На правах рукописи

ШАЛОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ВЗАИМОСВЯЗЬ АГРЕГАЦИИ И

КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки НИИ физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Израилевич

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Изумрудов Владимир Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Медведев Алексей Евгеньевич доктор химических наук, профессор Гладилин Александр Кириллович

Ведущая организация: институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится “29” октября 2007 г. в “_” часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Медведева М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Глицеральдегид–3–фосфатдегидрогеназа (ГАФД)* (NAD+ – зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид–3– фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.12) катализирует один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид–3– фосфата в 1,3 – дифосфоглицерат с образованием NADH и является одним из самых изучаемых на сегодняшний день ферментов гликолиза. Это связано не только с важностью исследования его основной гликолитической функции, но и с обнаружением многочисленных негликолитических активностей фермента. На данный момент существует обширная информация об участии ГАФД в различных процессах за счет взаимодействия этого фермента с природными полимерами без проявления какой-либо каталитической активности. Важность разнообразных функций ГАФД в регуляции клеток во многом связана с высоким содержанием фермента в тканях. Особенно важно, на наш взгляд, изучение роли ГАФД в процессе агрегации белков и в образовании амилоидных структур. Мы полагаем, что именно благодаря высокой концентрации ГАФД является полноправным участником многих патологических процессов, обусловленных накоплением агрегированных белков. Правильность такого предположения подтверждается появлением все новых фактов участия ГАФД в возникновении различных нейродегенеративных болезней. Изучение механизмов агрегации белков крайне важно для понимания процессов возникновения амилоидных бляшек, в которых помимо самого белка -амилоида (A ), принимают участие и некоторые другие белки, в том числе и ГАФД. Таким образом, исследование развития нейродегенеративных заболеваний тесно переплетается с изучением систем, защищающих белки от агрегации.

Цели исследования. Исходя из выше изложенного, в работе были поставлены следующие цели:

измерить удельную активность и содержание ГАФД в мозге животных при моделировании болезни Альцгеймера, найти способы предотвращения агрегации белков с использованием синтетических полиэлектролитов.

Научная новизна. В настоящей работе мы впервые изучали изменение удельной активности ГАФД в образцах мозга животных при моделировании болезни Альцгеймера у трансгенных мышей TG2576, а также у крыс после введения им таких препаратов как А, тиорфан, липополисарид и интерферон. Обнаружено, что уменьшение удельной активности ГАФД в _ *Список сокращений: ГАФД – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, ПАВП-m – поли-N-алкил-4-винилпиридиний бромид, содержащий m метильных групп в N-заместителе, ПАК – полиакриловая кислота, ПМАК – полиметакриловая кислота, ПСС – полистиролсульфонат натрия, ПЭВП – поли-N-этил-4-винилпиридиний бромид, ПЭВП- сополимеры 4-винилпиридина и Nэтил-4-винилпиридиний бромида со степенью алкилирования, 3-ФГА – 3-фосфоглицериновый альдегид, ЭДТА – никотинамидадениндинуклеотид окисленный, NADH – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, TG – трансгенные мыши, WT – мыши дикого типа.

образцах мозга животных происходит независимо от способа индуцирования болезни Альцгеймера. Было обнаружено, что содержание белка, определенного в нерастворимых фракциях мозга трансгенных мышей TG2576, увеличивается. Впервые выявлена кросс-реактивность антител 6Е10, выработанных на A, с ГАФД. Показана способность синтетических полиэлектролитов подавлять термоагрегацию белков.

Практическая значимость работы. Подобраны условия избирательной идентификации А с использованием антител 6Е10. Выявленные факторы, влияющие на способность синтетических полиэлектролитов подавлять агрегацию белков, дают возможность создавать полимеры с заданными свойствами и эффективно контролировать агрегацию белка, что является важным этапом на пути создания искусственных шаперонов.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского, а также на конференциях «Ломоносов-2004»,«ЛомоносовМосква 2004, 2005; на юбилейной конференции, посвящнной 70летию основоположника российской школы биоэнергетики академика В.П.

