerobacterales, для которых ранее только в одной работе была показана способность расти на целлюлозе (Kublanov et al., 2009). Кроме того, из наземных, подземных и морских мест обитания были выделены умеренно термофильные и термотолерантные бактерии типа Firmicutes (Табл. 1), что расширяет наши представления о физиологии и распространении уже известных ранее организмов – Thermovenabulum gondwanense и Bacillus thermoamilovorans. Повсеместная распространенность бактерий этого типа и их способность расти в широком диапазоне температур (от 20 до 85°С) может свидетельствовать о существенном вкладе данных бактерий в процесс разложения органического вещества, в том числе целлюлозы, в анаэробных условиях.

Филогенетический анализ последовательностей генов 16S рРНК выделенных в работе целлюлолитических микроорганизмов показал, что 9 из 30 штаммов представляют новые таксоны разного уровня (Табл. 1). Все эти микроорганизмы принадлежали домену Бактерии и являлись представителями 4 типов. Новыми представителями типа Thermotogae оказались гипертермофильная бактерия ‘Thermotoga agilis’, штамм 1864opik и экстремально термофильная бактерия ‘Thermosipho activus’, штамм Rift-s3. Ближайшими родственными организмами для изолятов были Thermotoga hypogea (97% сходства по генам 16S рРНК) и Thermosipho atlanticus (96.5% сходства по генам 16S рРНК), соответственно. Оба штамма имели типичную для представителей родов морфологию и являлись строго анаэробными хемоорганогетеротрофными организмами, что характерно для всех Thermotogae. Однако в нашей работе впервые для представителей рода Thermotoga удалось продемонстрировать рост штамма 1864opik на микрокристаллической целлюлозе, а для представителей рода Thermosipho рост штамма Rift-s3 на хитине, пектине и ксилане.

Представителями новых таксонов типа Firmicutes оказались экстремально термофильный штамм 2310opik (ближайший родственник – Caldicellulosiruptor lactoaceticus, 97.8% сходства по генам 16S рРНК) и два термотолерантных штамма Р3М-3 и КК-282, для которых ближайшими родственниками оказались бактерии рода Clostridium - C. aminovalericum (94% сходства по генам 16S рРНК) и C.

phytofermentans (94% сходства по генам 16S рРНК), соответственно.

Для остальных 4 термофильных анаэробных целлюлолитических бактерий, которые к настоящему моменту валидно описаны нами как представители новых таксонов, подробные характеристики будут приведены ниже.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о большом разнообразии анаэробных термофильных целлюлолитических прокариот в различных термальных местах обитания. При этом в процессе разложения целлюлозы в диапазоне температур 45-92С принимают участие как бактерии, так и археи, хотя разнообразие целлюлолитических архей значительно уступает бактериальному.

Чистая культура ik275marT была выделена из накопительной культуры, полученной в ходе рейса R/V Revelle (июль-август 2008) в район Срединно-Атлантического хребта. Клетки штамма представляли собой короткие, неподвижные палочки, окруженные «чехлом» из внешней мембраны («тогой») (Рис. 3). Длина клеток варьировала в пределах 1.2-6.0 мкм, образование цепочек, содержащих до 11 клеток.

Клеточная стенка – грамотрицательного типа.

Образование спор не обнаружили.

Штамм ik275marT рос в интервале температуры от 37 до 75С, рН 5.6-8.2 и солености среды 10-55 г/л NaCl. Оптимальный рост штамма наблюдали при температуре 70С, рН 6.6 и концентрации 20 г/л NaCl (Рис. 4). Минимальное время удвоения в оптимальных условиях, при росте на мальтозе составляло 32 мин. Рост поддерживался как на восстановленной (с добавлением Na2S*9H2O), так и на невосстановленной среде.

Время удвоения, мин Рисунок 4. Зависимость скорости роста штамма ik275marT от температуры и рН.

Субстрат для роста – мальтоза. Линия тренда полиномиального типа.

Штамм ik275marT использовал для роста следующие субстраты: дрожжевой экстракт, мясной экстракт, глюкозу, мальтозу, сахарозу, крахмал, декстрин, МКЦ, КМЦ и фильтровальную бумагу (Рис. 5). Штамм сбраживал глюкозу до ацетата, молекулярного водорода и углекислоты. Элементная сера, сульфат и тиосульфат натрия не стимулировали рост штамма на МКЦ, в то время как сульфит натрия ингибировал его.

клетки/мл (*10 ) Филогенетический анализ, основанный на сравнении гена 16S рРНК исследуемого штамма и родственных организмов, показал, что он относится к роду Thermosipho и является новым видом этого рода – T. affectus sp. nov. (94,5% сходства по генам 16S рРНК) (Рис. 6). Содержание Г+Ц пар оснований в ДНК штамма составляло 27 мол %.

Рисунок 6. Филогенетическое положение штамма ik275marT и других представителей рода Thermosipho, определенное на основе сравнения генов 16S рРНК. Дендрограмма построена при помощи Neighbour-joining метода (Saitou & Nei, 1987). Thermotoga maritima, штамм MSB использован в качестве репера. Достоверность ветвления (bootstrap test) определяли при повторах.

