WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ШИБАЕВ Михаил Александрович

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ

БИОЛОГИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ

РЕСПИРАТОРНЫХ ИНФЕКЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 «Ветеринарная микробиология,

вирусология, эпизоотология, микология

с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ВЛАДИМИР – 2010 2

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»)

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор МИЩЕНКО Владимир Александрович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор РУСАЛЕЕВ Владимир Сергеевич ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир доктор ветеринарных наук, профессор СУББОТИН Владимир Викторович ГНУ «Всероссийский научно исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (ГНУ «ВИЭВ»), г. Москва

Ведущая организация – Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ), г. Покров Владимирской области

Защита состоится «15» июня 2010 г. в 1400 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГУ «ВНИИЗЖ».

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте: http//www.arriah.ru.

Автореферат разослан «» _ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент А.П. Пономарёв

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В условиях новых технологий ведения животноводства существенное влияние на эпизоотическую ситуацию оказывают смешанные инфекции респираторного тракта КРС. По широте распространения и смертности респираторные болезни телят превалируют над всеми остальными заболеваниями молодняка [О. Гамелин, 2002; В.А. Мищенко, 2003; G.D. Snowder, 2006].

Массовые респираторные болезни молодняка КРС являются комплексными многофакторными синдромами, возникающими на фоне взаимодействия различных инфекционных агентов, изменения иммунного статуса, физических и экологических факторов [В.П. Урбан, 1984; P.M. Cusack, 2003; S.W. Martin, 1981]. Основная роль в развитии смешанных респираторных инфекций телят принадлежит вирусам (парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, коронавирусу, респираторно-синцитиальной инфекции и др.) и бактериям (прежде всего Pasteurella multocida (P. multocida), Mannheimia haemolytica (M. haemolytica), а также Chlamydophila pecorum (Chl. pecorum) и Mycoplasma bovis (M. bovis) [В.Н. Сюрин, 1998; А.Н. Куриленко, 2005; D.F. Twomey, 2006; T. Autioa, 2007; J.A. Rice, 2007].

Сходство в течении заболевания, вызванного различными возбудителями, обуславливает необходимость применения методов лабораторной диагностики данных инфекций. Разработанные ранее методы прямой и ретроспективной диагностики заболеваний, вызываемых M. haemolytica, P. multocida, Chl. pecorum и M. bovis не всегда позволяют надёжно идентифицировать инфекционные агенты.

Таким образом, представляется актуальным усовершенствование методов выявления вышеуказанных микроорганизмов, основанных на применении методов молекулярной биологии, что приобретает особую важность в связи изменениями классификации M. haemolytica и Chl. pecorum [K.D.E. Everett, 1999; O. Angen, 1999].

Кроме того, исследования, направленные на уточнение распространённости названных возбудителей на территории РФ, будут способствовать успешному проведению противоэпизоотических и профилактических мероприятий.

Выяснение этиологической структуры реcпираторных заболеваний молодняка КРС и оценка вклада отдельных возбудителей невозможна без применения методов аналитической эпизоотологии [С.А. Дудников, 2004; M. Thrusfield, 1995].

Цель и задачи исследования. Цель исследований заключалась в разработке методов выявления генома P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis превалентности данных возбудителей в популяции телят 0,5 – 7,0 месячного возраста в хозяйствах ЦФО РФ. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- разработать метод выявления генома P. multocida и M. haemolytica на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

- разработать метод выявления генома Chl. pecorum на основе ПЦР;

- разработать метод для выявления генома M. bovis на основе ПЦР;

P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis в популяции телят 0,5 – 7, месячного возраста в хозяйствах ЦФО РФ;

- оценить связь выявления P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis с респираторной патологией телят, используя метод факторного анализа по Ротману [K.J. Rothman, 1976].

Научная новизна исследования. С помощью метода мультиплексной ПЦР и секвенирования разработан способ идентификации геномов M. haemolytica и P. multocida с последующей их дифференциацией в соответствии с современной таксономией Pasteurellaceae.

