На правах рукописи

CТАРКОВА ДАРЬЯ АНДРЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ Mycobacterium avium subspecies hominissuis

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург – 2014 2

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «СанктПетербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера)

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Нарвская Ольга Викторовна

Официальные оппоненты:

Макарова Марина Витальевна, доктор биологических наук, Государственное казенное учреждение здравоохранения «Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом» Департамента здравоохранения города Москвы, ведущий научный сотрудник отдела проблем лабораторной диагностики туберкулеза и патоморфологии Черноусова Лариса Николаевна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральный научноисследовательский институт туберкулеза» Российской академии медицинских наук, заведующая отделом микробиологии Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится «_» 2014 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адрес у: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу:

125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, http://www.gabrich.ru

Автореферат разослан 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук……………………………………...Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования Микобактериоз — инфекционное заболевание животных и человека, возбудителями которого являются более 20 видов кислотоустойчивых медленнои быстрорастущих убиквитарных нетуберкулзных микобактерий (НТМБ) (Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005; Макарова М.В., 2009). Несмотря на спорадический характер заболевания, в последнее десятилетие отмечен рост пораженности населения микобактериозом легких, что связывают, в основном, с распространенностью иммуносупрессивных состояний. У 20% больных СПИД, несмотря на профилактическое лечение, в течение года развивается диссеминированная форма инфекции с неблагоприятным прогнозом (Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005; Литвинов В.И. и др., 2008).

Среди НТМБ наиболее часто встречаются медленнорастущие бактерии Mycobacterium avium complex (МАС), представленные видами M. avium и M.

intracellulare. Эти микроорганизмы - типичные обитатели окружающей среды, способные выживать в почве, воде, аэрозолях, системах водоснабжения и в биопленках (Falkinham J. et al., 2002; Yamazaki Y. et al., 2006), являются оппортунистическими патогенами диких и домашних животных (свиней и др.), птиц и человека (Turenne C. et al., 2002).

Наиболее актуальным возбудителем микобактериоза человека является M. avium.

Согласно современным представлениям, вид M. avium включает несколько подвидов, ассоциированных с определенным кругом хозяев, экологическими и географическими характеристиками штаммов, которые имеют специфические геномные паттерны. Так, M.

avium subsp. hominissuis (MAH) вызывает заболевания у людей (в т.ч., у ВИЧинфицированных) и свиней; M. avium subspp. avium (MAA), silvaticum (MAS) и paratuberculosis (MAP) поражают в основном птиц, диких и домашних животных (Rindi L. et al., 2002; Turenne C. et al., 2002).

Степень разработанности темы исследования Трудоемкость методов идентификации и генотипирования микобактерий отчасти объясняет относительно небольшое число зарубежных и отсутствие отечественных публикаций, посвященных оценке биоразнообразия M. avium. Лишь недавно для видовой идентификации M. avium стали использовать методы, основанные на гибридизации с ДНК-зондами (например, тест-система GenoType®Mycobacterium CM/AS, Hain Lifescience). Для изучения геномного полиморфизма M. avium за рубежом до настоящего времени используют различные инсерционные последовательности (Insertion Sequence, IS) - мобильные элементы, в частности IS1245. Метод IS1245-RFLPтипирования позволяет проводить тонкую дифференциацию штаммов путем оценки количества и взаимного расположения фрагментов рестрикции в паттернах IS1245 (Van Soolingen D. et al., 1998; Inagaki T. et al., 2009; Johansen T. et al., 2005). Недостатками данного метода являются длительность и трудоемкость анализа, особые требования к качеству и количеству бактериальной ДНК, сложность интерпретации результатов при оценке мультибендовых паттернов рестрикции, что существенно ограничивает применение данного метода в эпидемиологических исследованиях. В последнее десятилетие генотипирование M. avium осуществляют с использованием метода VNTR (Variable Number Tandem Repeats) - типирования для оценки аллельного полиморфизма восьми локусов VNTR (TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TR10, TR32) (Thibault V.

et al., 2007). Учитывая относительно невысокую вариабельность большинства из указанных локусов для типирования штаммов M. avium subspecies hominissuis, японские исследователи предложили схему, которая включает 15 локусов MATR (Mycobacterium Avium Tandem Repeats): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 (Inagaki T. et al., 2009).