Среди бактерий данного рода ранее не были описаны целлюлолитические представители, следовательно, нам удалось расширить представления о метаболических способностях представителей рода Thermosipho и разнообразии морских целлюлолитиков. Более того, в секвенированных геномах 2 штаммов разных видов (T. africanus и T. melanesiensis) не были обнаружены гены, кодирующие известные целлюлазы. Геном T. affectus в настоящее время находится в процессе секвенирования, и его последующий анализ позволит выявить гены, кодирующие целлюлазы и целлюлозосвязывающие домены, принимающие участие в процессе разложения целлюлозы.

накопительной культуры, полученной при посеве образца, отобранного с поверхности ветки, погруженной в горячий источник приливной зоны острова Кунашир – «Горячий пляж». Клетки штамма имели форму коротких, подвижных палочек, с характерными «вздутиями» клеточной стенки на одном конце микроскопия клеток штамма клетки (Рис. 7). Длина клеток варьировала в 1445tТ (ультратонкие срезы).

пределах 1.0-3.0 мкм и достигала 6 мкм при Шкала, 1 мкм.

росте культуры в щелочных условиях (рН 9.0).

Ширина клеток составляла 0.4-0.5 мкм. Можно было также наблюдать образование цепочек, содержащих до 17 клеток. Изолят 1445tT рос в пределах температуры 46С, рН 5.7-9.0 и солености среды менее 20 г/л NaCl. Оптимальный рост штамма наблюдали при температуре 65С, рН 7.8 (Рис. 8) и в отсутствие NaCl в среде.

Минимальное время удвоения в оптимальных условиях, при росте на глюкозе составляло 55 мин.

Время удвоения, ч Рисунок 8. Зависимость скорости роста штамма 1445T от температуры и рН. Субстрат для роста – КМЦ. Линия тренда полиномиального типа.

Штамм 1445tT рос только в анаэробных условиях и использовал следующие субстраты: пептон, дрожжевой экстракт, пируват, глюкозу, ксилозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, целлобиозу, крахмал, ксилан, МКЦ, КМЦ, аморфную целлюлозу, фильтровальную бумагу и березовые опилки (Рис. 9). Продуктами брожения при росте на глюкозе штамма 1445tT были ацетат, молекулярный водород и углекислый газ. Также были детектированы следы пропионата, бутирата и изобутирата. Элементная сера оказывала стимулирующее влияние на рост штамма на КМЦ, при этом было отмечено образование сульфида. Сульфат и тиосульфат натрия не оказывали влияния, а сульфит натрия ингибировал рост штамма.

Клетки/мл (*10 ) Филогенетический анализ, основанный на сравнении генов 16S рРНК исследуемого штамма и родственных организмов, показал, что процент сходства с последовательностью ближайшего родственного организма – Fervidobacterium gondwanense – составляет 98.3% (Рис. 10). Уровень ДНК-ДНК гибридизации между штаммом 1445tT и F. gondwanense не превышал 20%.

Рисунок 10. Филогенетическое положение штамма 1445T и других представителей рода Fervidobacterium, определенное на основе сравнения генов 16S рРНК. Дендрограмма построена при помощи Neighbour-joining метода (Saitou & Nei, 1987). Thermotoga maritima MSB использован в качестве репера. Достоверность ветвления (bootstrap test) определяли при Ранее были опубликованы данные о способности двух представителей рода Fervidobacterium – F. islandicum и F. gondwanense - к росту на целлюлозе (Huber et al., 1990; Andrews & Patel, 1996). Однако последующие работы их опровергли (Andrews & Patel, 1996; Podosokorskaya et al., 2011). Вместе с тем, проведенный нами анализ 2 секвенированных геномов представителей рода выявил у F. nodosum и F. pennivorans присутствие эндоглюканаз, однако, роста на целлюлозе для этих микроорганизмов показано не было. Таким образом, выделенный нами новый вид – F. riparium - является первым представителем рода Fervidobacterium, для которого показан достоверный рост на различных типах целлюлозы и, кроме того, на ксилане.

Его геном также находится в процессе секвенирования, что в дальнейшем позволит выявить гены, кодирующие целлюлолитические ферменты.

4. Характеристика Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov., штамм Р3М-1Т Накопительная культура Р3М была получена из образца мата, образующегося на деревянном желобе, заполняемом горячей (47°С) водой из скважины (глубина 2775 м) (Парабельский район, Томская область). Штамм Р3М-1Т удалось выделить из накопительной культуры Р3М серией последовательных разведений на пресной модифицированной среде Видделя с МКЦ в качестве субстрата.

Морфологически штамм Р3М-1T представлял собой прямые или изогнутые многоклеточные нити, длиной от 15 мкм до 200 мкм и более и шириной 0.3-0.7 мкм (Рис. 11). Клеточная стенка грамотрицательного типа. При росте на глюкозе или дрожжевом экстракте наблюдали образование видимых хлопьевидных структур, состоящих из Подвижность и споры обнаружены не были.

Штамм Р3М-1Т являлся строго анаэробным организмом. Слабый рост наблюдали на невосстановленной среде, однако, в микроаэробных (2% кислорода) условиях он полностью прекращался. Штамм Р3М-1Т рос в диапазоне температур от 20 до 50°С, рН 6.5-9.0 и Рисунок 11. Световая микроскопия концентрации NaCl до 5 г/л. Оптимальными клеток штамма P3M-1. Шкала, условиями для роста были 42-45°С, рН 7.5-8.0 и мкм.