Скулачва, «Российская биоэнергетика: от молекулы к клетке», Москва 2005;

на международных конференциях «Белки теплового шока при конформационных и раковых зоболеваниях», Польша, Закопаны 2005 и Портурагалия, Томар 2007; на международной конференции «Биокатализ», Санкт-Петербург – Кижи – Валаам 2005; на международной конференции «Биотехнология и здоровье», Армения, Ереван 2005; на международной конференции «Химия, структуры и функции биомолекул», Белоруссия, Минск 2006; на всероссийской Каргинской конференции «Наука о полимерах 21-му веку», Москва 2007; на международной конференции болезни Альцгеймера и заболевания Паркинсона, Австрия, Зальцбург 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет 136 страниц, содержит 30 рисунков и 1 таблицу. Список литературы включает 242 источника.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу из скелетных мышц кролика выделяли по методике Хилла (Hill et al., 1975). Белок хранили при 4оС в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH4)2SO4.

Мозговую ткань гомогенизировали в течение 30 сек при помощи гомогенизатора Поттера в 4-х кратном объме 10 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,5, содержавшего 0,5 мМ ЭДТА, 10 мкМ леупептина.

Полученную суспензию центрифугировали при 12000 g в течение 5 мин.

Супернатант и осадок использовали для определения активности и содержания ГАФД.

Концентрацию белка определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976) и спектрофотометрическим методом, измеряя оптическую плотность при нм, при этом использовали значение А2800,1% равное 1 (Kirchenbaum, 1972).

Определение активности ГАФД проводили спектрофотометрически, измеряя увеличение поглощения NADH при длине волны 340 нм в реакционной среде рН 8,9, содержавшей 100 мМ глицина, 100 мМ KH2PO4, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ 3ФГА и 1 мМ NAD+. Реакцию начинали внесением белка в реакционную среду.

Растворы полиэлектролитов готовили на 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5 для полианионов и рН 9,0 для поликатионов, содержавшем 0,5 мМ ЭДТА. Концентрацию полианинов в растворе рассчитывали относительно мономеров цепи полиэлектролита, поликатионов – относительно заряженных групп полимера.

Кинетику термоагрегации ГАФД измеряли на термостатированном спектрофотометре "SIM Aminco DW – 2000", США. За увеличением количества агрегатов белка следили по увеличению оптического поглощения при 320 нм. В кварцевую кювету вносили 10 мМ калий-фосфатный буфер, рН 7,5 или 9,0, содержавший 0,5 мМ ЭДТА, нагревали до 60°С, вносили белок (t = 37°С) в небольшом объме до конечной концентрации 0,7 мкМ, быстро перемешивали и записывали увеличение оптического поглощения. При работе с полиэлектролитами препараты полимеров вносили в кювету с буферным раствором до необходимой концентрации, процесс термоагрегации начинали внесением белка. Полученные результаты кинетических кривых агрегации обрабатывали при помощи программного обеспечения “OriginPro 7.5” (MicroCal Inc, США).

Анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрии проводили на адиабатическом микрокалориметре "ДАСМ-4" ("Биоприбор", Россия).

Измерения проводили при скорости нагрева 1,0оС/мин в диапазоне температур от 20 до 90оС.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970).

Метод иммуноблоттинга. Белки, разделнные в полиакриламидном геле, электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану. В некоторых экспериментах после переноса белков мембрану кипятили в фосфатно-солевом буфере в течение 5 минут (Kalback et al., 2002). В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела (6С5), выработанные на денатурированную форму ГАФД, или антитела (6Е10), выработанные на 1-17 участок А человека. Денситометрический анализ белковых полос проводили при помощи программного обеспечения QuantiScan Version 2.1 (Biosoft, Великобритания).

Статистический анализ данных проводили при помощи программного обеспечения Sigma-Stat 3.0 (Чикаго, США). Результаты представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Различие данных при p < 0, считали статистически достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение удельной активности ГАФД в мозге животных при С целью выяснения роли, которую может играть ГАФД в формировании амилоидных структур, мы исследовали изменение активности и содержания белка ГАФД в мозге животных при моделировании болезни Альцгеймера.

Нами были выбраны наиболее используемые для изучения патогенеза болезни Альцгеймера модели. Прежде всего, трансгенные мыши TG2576, для которых характерна экспрессия человеческого мутантного АРР (Лиз670 Асп, Мет671 Лей) и накопление в мозге 1-42 (Hsiao et al., 1996).