Сконструированы системы праймеров и разработаны методы идентификации Chl. pecorum и M. bovis на основе метода ПЦР.

Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов sodA и lktD изолятов M. haemolytica, выявленных в пробах патологического материала на территории РФ в течение 2006-2009 гг.

Chl. pecorum. Определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена ompA изолятов Chl. pecorum, выявленных в пробах патологического материала от КРС на территории РФ в течение 2006-2009 гг. Изучены вероятные филогенетические отношения между изолятами, выявленными на территории РФ, и изолятами Chl. pecorum, имеющимися в базе данных GenВank.

Впервые определены показатели стадной и индивидуальной превалентности P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis на репрезентативной выборке КРС в возрасте 0,5 – 7,0 месяцев в хозяйствах ЦФО РФ.

Впервые с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия установлена достоверность различий в частоте выявления P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis у здоровых телят и телят с респираторной патологией в хозяйствах РФ.

Практическая значимость исследования. В результате проведённых исследований разработаны:

- «Методические рекомендации по нуклеотидному секвенированию генома бактерий рода Mannheimia с целью определения их видовой принадлежности». Данная методика позволяет выявлять и дифференцировать M. haemolytica и P. multocida в патологических и культуральных бактериосодержащих материалах (2007 г.).

- «Методические рекомендации по индикации генома Chlamydophila pecorum методом полимеразной цепной реакции» (2009 г.).

- «Методические рекомендации по индикации генома Mycoplasma bovis методом полимеразной цепной реакции» (2009 г.).

Данные методические рекомендации прошли комиссионные испытания, рассмотрены и одобрены учёным советом, утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ»

и рекомендованы для использования в лабораториях при проведении диагностических исследований.

Результаты изучения превалентности и оценки связи выявления P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis с респираторной патологией в изучаемой популяции КРС с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия имеют как теоретическую, так и практическую значимость, поскольку дают возможность расширить знания о роли изучаемых возбудителей в респираторной патологии молодняка КРС, и в дальнейшем могут быть использованы при разработке комплекса научно-обоснованных мер борьбы и профилактики смешанных респираторных инфекций КРС.

Основные положения, выносимые на защиту:

- метод идентификации и дифференциации M. haemolytica и P. multocida методом мультиплексной ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

- метод выявления генома Chl. pecorum на основе амплификации фрагмента гена ompA;

- метод выявления генома M. bovis на основе амплификации фрагмента гена uvrC;

-результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена ompA изолятов Chl. pecorum, выявленных в РФ в 2006-2009 гг.;

-результаты исследования по оценке превалентности P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum и M. bovis в популяции телят 0,5 – 7,0 месячного возраста в ЦФО РФ;

-результаты факторного анализа по Ротману и анализа общей модели факторного взаимодействия P. multocida, M. haemolytica, Chl. pecorum, M. bovis и их ассоциаций у телят с респираторной патологией в хозяйствах ЦФО РФ.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Нуклеотидное секвенирование осуществлялось сотрудниками лаборатории диагностики вирусных болезней птиц ФГУ «ВНИИЗЖ». Исследования по диссертационной работе выполнены в 2006-2009 гг. в ФГУ «ВНИИЗЖ».

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Диагностика профилактика и лечение болезней животных» (г. Новосибирск, 2008 г.), «Достижения молодых учёных в ветеринарную практику», посвящённая 50-летию создания ФГУ «ВНИИЗЖ»

(г. Владимир, 2008 г.), «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» посвященная 70-летию со дня рождения членакорреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. (г. Покров, 2009 г.), а также на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2006- 2010 гг.

Публикация научных исследований. По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ в журналах и материалах научных конференций, три из них – в журнале «Ветеринарная патология», рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 165 страницах компьютерного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 262 источника, в том числе зарубежных. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 22 таблицами.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

штаммов и изолятов микроорганизмов, использованных в работе, приведён в табл. 1.