1 г/л NaCl. Минимальное время удвоения в оптимальных условиях, при росте на глюкозе составляло 6 часов. Присутствие в газовой фазе водорода в высокой (>20%) концентрации ингибировало рост штамма Р3М-1T, при этом полного ингибирования не происходило даже при 100% водорода.

Необходимым условием роста штамма было добавление в среду дрожжевого экстракта в концентрации 0.05 г/л. Изолят Р3М-1Т использовал для роста следующие субстраты: дрожжевой экстракт, мясной экстракт, гидролизат казеина, глюкозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу и микрокристаллическую целлюлозу.

Основными продуктами сбраживания глюкозы штаммом Р3М-1T были водород, ацетат и этанол. В небольших количествах наблюдалось также образование лактата и формиата. Присутствие в среде культивирования элементной серы, сульфата, тиосульфата и нитрата натрия, а также оксида кристаллического железа (III) не влияло на рост штамма на МКЦ.

В составе клеточной стенки преобладали изо-С15:0 (39.3%) и антеизо-С15: (24.3%) жирные кислоты. Хиноны у штамма Р3М-1T отсутствовали.

Преобладающими фосфолипидами оказались неизвестные аминофосфогликолипиды и гликофосфолипиды. Кроме того, были детектированы неизвестные фосфолипид и гликолипид.

Размер генома штамма Р3М-1Т составил 4.3 Мб. Содержание Г+Ц пар в ДНК мол %. Штамм KIBI-1T мезофильной строго анаэробной бактерии Levilinea saccharolytica был филогенетически наиболее близок (сходство генов 16S рРНК – 92.8% (Рис. 12).

Морфологические и физиологические особенности штамма Р3М-1T в совокупности с данными филогенетического анализа позволили описать его как представителя нового рода – Ornatilinea apprima. Кроме того, это первый представитель класса Anaerolinea, для которого была показана способность расти на целлюлозе, в том числе микрокристаллической.

Рисунок 12. Филогенетическое положение штамма Р3М-1T и других представителей типа Choloroflexi, определенное на основе сравнения генов 16S рРНК. Дендрограмма построена при помощи Neighbour-joining метода (Saitou & Nei, 1987). Последовательности Deinococcus radiodurans DSM20539T и Thermus aquaticus YT-1Tиспользованы в качестве репера. Достоверность ветвления (bootstrap test) определяли при 1000 повторах.

5. Характеристика ‘Melioribacter roseus’ gen. nov., sp. nov., штамм P3M-2T Штамм Р3М-2Т был выделен из накопительной культуры Р3М, описанной выше, на аналогичной среде, но с КМЦ в качестве субстрата. Морфологически штамм представлял собой прямые или слегка искривленные палочки, 0.65-10 мкм в длину и 0.25-0.35 мкм в ширину (Рис. 13А). Подвижность наблюдали только в ранней экспоненциальной фазе роста. Характерной особенностью было образование крупных розеток и биопленок (Рис. 13Б), формирующихся за счет синтеза полисахаридного матрикса, который прокрашивался Конго красным (Bernardet et al., 1996). Данные электронной микроскопии подтвердили наличие жгутиков и экзополисахаридов и, кроме того, были обнаружены включения запасных веществ.

Клеточная стенка грамотрицательного типа. Споры не обнаружены.

Рисунок 13. (А) Электронная микроскопия клеток штамма P3M-2Т (ультратонкие срезы). Шкала, мкм. (Б) Биопленки штамма P3M-2Т. Шкала, 2 см.

Рост культуры наблюдали при температуре от 35°С до 60°С, в диапазоне рН 6.0-8.7, оптимальными значениями были 52-55°С и 7.5, соответственно. Штамм Р3М-2Т был способен расти в среде, не содержащей хлорида натрия, и выдерживать до 60 г/л NaCl, при этом оптимальная концентрация составляла 6 г/л. При проверке отношения штамма Р3М-2Т к кислороду оказалось, что он является факультативным анаэробом. Минимальное время удвоения при росте на КМЦ в анаэробных условиях составляло 2.5 ч, в полностью аэробных – 30 мин. Каталазная и оксидазная реакция были положительными.

В присутствии кислорода клетки штамма окрашивались в розовый цвет за счет синтеза каротиноидов, которые выявлялись по характерным пикам при длине волны 467, 492, 523 нм (Рис. 14). Бактериохлорофиллы обнаружены не были. Помимо кислорода, при росте на ацетате штамм Р3М-2Т использовал в качестве акцепторов электронов нитрит, арсенат и ферригидрит (Рис. 15). Элементная сера, тиосульфат и нитрат не стимулировали рост штамма, а сульфит его ингибировал.

Поглощение Рисунок 14. Спектр поглощения пигментов штамма Р3М-2Т.