Также нами были использованы образцы мозга крыс после введения таких нейродегенеративных препаратов как А (Frautschy et al., 1991), тиорфан (Brugg et al., 1995) и смесь липополисахарида и -интерферона (HaussWegrzyniak et al., 1999). Нами были исследованы отделы мозга, которые в первую очередь подвержены нейродегенеративным процессам, а именно мозжечок и кора.

Кросс-реактивность антител 6Е10, выработанных на -амилоид, с ГАФД Исследования in vitro свидетельствуют, что ГАФД способна связываться с цитоплазматическим доменом белка предшественника А ( АРР) и оказывать влияние на формирование амилоидных фибрилл, что являетя прямым свидетельством участия фермента в патогенезе болезни Альцгеймера. Существует довольно противоречивая информация о клеточной локализации данных белков, что связано с возможностью кроссреактивности антител, выработанных на А, с ГАФД. По этой причине, прежде чем перейти к определению содержания ГАФД и пептида А в препаратах мозга с помощью иммунохимических методов, было необходимо выяснить причины перекрестной реакции антител, выработанных на А, с ГАФД и найти способы раздельной идентификации двух белков. В данной работе для выявления АРР в образцах мозга трансгенных мышей TG мы использовали коммерческие моноклональные антитела 6Е10 на участок 1-17 А человека. Иммуноблот показал ярко выраженное взаимодействие антител с ГАФД (Рис. 1 А). Полосы ГАФД можно наблюдать как в экстракте мозга трансгенных мышей, содержащих АРР, так и в образцах мозга мышей дикого типа. Такие же полосы ГАФД мы наблюдали, используя антитела 6С5, выработанные на ГАФД (Рис. 1 Б). Нам удалось показать, что после кипячения нитроцеллюлозной мембраны, после электрофоретического переноса белков, антитела, выработанные на А, более не взаимодействуют с ГАФД, хотя фермент при этом определяется антителами 6С5 (Рис. 1 В и Г.) В тоже время нами было показано, что используемые для идентификации ГАФД моноклональные антитела 6С5 не дают перекрестной реакции с амилоидными белками. Таким образом, нами были подобраны условия, позволяющие избирательно определять два белка, что особенно важно при проведении иммунофлуоресцентного анализа клеток.

Уменьшение удельной активности ГАФД в мозге животных при Для изучения изменений, происходящих с ГАФД в мозге животных при моделировании болезни Альцгеймера, мы определяли каталитическую активность этого фермента в растворимых фракциях различных частей мозга, а также (с помощью иммунохимических методов) измеряли содержание белка ГАФД, как в осадке, так и в супернатанте гомогената мозговой ткани.

Для определения удельной активности ГАФД из мозга животных Альцгеймера мы экстрагировали активную форму фермента, гомогенизируя ткань в калий-фосфатном буфере, рН 7,5.

В экстрактах мозга трансгенных мышей TG2576, содержавших АРР, нами было обнаружено уменьшение на 25 – 30 % каталитической активности ГАФД как в коре головного мозга, так и в мозжечке по сравнению с мышами дикого типа (Рис. 2 А). Однако содержание самого белка ГАФД в при этом не изменялось, как показано на иммуноблоте и на гистограмме, полученной при его денситометрическом анализе (Рис. 2 Б и В). Анализ осадков данных препаратов, полученных после элюции активной формы фермента, показал более высокое статистически значимое содержание ГАФД в образцах мозга трансгенных мышей (Рис. 2 Г и Д). Мы предполагаем, что данные осадки образцов мозга, содержат амилоидные структуры и неактивные агрегированные молекулы ГАФД. Вероятно, каталитическая активность ГАФД уменьшается за счт накопления инактивированной и нерастворимой формы фермента в участках мозга, содержащих амилоидные структуры.

Рис. 2. Изменение удельной активности (А) и содержания ГАФД, определенного иммуноблотом при помощи антител 6С5 (Б, Г) с последующим денситометрическим анализом (В, Д) различных растворимых (А, Б, В) и нерастворимых (Г, Д) фракций мозга трансгенных мышей (TG2576) и мышей дикого типа (WT).