Характеристика контрольных штаммов и изолятов микроорганизмов M. haemolytica M. haemolytica P. multocida subsp. multocida Chl. pecorum Chl. pecorum Chl. pecorum Химические реагенты. В работе использованы химические реактивы производства “Promega” (США), “Sigma” (США), “Serva” (Германия), “Esso” (Франция), а также отечественные реактивы марки о.с.ч.

Выделение суммарной ДНК. Суммарную ДНК из культуральной бактериосодержащей суспензии и патологического материала от животных выделяли с помощью набора реагентов для выделения ДНК, в соответствии с инструкцией производителя (ООО «Компания Биоком», г. Москва).

Мультиплексную ПЦР для индикации и дифференциации серогрупп A, B, D, E и F P. multocida выполняли согласно протоколу изложенному в Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals [Paris: OIE, 2008].

Очистку продуктов ПЦР проводили с помощью набора реактивов «Wizard® PCR Preps DNA Purification System» (Promega) согласно методике производителя.

Секвенирование продуктов ПЦР осуществлялось на автоматическом секвенаторе «ABI Prism 3100» (Applied Biosystems, США).

Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот проводили с помощью пакета программ BioEdit версия 7.0.5.2, 2005. Выбор праймеров осуществляли с помощью программы OLIGO версия 4.0, а филогенетический анализ - с помощью алгоритма NJ в реализации пакета MEGA версия 4.0.

Формирование выборки. Для изучения широты распространения M. haemolytica, P. multocida, Chl. pecorum и M. bovis в популяции КРС был проведён отбор проб мазков из носа у телят. Определение требуемого объёма выборки осуществляли, исходя из 95% уровня достоверности и 10% превалентности [Cannon & Roe 1982] M.haemolytica, P.multocida, Chl.pecorum и M.bovis в популяции КРС ЦФО.

Методы анализа данных. Обработка данных, полученных в ходе инструментального учёта результатов применённых тестов проводилась с использованием программного обеспечения STATISTICA 6,0 (StatSoft, Inc, 2001).

С применением эпизоотологических аналитических методов вероятностного расчёта, использующих матрицу 2х2, были оценены эпидемические критерии ассоциации результатов диагностического теста (ПЦР) и клинических признаков поражения респираторного тракта в обследуемых хозяйствах по показателям: хи – квадрат (2) и соотношение шансов (OR) [С.А. Дудников, 2004]. Для количественной и качественной оценки ассоциативной инфекции респираторного тракта молодняка КРС использовали факторный анализ по Ротману с последующим построением общей модели факторного взаимодействия в форме диаграмм Венна.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка метода идентификации и дифференциации геномов M. haemolytica и P. multocida с помощью ПЦР и нуклеотидного секвенирования Одной из преград при разработке ПЦР для выявления M. haemolytica является сложность её дифференцирования от других видов рода Mannheimia, нуклеотидные последовательности генов которых обладают высокой степенью сходства с аналогичными генами M. haemolytica. Анализ нуклеотидных последовательностей генов оперона lktCABD показал, что ген lktC является высоко консервативным у всех представителей рода Mannheimia, что позволило использовать его для выбора родоспецифических праймеров. В результате сконструированы праймеры TOX-F1 и TOXR1, фланкирующие фрагмент гена lktC (табл. 2).

Праймеры для амплификации и секвенирования фрагментов генов lktC, sodА и lktD M. haemolytica и амплификации гена КМТ1 P. multocida TOX F-1 5'–TGATTCCTGCAATTGAAAATGAACAATATA–3' Тем не менее, ген lktC не несет генетической информации о видовых отличиях представителей рода Mannheimia.

Для дифференциации М. haemolytica от наиболее генетически близкого к нему вида – M. glucosida были сконструированы специфичные для рода Mannheimia праймеры LKTD-F и LKTD-R, фланкирующие фрагмент гена lktD (табл. 2).

Для дифференциации М. haemolytica и M. glucosida от других представителей рода Mannheimia, был выбран ген sodA. В результате были сконструированы праймеры - SODA-F и SODA-R, также специфичные для рода Mannheimia (табл. 2).