Присутствие цитохрома типа С в мембранной фракции клеток штамма Р3М-2Т, выращенных на КМЦ в полностью аэробных условиях, было обнаружено спектрофотометрически по характерным пикам при 409 нм (окисленная форма) и при 422, 526 и 552 нм (восстановленная форма). Показано полное восстановление цитохрома С раствором дитионита (0.1 мМ) и последующее полное его окисление кислородом (либо 30%-ное в случае с 3 мМ ферригидритом).

При добавлении 0.05 г/л дрожжевого экстракта в качестве источника факторов роста изолят использовал широкий спектр органических соединений, включая различные полисахариды: МКЦ, КМЦ, ксилан, крахмал, лихенан, декстран и др.

Основными детектируемыми продуктами брожения штамма Р3М-2Т на глюкозе были водород, СО2 и ацетат. Наблюдали также образование лактата в следовых количествах.

умеренно термофильной бактерии нового типа 'M. roseus’, штамм Р3М-2Т изучали с использованием ДНС метода, зимографии и агаризованных чашек с КМЦ в качестве субстрата.

агаризованные среды с применением Рисунок 16. Детекция целлюлазной активности Конго красного в качестве красителя, в штамма Р3М-2 по появлению зон просветления аэробных условиях целлюлолитических ферментов в справа – образец клеток штамма Р3М-2Т.

образцах клеток штамма (Рис. 16); в супернатанте активность не была обнаружена. Это было также подтверждено методами ДНС и зимографией.

Методом зимографии было установлено, что присутствие хлорида кальция не являлось обязательным для поддержания активности целлюлолитических ферментов штамма Р3М-2Т при экстремальных значениях температуры. Кроме того, целлюлазы были активны в присутствии хлорида натрия в концентрации от 0 до мМ, что хорошо соотносится с ростовыми экспериментами. Для отделения целлюлаз от поверхности клеточных стенок были опробованы различные химические агенты: 1% додецилсульфат натрия (ДСН), 9M мочевина, 2.5% Tритон Х-100, 1 M NaCl. Во всех случаях были получены положительные результаты (Рис.

17).

Проверка термостабильности целлюлаз штамма Р3М-2Т при температурах, превышающих максимум роста микроорганизма-продуцента (60°С), показала, что исследуемые гидролитические ферменты в равной степени активны при 60°С и 80°С (Рис. 18) и, более того, выдерживают прогревание при 96°С в течение 10 минут.

1%) суп Рисунок 18. Зимограммы. Субстрат КМЦ Инкубация 1 час, в 50 мМ Трис, рН 8. при 60°C (А) и при 80°C (Б). Сокращения: суп – супернатант, кл-ки – клетки.

Отметим, что штамм Р3М-2Т вырабатывал целлюлолитические ферменты не только при росте на целлюлозе и ее производных, но также и при росте на простых моно- и дисахаридах и белках после многократных последовательных пересевов на эти субстраты (Рис. 19). Таким образом, можно предположить, что выработка некоторых из детектируемых целлюлаз для штамма Р3М-2Т может носить конститутивный характер.

Преобладающими жирными кислотами для штамма Р3М-2Т были изо-С15: (18.7 %), антеизо-С15:0 (15.7 %) и С16:0 (9.9 %). Основными детектированными фосфолипидами были 4 неизвестных аминофосфолипида, фосфотидилхолин и неизвестный фосфолипид. Преобладающим дыхательным хиноном был МК-7.

Рисунок 20. Филогенетическое положение штамма P3M-2T, определенное на основе сравнения генов 16S рРНК. Дендрограммы построены при помощи Maximal Likelihood метода (Tamura et al., 2004). Borrelia turicatae 91E135 (Spirochaetes) использована в качестве репера. Достоверность ветвления (bootstrap test) определяли при 1000 повторах.

Размер генома штамма Р3М-2Т составил 3.3 Мб. Содержание Г+Ц пар в ДНК мол %. Наиболее близкородственным организмом был хемогетеротрофный, умеренно термофильный микроорганизм Ignavibacterium album, штамм Mat9-16T.

Процент сходства генов 16S рРНК составил 90.8% (Рис. 20).

Ранее I. album был описан как представитель нового класса Ignavibacteria внутри типа Chlorobi (Iino et al., 2010). Однако по фенотипическим признакам микроорганизмы этой группы резко отличаются от всех других представителей типа (отсутствие хлоросом, факультативно анаэробный и хемогетеротрофный образ жизни, подвижность за счет жгутиков, способность к разложению полисахаридов, а также состав жирных кислот и содержание Г+Ц пар). Эти данные коррелируют и с данными филогенетического анализа (процент сходства по генам 16S рРНК ниже 85% (Hugenholtz et al., 1998); кластеризация I. album, 'M. roseus’ и ближайших клонов по генам 16S рРНК, 23S рРНК и RecA в отдельную глубокую филогенетическую ветвь, описанную ранее как ZB-1 (Elshahed et al., 2003);

распределение ближайших гомологов всех белков протеома). На основании этих данных мы предложили выделить класс Ignavibacteria в отдельный тип ‘Ignavibacteriae’.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В пробах из наземных, подземных и морских местообитаний проведен поиск анаэробных термофильных микроорганизмов, способных разлагать целлюлозу, что привело к выделению чистых культур архей и бактерий различных филогенетических групп. Несмотря на редкую встречаемость этого свойства у микроорганизмов (Zverlov & Schwarz, 2008), целенаправленный поиск целлюлолитических прокариот позволил обнаружить новые организмы и расширить представления о распространении и физиологии уже известных таксонов.