Неполнота сведений о генетической структуре российской популяции M. avium subspecies hominissuis, отсутствие простых и чувствительных молекулярно-генетических методов и схем геноидентификации и типирования возбудителя ограничивают исследования в области эпидемиологии микобактериоза в нашей стране.

Цель исследования: генотипическая характеристика штаммов M. avium,выделенных от человека, с использованием комплекса молекулярных маркеров.

Задачи исследования:

использованием молекулярно-генетических методов анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 (PRA- hsp65) и ПЦР-детекции инсерционных элементов IS900 и 901.

2. Изучить геномный полиморфизм изолятов M. avium, выделенных от различных групп больных микобактериозом (включая ВИЧ-инфицированных), с использованием комплекса методов анализа полиморфизма локусов VNTR, MATR и IS1245-RFLPтипирования.

3. Установить распространенность и оценить генетическое родство штаммов M. avium различных генотипов.

4. Оценить дискриминирующую способность полиморфных локусов VNTR и MATR.

5. Разработать схему генотипирования российских штаммов M. avium.

Научная новизна исследования Впервые на основе анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 и инсерционных элементов IS901 и IS900 с использованием методов, основанных на ПЦР, проведена идентификация и определена принадлежность к подвиду hominissuis чистых культур M. avium, выделенных от больных микобактериозом легких (в т.ч., ВИЧ-позитивных) на территории Северо-Запада России.

Получены новые знания о структуре популяции M. avium subspecies hominissuis на Северо-Западе России на основе исследования геномного полиморфизма штаммов возбудителя, выделенных от больных микобактериозом, с помощью комплекса молекулярно-генетических методов (VNTR-, MATR-типирования и IS1245-RFLPтипирования).

Разработана научно обоснованная схема типирования российских штаммов M. avium subsp. hominissuis, основанная на идентификации возбудителя по 14 локусам VNTRMATR с последующим анализом кластеров методом IS1245-RFLP, позволяющая проводить мониторинг одного из наиболее актуальных возбудителей микобактериоза человека в России.

Впервые изучена информативность (дискриминирующая способность) 23 локусов VNTR и MATR для типирования российских штаммов M. avium subspecies hominissuis.

Установлено, что аллели 3 в локусе MATR-16 и 2 в локусе TR10 (MATR-9), имеющие делеции, являются маркерами российских изолятов M. avium subspecies hominissuis.

Впервые последовательности ДНК клинических штаммов Mycobacterium avium subspecies hominissuis депонированы в GenBank: а) последовательности локуса TR10, содержащие два идентичных интактных тандемных повтора 55 п.н. (accession no.

JQ935977.1) и внутреннюю делецию размером 15 п.н. в первом из двух повторов (accession no. JQ918769.1); б) последовательность локуса МАTR-16, содержащая делецию двух нуклеотидов во втором повторе и внутреннюю делецию 28 п.н. в третьем повторе (accession no. KF479191).

Теоретическая и практическая значимость исследования Установлено, что российская популяция M. avium subspecies hominissuis, представленная в данной работе изолятами больных микобактериозом людей, неоднородна по маркерам геномного полиморфизма VNTR, MATR и IS1245, что позволяет оценить этиопатогенетическую роль штаммов различных генотипов в развитии микобактериоза на территории Российской Федерации.

Показано, что распространенность VNTR- и MATR-типов M. avium subspecies hominissuis неодинакова у штаммов возбудителя различного географического происхождения, что вносит существенный вклад в характеристику глобальной популяции микроорганизма данного вида.