Для специфической индикации генома P. multocida был выбран ген KMT1 уникальный для данного вида. В результате нами была сконструирована пара праймеров (PM-SV-F и PM-SV-R), которые были использованы в ПЦР (табл. 2).

M. haemolytica и P. multocida (табл. 1). В оптимизированном варианте схему анализа можно представить следующим образом:

Этап 1: постановка ПЦР с праймерами TOX F-1/TOX R-1 и PM-SV-F/PM-SV-R в варианте мультиплекс для выявления и дифференциации геномов микроорганизмов рода Mannheimia и вида P. multocida. При проведении ПЦР амплифицируются фрагменты ДНК генов lktC и KMT1, размер которых составляет 202 п. н. для микроорганизмов рода Mannheimia и 272 п. н. – P. multocida (рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР для выявления геномов P. multocida и микроорганизмов рода Mannheimia.

Обозначения дорожек: M – маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п.н.); 1– вода (отрицательный контроль ПЦР); 2 – проба содержащая М. haemolytica и P. multocida одновременно; 3 – P. multocida; 4 – М. haemolytica.

Этап 2: при наличии на первом этапе положительной реакции на род Mannheimia проводят ПЦР (с использованием выделенной ДНК) и секвенирование продуктов с праймерами на ген sodA для дифференциации M. haemolytica и M. glucosida от других представителей рода. Размер продуктов амплификации в этой реакции составляет 446 п. н. (рис. 2).

Этап 3: если первичная структура ампликона указывает на наличие в исследуемом материале M. haemolytica или M. glucosida, проводят еще одну ПЦР и секвенирование продуктов с праймерами на ген lktD для дифференциации M. haemolytica и M. glucosida. Продукты амплификации имели длину 848 п. н. (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагментов Обозначения: M – маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п. н.); 1 – вода (отрицательный контроль ПЦР); 2– продукт ПЦР гена lktD; 3– продукт ПЦР гена sodА; 4– продукт ПЦР гена lktC;

проверили на биологических материалах содержащих как M. haemolytica и P. multocida, так и гетерологичные микроорганизмы (Ornithobacterium rhinotracheale, Actinobacillus pleuropneumoniae, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, M. bovis, Acholeplasma granularum, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Chl. pecorum и др.). При этом во всех образцах, содержащих M.haemolytica, выявляли геном данного микроорганизма, а в образцах содержащих P.multocida геном этой бактерии. Неспецифической реакции не наблюдали, что подтвердило специфичность метода. При определении аналитической чувствительности метода установлено, что разработанный метод способен выявлять М. haemolytica в концентрации 102 КОЕ/мл, а P. multocida - 101 КОЕ/мл.

С использованием разработанного метода в 2007 – 2009 гг. были проведены исследования 2081 пробы патологического материала от КРС, поступившего из регионов РФ. Геном M. haemolytica выявлен в 132 пробах.

В результате проведённого филогенетического анализа фрагмента гена sodA у представленных в GenBank и выявленных в настоящем исследовании штаммов и изолятов M. haemolytica установлено, что их генетическая гомология составила 99,8Филогенетический анализ по гену lktD выявил, что нуклеотидные последовательности почти всех исследованных штаммов и изолятов M. haemolytica идентичны как между собой, так и с представленными в GenВank.

3.2. Разработка метода индикации генома Chl. pecorum с использованием ПЦР Проведённый анализ данных о нуклеотидных последовательностях генов всех видов семейства Chlamydiaceae, депонированных в базе данных GenBank показал, что ген ompA содержит наибольшее количество информации о видовых и типовых отличиях отличиях хламидий. В результате было сконструировано два специфичных для Chl. pecorum праймера PECF-2: 5 '– GCAATCTAAACCTCGCGTTCAAGAA–3' и PECR-4: 5' – TCAAGTAAAGTTGCTCCCAT(A/G)GAAA –3' фланкирующих III и IV вариабельные домены гена ompA. При оптимизации метода были использованы полевые изоляты Chl. pecorum, ранее нами охарактеризованные по гену 16S rRNA согласно схеме Everett с соавт. (1999) (табл. 1).