Использование целлюлозы в качестве субстрата и детекция целлюлазной активности в первичных накопительных культурах методом зимографии способствовали успешному получению штаммов активных целлюлолитиков. Установлено, что активность целлюлаз выделенных микроорганизмов, как правило, связана с клеточными фракциями штаммов-продуцентов. Температурный оптимум активности целлюлаз обычно более высокий, чем температурный оптимум роста вырабатывающих их микроорганизмов.

Выделенные нами представители экстремально и гипертермофильных целлюлолитических прокариот относились к типам Crenarchaeota, Thermotogae, Dictyoglomi, Firmicutes. Для представителей типа Thermotogae нами впервые была показана способность расти на микрокристаллической целлюлозе. Полностью описаны два новых вида облигатно анаэробных бактерий – Thermosipho affectus и Fervidobacterium riparium. Обе бактерии являются первыми целлюлолитическими представителями своих родов. Кроме них, выделены еще два целлюлолитических представителя родов Thermosipho и Thermotoga, также представляющие новые виды.

Выделены новые умеренно термофильные и термотолерантные целлюлолитические бактерии Ornatilinea apprima и ‘Melioribacter roseus’, относящиеся к типу Chloroflexi и новому, предложенному нами типу ‘Ignavibacteriae’, соответственно. Обе бактерии обитали в микробном мате, развивающемся под током глубинной термальной воды, и росли на микрокристаллической целлюлозе, являясь первыми целлюлолитическими представителями своих классов. Кроме того, и для O. аpprima, и для ‘M. roseus’ была показана повышенная способность к формированию биопленок, изучение которых может стать важным этапом для понимания их роли в процессе гидролиза целлюлозы (Alonso, 2007; Wang et al., 2011).

Отличительные черты ‘M. roseus’ - толерантность к высоким концентрациям хлорида натрия, широкий спектр гидролизуемых полисахаридов и факультативно анаэробный образ жизни. Известно, что за редким исключением мезофильных представителей, целлюлолитики являются либо аэробами, либо строгими анаэробами. Этот феномен связывают с невозможностью сочетания различных механизмов гидролиза целлюлозы, присущих аэробам и анаэробам (Lynd et al., 2002). Более того, среди термофилов факультативно анаэробные целлюлолитические организмы раньше не были обнаружены, и ‘M. roseus’ является, по-видимому, первым описанным представителем данной физиологической группы.

Кроме того, обнаружение конститутивного характера синтеза эндоглюканаз штаммом Р3М-2Т представляет большой интерес, так как большинство целлюлаз являются индуцибельными ферментами (Sukumaran et al., 2005).

Способность ‘M. roseus’ использовать целлюлозу как субстрат, а также ферригидрит и нитрит в качестве акцепторов электронов существенным образом отличает его от ближайшего родственника – Ignavibacterium album, описанного ранее как представитель нового класса Ignavibacteria внутри типа Chlorobi.

Детальный анализ физиологических особенностей и филогенетического положения представителей класса позволил нам предложить выделение его в новый тип ‘Ignavibacteriae’, включающий класс Ignavibacteria, порядок Ignavibacterales и два семейства Ignavibacteraceae и ‘Melioribacteraceae’. Исследование вопроса эволюционных преобразований, которые претерпевал предковый организм, в ходе формирования 3 «сестринских» филогенетических линий – Chlorobi, Bacteroidetes и ‘Ignavibacteriae’ - является актуальной задачей будущей работы.

Таким образом, в результате проведенного исследования выявлено значительное разнообразие целлюлолитических прокариот в термальных местах обитания. Полученные данные расширяют представления о физиологии, распространении и роли, которую играют целлюлолитические прокариоты в природе, где их субстратом может являться растительность, поступающая из окружающих низкотемпературных зон.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено высокое таксономическое разнообразие анаэробных целлюлолитических прокариот в термальных источниках различного происхождения c температурой от 45 до 92С. Среди архей к росту на целлюлозных субстратах оказались способными представители типа Crenarchaeota, среди бактерий – представители типов Thermotogae, Dictyoglomi, Firmicutes, Chloroflexi и нового типа ’Ignavibacteriae’. 9 целлюлолитических штаммов оказались представителями новых таксонов.

2. Охарактеризованы 2 новых вида экстремально термофильных целлюлолитических бактерий типа Thermotogae – Thermosipho affectus и Fervidobacterium riparium. Для представителей типа впервые продемонстрирована способность расти на микрокристаллической целлюлозе.

3. Описан новый род, представленный термотолерантной целлюлолитической бактерией Ornatilinea apprima в классе Anaerolinea типа Chloroflexi. Это первый представитель класса Anaerolinea, способный расти на целлюлозе, в том числе микрокристаллической.

4. Предложен новый тип ‘Ignavibacteriae’, включающий факультативно анаэробную хемоорганотрофную умеренно термофильную целлюлолитическую бактерию нового рода и вида ‘Melioribacter roseus’ и Ignavibacterium album. На основании анализа филогенетического положения ‘M. roseus’ и его способности к росту на широком спектре полисахаридов (в том числе различных типах целлюлозы), использованию в качестве акцепторов электронов, помимо кислорода, ферригидрита и нитрита, предложено новое семейство ‘Melioribacteraceae’ внутри типа ‘Ignavibacteriae’.