С учетом информативности маркеров геномного полиморфизма разработана научно обоснованная схема типирования российских штаммов M. avium subspecies hominissuis по 14 локусам VNTR-MATR с последующим анализом кластеров методом IS1245-RFLP, позволяющая установить генетическое родство между штаммами при проведении молекулярно-эпидемиологических исследований микобактериоза и мониторинга популяции возбудителя.

В лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера создана и поддерживается коллекция ДНК 90 клинических штаммов M. avium subspecies hominissuis. Создана компьютерная база данных, содержащая профили VNTR-, MATR- и IS1245-RFLP-типирования 90 клинических штаммов M. avium subspecies hominissuis.

Материалы исследования изданы в виде Информационно-методического письма «Молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов Mycobacterium avium subspecies hominissuis – возбудителя микобактериоза человека» (утверждено директором ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера А.Б. Жебруном и директором ФГБУ НИИ фтизиопульмонологии П.К. Яблонским 18 апреля 2014 г.) и используются в научно-исследовательской работе лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (Акт о внедрении от 21 мая 2014 г.).

Методология и методы исследования Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Предметом исследования явилась характеристика геномного полиморфизма M. avium – возбудителя микобактериоза человека. Анализ научной литературы, посвящнной оценке молекулярных маркеров, используемых для дифференциации штаммов M. avium subspecies hominissuis, проведн на основе формально-логических методов исследования. Работа выполнена в формате сравнительного открытого исследования с использованием микробиологических, молекулярно-генетических, аналитических и статистических методов.

Материалы и методы Объектом исследования были 120 чистых культур M. avium complex, выделенных в 2008-2011 гг. в ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (СПбНИИФ) от жителей Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Девяносто (из 120) штаммов, идентифицированные до вида M.

avium, получены от больных микобактериозом легких (включая 27 ВИЧинфицированных), 18 - выделены от пациентов с подозрением на туберкулез.

Эпидемиологические связи между случаями заболевания не установлены.

Микробиологический метод. Культивирование микобактерий осуществляли в лаборатории СПбНИИФ общепринятым методом на среде Левенштейна-Йенсена в течение 21 дня (Приказ № 109 Минздрава РФ от 23.03.2010); идентификацию чистых культур микобактерий проводили с использованием биохимических тестов (Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005).

Молекулярно-генетические методы. ДНК из исследуемых культур микобактерий, а также из эталонных и коллекционных штаммов M. avium subsp. avium ATCC 35712, IWGMT49 и M. avium subsp. paratuberculosis K10, предоставленных СПбНИИФ, выделяли согласно (van Embden et al. 1993). Геноидентификацию чистых культур микобактерий до вида и подвида проводили с использованием тест-системы GenoType®Mycobacterium CM/AS Hain Lifescience (Германия); методов анализа полиморфизма фрагментов рестрикции гена hsp65 (PRA–hsp65) (Chimara E. et al., 2008) и детекции инсерционных элементов IS900 и IS901 (Turenne C. et al., 2007).

Праймеры для ПЦР синтезированы в ООО «Синтол», г. Москва. Амплификацию ДНК IS900 и IS901 методом ПЦР осуществляли в термоциклере Bio-Rad С1000 Thermal Cycler (США). Общий объем реакционной смеси составил 25 мкл: по 1 мкл прямого и обратного праймеров (конечная конц. 200 мкМ/л), dNTPmix - 3,5 мкл (конечная конц.

200 мкМ/л), 10хПЦР-буфер – 5 мкл, MgCl2 – 1,5 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л), Taqполимераза (Силекс, Москва) – 0,2 мкл (1 ед.), деионизированная вода – до 25 мкл; мкл ДНК. Условия проведения ПЦР для амплификации IS901: 5 мин – 95 °C, 35 циклов:

45 сек. – 95 °С, 45 сек – 63 °С, 45 сек – 72 °С, 10 мин – 72 °С; для амплификации IS900: мин – 95 °C, 35 циклов: 45 сек. – 95 °С, 45 сек – 65 °С, 45 сек – 72 °С, 10 мин – 72 °С.