При проведении ПЦР амплифицируется фрагмент гена ompA Chl. pecorum, размер которого составляет 461 п. н. (рис. 3).

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента Обозначения дорожек: M – маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п.н.); 1 – вода (отрицательный контроль ПЦР); 2, 3, 4, 5 –изоляты Chl.pecorum: calf/Yaroslavl/2/2006, calf/N.Novgorod/1/2006, calf/Irkutsk/1/2007 и calf/S.Petersburg/1/2007, соответственно.

Для подтверждения специфичности разработанного метода исследовали биологические материалы, содержащие как Chl. pecorum (табл. 1), так и гетерологичные микроорганизмы (Chlamydia abortus, Chlamydophila psittaci, M. bovis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Сampylobacter jejuni, и др.). Во всех образцах биологического материала содержащих геном Chl. pecorum выявляли его присутствие. В то время как в пробах содержащих гетерологичные микроорганизмы, геном Chl. pecorum не выявляли. Для всех полученных ампликонов определили первичную структуру и проанализировали с помощью программы BLAST. При этом неспецифической реакции не наблюдали, что подтвердило специфичность метода.

С использованием разработанного метода в 2006-2009 гг. нами были проведены исследования 945 проб патологического материала от КРС из различных регионов РФ. Из них геном Chl. pecorum выявили в 87 образцах.

соответствующие им аминокислотные последовательности фрагмента гена ompA.

Проведённый филогенетический анализ показал, что популяция Chl. pecorum в РФ, характеризуется высокой генетической гетерогенностью. Уровень сходства между изолятами составил от 69 до 100 % по нуклеотидным и от 71 до 100% по аминокислотным последовательностям. При этом, некоторые изоляты, выявленные в РФ, показали 100%-ую генетическую гомологию с изолятами, выявленными в Германии, Великобритании, США, Австрии и Франции в 1989-1993 гг. (рис. 4).

Рис. 4. Дендрограмма: положение изолятов, выявленных в РФ по отношению к изолятам Chl. pecorum последовательности которых опубликованы в GenВank.

группа штаммов и изолятов имеющих идентичные нуклеотидные последовательности.

Данные факты, возможно, являются следствием импорта КРС, а также указывает на то, что они, вероятно, относительно медленно эволюционировали в сходных условиях. Также, не менее важным и эпизоотически значимым результатом нашего исследования было то, что в большинстве хозяйств (83 %) регистрировали одновременное присутствие нескольких различных генетических форм Chl. pecorum.

Представляют интерес изоляты calf/Moskow/1b/2008 и calf/Moskow/2a/2008, выявленные от телят с патологией респираторного тракта. Данные изоляты идентичны изоляту L71 Chl. pecorum выделенному от дикого кабана с признаками полиартрита в Австрии и изолятам выделенным из фекалий коз во Франции. Данные факты, могут свидетельствовать об отсутствии специфичности для хозяина, межвидового барьера и строгого тканевого тропизма при инфекции Chl. pecorum.

3.3. Разработка метода индикации генома M. bovis с использованием ПЦР В результате проведённого анализа известных данных о нуклеотидных последовательностях генома М. bovis и других видов семейства Mycoplasmataceae, установлено, что ген uvrC высоко консервативен для М. bovis и обладает достаточной дискриминирующей способностью между видами микоплазм. В 5'–CAATAACAGGGATGTTTATATTAAGCGT–3' фланкирующих фрагмент гена uvrC М. bovis. Для оптимизации разрабатываемого метода был использован штамм М 9404 М. bovis (табл. 1). При проведении ПЦР амплифицируется фрагмент гена uvrC М. bovis, размером 351 п. н. (рис. 5).

Рис.5. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента Обозначения дорожек: M – маркер молекулярных весов ДНК pUS Mix Marker, 8 (стрелками обозначены длины фрагментов п.н.); №1 – вода (отрицательный контроль ПЦР); 2 – М. bovis штамм М9412; 3, 4 – полевые изоляты M. bovis.