5. Продемонстрирована целлюлазная активность у новых представителей типов Firmicutes, Dictyoglomi и ‘Ignavibacteriae’. Установлено, что данные организмы обладают термостабильными и связанными с клеточной стенкой эндоглюканазами. Синтез некоторых из детектированных эндоглюканаз ‘M.

roseus’ может носить конститутивный характер.

1. Кубланов И.В. и Подосокорская О.А. Термофильные микроорганизмы, разлагающие биополимеры. (2011) Глава в сборнике «Труды Института микробиологии имени С.Н.

Виноградского. Вып. 16: «Термофильные микроорганизмы», Отв. редактор В.Ф. Гальченко.

2. Podosokorskaya O.A., Kublanov I.V., Reysenbach A.-L., Kolganova T.V. and BonchOsmolovskaya E.A. (2011) Thermosipho affectus sp. nov., a novel thermophilic anaerobic cellulolytic bacterium isolated from a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent. Int. J. Syst. Evol.

Microbiol. 61, 1160 – 1164.

3. Podosokorskaya O.A., Merkel A.Yu., Kolganova T.V., Chernyh N.A., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. (2011) Fervidobacterium riparium sp. nov., a novel thermophilic anaerobic cellulolytic bacterium isolated from a Kunashir hot spring. Int. J. Syst.

Evol. Microbiol. 61, 2697-2701.

4. Podosokorskaya O.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Novikov A.A., Kolganova T.V. and Kublanov I.V. (2013) Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov., a novel cellulolytic representative of class Anaerolineae. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 86-92.

5. Podosokorskaya O.A., Kadnikov V.V., Gavrilov S.N., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Merkel A.Yu., Karnachuk O.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. (2013) Melioribacter roseus gen. nov. sp. nov., a novel facultatively anaerobic thermophilic cellulolytic bacterium, and the description of a novel bacterial phylum Ignavibacteriae. Environm. Microbiol., as doi:10.1111/1462-2920.12067.

6. Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Podosokorskaya O.A., Gavrilov S.N., Kublanov I.V., Beletsky A., Bonch-Osmolovskaya E.A., and Ravin N.V. (2013) Genomic analysis of organotrophic facultatively anaerobic bacterium Melioribacter roseus supports a novel phylum Ignavibacteriae within Bacteriodetes/Chlorobi group. PLOS ONE. 8, e53047.

1. Подосокорская О.А., Бонч-Осмоловская Е.А., Кубланов И.В. Новые умеренно термофильные целлюлолитические бактерии филумов Chlorobi и Chloroflexi. VI Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Октябрь 2010, Москва, Россия. Сборник тезисов, стр. 54-56.

2. Podosokorskaya O.A., Kublanov I.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. New data on diversity of cellulolytic Thermotogales. International Workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", August 2010, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. Book of abstracts, p. 25.

3. Podosokorskaya O.A., Kublanov I.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Novel cellulolytic representatives of Phylum Thermotogae. 8th International congress ”Extremophiles”, September 2010, Ponta Delgada, Portugal, Book of abstracts, p. 153.

4. Podosokorskaya O.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. and Kublanov I.V. Thermophilic cellulolytic representative of a novel bacterial lineage within the superphylum Bacteroidetes - Chlorobi.

International conference “Thermophiles”, September 2011, Big Sky, Montana, USA, Book of abstracts, p. 92.

5. Kublanov I.V., Podosokorskaya O.A., Ravin N.V., Gavrilov S.N., Lebedinsky A.V. and BonchOsmolovskaya E.A. Metabolic features of ”Melioribacter roseus” and its genomic analysis support its phylogenetic position within Bacteria. International conference “Thermophiles”, September 2011, Big Sky, Montana, USA. Book of abstracts, p. 109.

6. Podosokorskaya O.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Novikov A.A., Kolganova T.V. and Kublanov I.V. Ornatilinea apprima gen. nov., sp. nov., a first cellulolytic representative of class Anaerolineae. 9th International congress ”Extremophiles”, September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 140.

7. Kublanov I.V., Podosokorskaya O.A., Kadnikov V.V., Gavrilov S.N., Mardanov A.V., Merkel A.Yu, Karnachuk O.L., Ravin N.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. “Melioribacter roseus” gen.

nov. sp. nov., a novel facultatively anaerobic moderately thermophilic cellulolytic bacterium and proposal of “Ignavibacteriae” phyl. nov. 9th International congress ”Extremophiles”, September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 150.

8. Gavrilov S.N, Podosokorskaya O.A., Kublanov I.V., Merkel A.Yu, Kadnikov V.V., Mardanov A.V., Ravin N.V., Frank Y.A., Karnachuk O.V. and Bonch-Osmolovskaya E.A. Metabolic versatility of “Melioribacter roseus” gives insights into the evolution and deep subsurface origin of a novel phylum “Ignavibacteriae”. 9th International congress ”Extremophiles”, September 2012, Sevilla, Spain. Book of abstracts, p. 211.