Аллельный полиморфизм штаммов M. avium subsp. hominissuis изучали методом VNTR-типирования по 8 вариабельным локусам TR: TR292, TRX3, TR25, TR47, TR3, TR7, TR10, TR32 (Thibault et al., 2007) и методом MATR-типирования по вариабельным локусам MATR-: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 (Inagaki et al., 2009). Общий объем реакционной смеси для TR 292, X3, 25, 47, 3, 7 и MATR-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 13, 14, 15 составил 25 мкл: по 1 мкл прямого и обратного (конечная конц. мкМ/л) праймеров, dNTPmix - 3,5 мкл (конечная конц. 200 мкМ/л), 5хПЦР-буфер – мкл, MgCl2 – 1,5 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л) TaqF-полимераза (ИнтерЛабСервис, Москва) – 0,2 мкл (1 ед), вода – до 25 мкл. Общий объем реакционной смеси для TR10, TR32 и MATR-11, MATR-12, MATR-16 составил 30 мкл: по 1 мкл прямого и обратного (конечная конц. 200 мкМ/л) праймеров, dNTPmix - 4 мкл (конечная конц. 200 мкМ/л), 10хПЦР-буфер – 5 мкл, MgCl2 – 2 мкл (конечная конц. 2,0 мМ/л), Taq-полимераза (Силекс, Москва) – 0,2 мкл (1 ед.), диметил сульфоксид (DMSO) – 3 мкл, вода – до 30 мкл.

Условия проведения ПЦР для амплификации локусов TR47, MATR-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16: 5 мин – 95 °C, 35 циклов: 30 сек. – 95 °С, 30 сек – 62 °С, 45 сек – °С, 10 мин – 72 °С; для локусов TR 10, TR 32 и MATR-9: 5 мин – 95 °C, 35 циклов: сек. – 95 °С, 30 сек – 57 °С, 45 сек – 72 °С, 10 мин – 72 °С; для локусов TR292, TRX3, TR25, TR3, TR7: 5 мин – 95 °C, 35 циклов: 30 сек. – 95 °С, 30 сек – 58 °С, 45 сек – 72 °С, 10 мин – 72 °С. Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В гель вносили маркеры молекулярной массы 100 bp DNA Ladder (ООО «Интерлабсервис», г. Москва) и 50 bp (GE Healthcare, США). Результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc» (BioRad, США).

Число тандемных повторов в локусах рассчитывали, исходя из молекулярных масс ампликонов (Thibault V.C. et al., 2007; Inagaki T. et al., 2009). MATR- и VNTR-профиль каждого штамма записывали в виде набора цифр, соответствующих числу повторов в локусах, в следующем порядке: TR (292, X3, 25, 47, 3, 7, 10, 32) и MATR (-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -11, -12, -13, -14, -15, -16). Генотипирование изолятов M. avium методом IS1245-RFLP проводили согласно стандартному протоколу van Embden et al. (1993). Для ДНК-секвенирования продукты амплификации локусов TR10 и MATR-16 с праймерами 10F и 16F очищали с использованием набора реагентов GFX PCR DNA и Gel Band purification kit (GE Healthcare Life Sciences, США). Реакцию лимитированного секвенирования проводили с использованием Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Kits (PE Biosystems, version 2.0) и 4 пмоль соответствующего праймера.

Капиллярный электрофорез выполняли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM (Life Technologies, США).

Статистическая обработка результатов проведена с использованием программного обеспечения и информационных баз данных. Расчеты зависимости между переменными (частота признака) проводили с использованием таблицы 2х2 для ввода данных пакета программ EpiCalc 2000 version 1.02. Статистически значимыми считали различия при доверительном интервале 95% (р0,05): Ma82 – 3,3% и 6,9%, Ma – 14,4% и 17,2%, соответственно. В то же время, профиль 25221128 (кластер Ma81) явно доминировал в Финляндии (24,1% против 2,2%, P=0,001), тогда как наиболее распространенный профиль 22221128 (кластер Ma84) российских штаммов был выявлен