Для подтверждения специфичности разработанного метода его проверили на биологическом материале, содержащем как M. bovis (табл. 1), так и гетерологичные микроорганизмы (Mycoplasma mycoides subsp. mycoides, Mycoplasma mycoides subsp.

capri, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma iowae, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominis, Acholeplasma laidlawii, Acholeplasma granularum, M. haemolytica, P. multocida, Escherichia coli, Chl. pecorum и др.). При этом геном М. bovis выявляли только в образцах содержащих М. bovis, секвенирование ампликонов подтвердило высокую специфичность метода.

Определили относительную аналитическую чувствительность. В качестве альтернативного был выбран метод идентификации M. bovis с помощью ПЦР разработанный Subramaniam с соавт. (1998). Установлено что, аналитическая чувствительность разработанного нами метода в 1000 раз выше таковой у метода, предложенного Subramaniam с соавт. (1998).

С использованием разработанного метода в 2008 - 2009 гг. были проведены исследования 574 проб различного патологического материала от КРС из регионов РФ, из них геном M. bovis выявили в 35 образцах.

Для 20 случаев выявления генома M. bovis в патологическом материале от КРС была определена первичная структура амплифицированного в ПЦР фрагмента гена uvrC. Проведённый филогенетический анализ показал 100% генетическую гомологию нуклеотидных последовательностей изолятов, выявленных в настоящем исследовании, с опубликованными последовательностями.

3.4. Индивидуальная и стадная превалентность M. haemolytica, P. multocida, Chl. pecorum и M. bovis в популяции КРС ЦФО РФ Для изучения превалентности M. haemolytica, P. multocida, Chl. pecorum и M. bovis в популяции КРС в возрасте 0,5 – 7,0 месяцев ЦФО РФ было проведено выборочное исследование. В выборку вошли 13 животноводческих хозяйств (N=13) Белгородская, Тверская, Костромская). Образцы мазков отбирались из носовой полости телят с клиническими признаками поражения респираторного тракта на момент отбора проб (n1= 15), и у животных без соответствующих признаков (n2=15) из каждого обследуемого хозяйства (N=13). В результате отобрано и исследовано с использованием разработанных тест - систем 390 проб на наличие генома M. haemolytica, P. multocida, Chl. pecorum и M. bovis. (табл. 3).

Превалентность изучаемых микроорганизмов в популяции КРС ЦФО РФ из них положительно из них положительно Примечание: *Все изоляты P. multocida, выявленные в настоящем исследовании, относятся к серогруппе А. Ни одной пробы, содержащей представителей серогрупп B, D, E или F, нами не выявлено (мнимая превалентность

Похожие работы:

«Стрижкова Татьяна Юрьевна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕЙРОБИОУПРАВЛЕНИЯ В ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ГИМНАСТОК С УЧЕТОМ ФАЗ ОВАРИАЛЬНО-МЕНСТРУАЛЬНОГО ЦИКЛА 03.03.01 – Физиология 19.00.02 – Психофизиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Челябинск – 2012 2 Работа выполнена в межкафедральной научно-исследовательской лаборатории Медико-биологическое обеспечение спорта высших достижений ФГБОУ ВПО Сибирский государственный университет...»

«ГЛАДЫШЕВ ПАВЕЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ РАЗРАБОТКА ФОТОБИОРЕАКТОРОВ ДЛЯ ЗАМКНУТЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ Специальность 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук МОСКВА – 2007 Работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии Официальные оппоненты : Доктор технических наук, профессор Винаров Александр Юрьевич Доктор технических наук, профессор Синяк Юрий Емельянович Ведущая...»

«УДК 621.373.826 Воронов Артём Анатольевич ГЕНЕРАЦИОННЫЕ И СПЕКТРАЛЬНО-КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЛАЗЕРА НА КРИСТАЛЛЕ Fe2+:ZnSe. 01.04.21 – лазерная физика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Долгопрудный – 2009 Работа выполнена в...»