9. Подосокорская О.А., Бонч-Осмоловская Е.А., Кадников В.В. и Кубланов И.В. Разложение целлюлозы факультативно анаэробными бактериями и их первый термофильный представитель ”Melioribacter roseus”. VII Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Октябрь 2012, Москва, Россия. Сборник тезисов, стр. 30-32.

10. Karnachuk O., Avakian M., Podosokorskaya O., Gavrilov S., Frank Yu., Gerasimchuk A., Kublanov I. and Bonch-Osmolovskaya E. Genome insight into copper homeostasis in a new phylum of Bacteria. 8th International Copper Meeting “Copper in Biology”, September-October 2012, Alghero, Italy. Book of abstracts, p. 61.

11. Kadnikov V., Mardanov A., Podosokorskaya O., Bonch-Osmolovskaya E. and Ravin N.

Complete genome sequence of organotrophic bacterium Melioribacter roseus representing new phylum-level lineage affiliated with Chlorobi. 14th International Symposium on Microbial Ecology, August 2012, Copenhagen, Denmark. Book of abstracts, p. 942.





Похожие работы:

«УРСУ Александр Васильевич СВЕРХЦЕННОЕ УВЛЕЧЕНИЕ КОМПЬЮТЕРНЫМИ ИГРАМИ ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ И КЛИНИКО-ПСИХОПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ 19.00.04 – Медицинская психология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2012 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ивановская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской...»

«РЫБКА ЛЮДМИЛА ПЕТРОВНА КОНСТИТУЦИОННО-ПРАВОВЫЕ ОСНОВЫ РЕАЛИЗАЦИИ ПРИНЦИПА РАВНОГО ДОСТУПА ГРАЖДАН К ВОЕННОЙ СЛУЖБЕ ПО КОНТРАКТУ: ГЕНДЕРНЫЙ АСПЕКТ Специальность: 12.00.02 – конституционное право; муниципальное право АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва – 2012 Диссертация выполнена на кафедре конституционного и избирательного права ФГБОУ ВПО Орловский государственный университет Научный руководитель : Савин Валерий Иванович...»

«НЕДЕЛЬКО ДМИТРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ ПРОЕКТИРОВАНИЕ И МЕТОДЫ РАСЧЕТА НАГРУЖЕНИЯ ВЕРТОЛЕТА С ПОЛОЗКОВЫМ ТИПОМ ШАССИ ПО УСЛОВИЯМ ОБЕСПЕЧЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ПОСАДКИ И ВЫНУЖДЕННОГО ПРИВОДНЕНИЯ Специальности: 05.07.02 – проектирование, конструкция и производство летательных аппаратов, 05.07.03 – прочность и тепловые режимы летательных аппаратов Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Казань 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном...»

«КОСТЫГОВ Алексей Юрьевич ПРОТИВОРЕЧИЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО И МОЛЕКУЛЯРНОФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОДХОДОВ В СИСТЕМАТИКЕ ТРИПАНОСОМАТИД 03.02.11 – Паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Зоологический Институт Российской академии наук Научный руководитель : Фролов Александр Олегович, доктор биологических наук Официальные оппоненты :...»

«Общая характеристика работы Актуальность Управление мобильными объектами на расстоянии, передача сообщений между мобильными адресантом и адресатом, организация связи в районах с неразвитой или отсутствующей инфраструктурой проводной связи – всё это ситуации, в которых, по меньшей мере, приходится применять системы беспроводной связи. Известные учёные – Кловский Д.Д., Финк Л.М., Зюко А.Г., Назаров М.В., Коржик В.И., Сойфер В.А., Прокис Дж., Скляр Б. и др. внесли большой вклад в развитие теории и...»

«Аду Яо Никэз Концепция универсализации международного права прав человека и позиции развивающихся стран Специальность: 12.00.10 – Международное право. Европейское право. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва - 2012 Диссертация выполнена на кафедре международного права юридического факультета Российского университета дружбы народов. Научный руководитель : доктор юридических наук, профессор Капустин Анатолий Яковлевич Официальные...»

«БУТАКОВ МИХАИЛ ИГОРЕВИЧ ИНСТРУМЕНТАЛЬНОЕ СРЕДСТВО СИНТЕЗА И ИСПОЛНЕНИЯ ТРАНСЛИРУЮЩИХ ПРОГРАММ НА ОСНОВЕ ПОЗИТИВНО-ОБРАЗОВАННЫХ ФОРМУЛ Специальность 05.13.11 – Математическое и программное обеспечение вычислительных машин, комплексов и компьютерных сетей АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Иркутск – 2012 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте динамики систем и теории управления Сибирского отделения Российской...»

«ХАМЗИНА АЛЕКСАНДРА КАМИЛЕВНА ОБОСНОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИКРЫ ЛОСОСЕВОЙ ЗЕРНИСТОЙ ИЗ МОРОЖЕНЫХ ЯСТЫКОВ Специальность 05.18.04 – технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва - 2012 Работа выполнена в лаборатории аналитического и нормативного обеспечения качества и безопасности Федерального государственного унитарного предприятии Всероссийский...»