«МАРТЫНЕНКО ВАСИЛИЙ БОРИСОВИЧ СИНТАКСОНОМИЯ ЛЕСОВ ЮЖНОГО УРАЛА КАК ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА РАЗВИТИЯ СИСТЕМЫ ИХ ОХРАНЫ Специальность 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук УФА 2009 Работа выполнена в лаборатории геоботаники и охраны растительности Учреждения РАН Института биологии Уфимского научного центра РАН Научный консультант Миркин Борис Михайлович доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты : Булохов...»

«Дмитриева Юлия Ивановна РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕГИОНАЛЬНОЙ ЭЛЕКТРОЭНЕРГЕТИКИ Специальность 05.14.01 – Энергетические системы и комплексы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Нижний Новгород – 2007 Работа выполнена на кафедре Электроэнергетика и электроснабжение ГОУ ВПО Нижегородский государственный технический университет (НГТУ) им. Р.Е. Алексеева доктор технических наук, профессор Научный руководитель : Папков...»

«КНЯЗЬКОВ Дмитрий Юрьевич МОДЕЛИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА ФОРМИРОВАНИЯ ГОЛОГРАФИЧЕСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ НА ОСНОВЕ ЭФФЕКТИВНЫХ МЕТОДОВ РАСЧЕТА ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ специальность 05.13.18 — Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Москва — 2013 Работа выполнена в лаборатории механики управляемых систем Федерального государственного бюджетного учреждении науки...»

«РОГУШИНА Людмила Геннадьевна БЛАГОТВОРИТЕЛЬНЫЕ И ПРОСВЕТИТЕЛЬСКИЕ ОБЩЕСТВА САНКТ-ПЕТЕРБУРГА В ПЕРВОЙ ЧЕТВЕРТИ XIX ВЕКА Специальность 07.00.02. – Отечественная история АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата исторических наук Санкт-Петербург 2002 2 Работа выполнена на кафедре русской истории Российского государственного педагогического университета им. А. И. Герцена. Научный руководитель : доктор исторических наук, профессор В.И.Старцев Официальные...»

«РЕЗНИКОВА ИРИНА БОРИСОВНА ФОРМИРОВАНИЕ И РЕАЛИЗАЦИЯ РЕПРОДУКТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ГЛАВНОГО КОЛОСА СОРТОВ ОЗИМОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ АГРОПРИЕМОВ Специальность: 06.01.05 – селекция и семеноводство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Краснодар 2009 1 Работа выполнена в ФГОУ ВПО Кубанский государственный аграрный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Цаценко Людмила Владимировна Официальные...»

«Нехаева Ульяна Ивановна СОЦИАЛЬНОЕ НАЗНАЧЕНИЕ ПРАВА: ПРОБЛЕМЫ ТЕОРИИ И ПРАКТИКИ 12.00.01 – теория и история права и государства; история учений о праве и государстве АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Краснодар – 2010 Работа выполнена на кафедре теории и истории государства и права федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Кубанский государственный аграрный университет Научный...»

«Грицевич Мария Игоревна ИНТЕРПРЕТАЦИЯ НАЗЕМНЫХ НАБЛЮДЕНИЙ МЕТЕОРОВ И БОЛИДОВ 01.02.05. Механика жидкости, газа и плазмы 01.03.04. Планетные исследования АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2008 Работа выполнена в Московском Государственном Университете имени М.В.Ломоносова Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор Стулов Владимир Петрович Официальные оппоненты : доктор физико-математических...»

«ПАНКРАТОВ Сергей Александрович МОДЕЛИРОВАНИЕ ДЕФОРМАЦИОННЫХ ДИНАМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЗАДАЧАХ СЕЙСМОРАЗВЕДКИ Специальность 05.13.18 – Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физикоматематических наук МОСКВА – 2012 Работа выполнена на кафедре информатики Московского физико-технического института (государственного университета) Научный руководитель : член-корреспондент РАН, доктор...»

«Гребенкина Татьяна Михайловна МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА PLANTAGO L. В СВЯЗИ С УСЛОВИЯМИ ПРОИЗРАСТАНИЯ 03.02.08 – экология (биологические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2013 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт экологии Волжского бассейна Российской академии наук Научный руководитель : Розенцвет Ольга...»

«Пятаев Максим Викторович ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ РЕГИОНАЛЬНЫХ ТРАНСПОРТНО-ЛОГИСТИЧЕСКИХ КЛАСТЕРОВ (НА ПРИМЕРЕ НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (региональная экономика) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата экономических наук Новосибирск – 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Сибирский государственный университет путей...»

«ФРОЛОВ Даниил Анатольевич ФЛОРА БАССЕЙНА РЕКИ СВИЯГИ 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Сыктывкар 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Масленников Андрей Викторович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, старший научный сотрудник Мартыненко Вера Антоновна...»

«ЛУКАШ Ольга Климентина Николаевна АРХИТЕКТУРНО-ДИЗАЙНЕРСКИЕ ПРИНЦИПЫ ФОРМИРОВАНИЯ СРЕДЫ ТОРГОВО-РАЗВЛЕКАТЕЛЬНЫХ ЦЕНТРОВ Специальность 05.23.20 Теория и история архитектуры, реставрация и реконструкция историкоархитектурного наследия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата архитектуры Москва, 2012 г. 1 Работа выполнена в Московском архитектурном институте (государственной академии) на кафедре...»

«Капитова Олеся Викторовна Правовая природа механизма алиментирования в семейном праве Российской Федерации Специальность 12.00.03- гражданское право; предпринимательское право; семейное право; международное частное право Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Москва 2009г. Диссертация выполнена на кафедре гражданско-правовых дисциплин юридического факультета им. М.М. Сперанского ГОУ ВПО Академия народного хозяйства при Правительстве...»

«Шарапов Ирек Ильясович РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ИЗМЕРЕНИЯ И РАСЧЕТА ПАРАМЕТРОВ ПРОЦЕССА ТЕПЛООБМЕНА В ШЕСТЕРЕНЧАТОМ КОМПРЕССОРЕ С ЦЕЛЬ Ю ПОВЫШЕНИЯ ТОЧНОСТИ РАСЧЕТА РАБОЧЕГО ПРОЦЕССА 05.04.06 – Вакуумная, компрессорная техника и пневмосистемы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Казань – 2009 Работа выполнена в Казанском государственном технологическом университете. Научный руководитель – кандидат технических наук, доцент Ибраев Альфред...»

«КОЛОТИЛОВА Наталья Николаевна СТАНОВЛЕНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО НАПРАВЛЕНИЯ В ОТЕЧЕСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ В ТРУДАХ С.Н.ВИНОГРАДСКОГО, ЕГО СОВРЕМЕННИКОВ И ПОСЛЕДОВАТЕЛЕЙ (КОНЕЦ XIX – СЕРЕДИНА ХХ ВВ.) Специальность 07.00.10 – история наук и и техники (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2013 Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного...»

«ШАМБОРСКИЙ Виктор Николаевич РАЦИОНАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ, АЛГОРИТМЫ ДИАГНОСТИКИ И АНАЛИЗА ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ОДОНТОГЕННОГО ОСТЕОМИЕЛИТА ЧЕЛЮСТЕЙ Специальность: 03.01.09 - Математическая биология, биоинформатика (медицинские наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Курск - 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Юго-Западный государственный университет на кафедре биомедицинской инженерии Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор...»

«МЕДВЕДКОВ Алексей Анатольевич СРЕДНЕТАЕЖНЫЕ ГЕОСИСТЕМЫ БАССЕЙНА р. ЕНИСЕЙ В УСЛОВИЯХ МЕНЯЮЩЕГОСЯ КЛИМАТА 25.00.36 - геоэкология (Науки о Земле) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре физической географии мира и геоэкологии географического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель : доктор географических наук, профессор Горшков Сергей...»








 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.