«КУДИНОВ Дмитрий Вячеславович ИНФОРМАЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ СТРОИТЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ: МОДЕЛИРОВАНИЕ И ОЦЕНКА ПОТРЕБИТЕЛЬСКОГО КАЧЕСТВА Специальность 08.00.13 – Математические и инструментальные методы экономики АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Ростов-на-Дону - 2012 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ростовский государственный экономический университет...»

«Кучеев Юрий Олегович Полное и неполное “смачивание” границ зерен второй твердой фазой в сплавах железа и кобальта Специальность 01.04.07 Физика конденсированного состояния АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2012 Работа выполнена на кафедре физической химии ФГАОУ ВПО Национальный Исследовательский Технологический Университет МИСиС и в Лаборатории поверхностей раздела в металлах ИФТТ РАН, г. Черноголовка Научный...»

«Пекшеева Эльвира Ивановна ИХТИОНИМЫ И ЛЕКСИКА РЫБОЛОВСТВА В МАРИЙСКОМ ЯЗЫКЕ 10.02.22 – Языки народов зарубежных стран Европы, Азии, Африки, аборигенов Америки и Австралии (финно-угорские и самодийские языки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Йошкар-Ола – 2012 Работа выполнена на кафедре марийского языка Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Марийский...»

«ИСАХАНЯН ЛУСИНЕ ВОЛОДЕВНА ОПЛАТА ТРУДА КАК ФАКТОР СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Специальность 08.00.05 – экономика и управление народным хозяйством (экономика, организация и управление предприятиями, отраслями, комплексами – АПК и сельское хозяйство) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Воронеж – 2011 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Воронежская государственная лесотехническая академия Научный руководитель :...»

«Шумафов Магомет Мишаустович СТАБИЛИЗАЦИЯ УПРАВЛЯЕМЫХ ДИНАМИЧЕСКИХ СИСТЕМ Специальность 05.13.01 – системный анализ, управление и обработка информации (по прикладной математике и процессам управления) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена на математико-механическом факультете СанктПетербургского государственного университета (СПбГУ). Научный...»

«Жуклина Вероника Владимировна АНАТОМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЖИВОТА И ПЕРЕДНЕЙ БРЮШНОЙ СТЕНКИ У ЖЕНЩИН ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА И ПРИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА 14.03.01 – анатомия человека, медицинские наук и АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Красноярск – 2012 Работа выполнена на кафедрах оперативной хирургии с топографической анатомией и пропедевтики внутренних болезней в ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им....»

«Печетова Наталья Юрьевна СТИЛЕОБРАЗУЮЩИЕ ФАКТОРЫ РЕПРЕЗЕНТАЦИИ СОБЫТИЯ В РЕГИОНАЛЬНЫХ ГАЗЕТНО-ПУБЛИЦИСТИЧЕСКИХ ТЕКСТАХ (на материале газет Республики Саха) Специальность 10.02.01 – русский язык АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Барнаул – 2012 Диссертация выполнена на кафедре современного русского языка и речевой коммуникации ФГБОУ ВПО Алтайский государственный университет. Научный руководитель : доктор филологических наук,...»

«РОМАНЦОВА Светлана Владиславовна СОЦИАЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ФЕДЕРАЛЬНЫХ ГОСУДАРСТВЕННЫХ ГРАЖДАНСКИХ СЛУЖАЩИХ РОССИИ Специальность 22.00.08. - Социология управления АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата социологических наук Москва - 2012 Работа выполнена на кафедре государственного, муниципального управления и социальной инженерии ФГБОУ ВПО Российский государственный социальный университет Научный руководитель : доктор...»

«ЕСЬКОВА Ирина Андреевна Повышение эффективности доставки скоропортящихся молочных продуктов в мегаполисе (05.22.01 – Транспортные и транспортно-технологические системы страны, её регионов и городов, организация производства на транспорте) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2012 Работа выполнена на кафедре Логистика в Московском автомобильнодорожном государственном техническом университете (МАДИ). Научный руководитель :...»

«Бородой Александр Николаевич ЧИСЛЕННЫЙ АНАЛИЗ ПОЛЕЙ НАПРЯЖЕНИЙ И РАЗВИТИЯ ДЕФЕКТОВ ПРИ МАЛОЦИКЛОВОМ НАГРУЖЕНИИ ЭЛЕМЕНТОВ КОНСТРУКЦИЙ С КОНЦЕНТРАТОРАМИ – Механика деформируемого тврдого тела 01.02.04 Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Орел – 2012 Работа выполнена в Федеральном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волжская государственная академия водного транспорта (г. Нижний Новгород) Научный...»

«НГУЕН НГОК ХОА ПЛОСКИЕ НЕСТАЦИОНАРНЫЕ КОНТАКТНЫЕ ЗАДАЧИ ДЛЯ УПРУГО-ПОРИСТЫХ СРЕД 01.02.04 – Механика деформируемого твердого тела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московский авиационный институт (национальный исследовательский университет) доктор физико-математических наук, профессор,...»

«Мельник Алексей Юрьевич Профессиональная и социальная адаптация молодежи в условиях современного рынка труда Специальность 08.00.05 – экономика и управление народным хозяйством (экономика труда) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Москва - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт труда и социального страхования Министерства здравоохранения и социального развития...»








 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.