Препараты мозга гомогенизировали в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержавшем 0,5 мМ ЭДТА, 10 мкМ леупептина при 22°C. Полученный супернатант (А, Б, В) использовали для определения удельной активности и содержания ГАФД. Осадки препаратов (Г, Д) использовали для определения содержания ГАФД. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, * p < 0,05 – статистическая разница.

Нами также было показано уменьшение каталитической активности ГАФД в мозге крыс после воздействия на них различных препаратов, способствующих развитию нейродегенеративных заболеваний. Инъекции 1-42, приводящие к значительной деградации нейронов (Frautschy et al., 1991; Shin et al., 1997), в мозг крыс приводили к уменьшению ферментативной активности ГАФД на 10 – 15 % (Рис. 3 А). Инъекции тиорфана (ингибитора фермента неприлизина, принимающего участие в катаболизме А ) и липополисахарида с интерфероном- (приводящих к оверэкспрессии АРР и накоплению А ) (Brugg et al., 1995; HaussWegrzyniak et al., 1999; Iwata et al., 2000), сопровождались снижением активности ГАФД как в коре головного мозга, так и в мозжечке крыс (Рис. Г и Ж). Нами не было обнаружено изменений в количественном содержании фермента ни в супернатанте при элюции нативной формы ГАФД (Рис. 3), ни при анализе осадка препаратов (результаты не показаны). Активность чистого фермента ГАФД при инкубации в течение 2 часов в присутствии А, тиорфана и липополисахарида не изменялась (результаты не показаны).

Рис. 3. Изменение удельной активности (А, Г, Ж) и содержания ГАФД, определнного иммуноблотом при помощи антител 6С5 (Б, Д, З) с последующим денситометрическим анализом (В, Е, И) в образцах мозга контрольных крыс и крыс после введения -амилоида (А, Б, В), тиорфана (Г, Д, Е) и липополисахарида с -интерфероном (Ж, З, И).

Препараты мозга гомогенизировали в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержавшем 0,5 мМ ЭДТА, 10 мкМ леупептина при 22°C. Полученный супернатант использовали для определения удельной активности и содержания ГАФД. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка, * p < 0,05 – статистическая разница.

Инактивация ГАФД в мозге животных при моделировании болезни Альцгеймера, обнаруженная в нашей работе, хорошо согласуется с уменьшением активности фермента в фибробластах больных пациентов (Mazzola and Sirover, 2001). В литературе существует несколько объяснений этого явления. Высказано предположение о том, что различные белковые взаимодействия могут ингибировать гликолитическую активность ГАФД и приводить к ослаблению метаболизма глюкозы в целом (Mazzola and Sirover, 2001; 2003), способствуя развитию патологических процессов (Roses, 1996;

Roses et al., 1996). Уменьшение активности фермента при развитии болезни Альцгеймера может происходить за счт окислительной модификации ГАФД. Цис149 в активном центре фермента, являющийся крайне чувствительным по отношению к окислителям, может подвергаться модификации оксидом азота NO (Hara et al., 2006), концентрация которого увеличивается в клетке при развитии болезни (Sultana et al., 2006; Finch and Cohen, 1997). Незначительное накопление свинца, одного из факторов риска развития болезни Альцгеймера, может значительно ингибировать активность ГАФД (Yun and Hoyer, 2000).

Таким образом, нами было показано, что уменьшение удельной активности ГАФД происходит при моделировании болезни Альцгеймера независимо от того, как болезнь была индуцирована. Кроме того, все выше перечисленные причины приводят к накоплению амилоидных структур, содержащих неактивную и нерастворимую форму ГАФД. Мы полагаем, что денатурированные формы ГАФД могут участвовать в формировании амилоидных структур, характерных для различных типов нейродегенеративных заболеваний.

Влияние синтетических полиэлектролитов на термоагрегацию и термоинактивацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы В данной работе мы использовали ГАФД в качестве модельного белка для изучения влияния синтетических полиэлектролитов на агрегацию белков.

Помимо важности агрегации данного фермента, ГАФД обладает удобным сочетанием свойств, а именно относительно высоким значением изоэлектрической точки, pI 8,0 (Righetti and Caravaggio, 1976), и достаточно протяженным колоколом рН-зависимого изменения активности фермента с рН-оптимумом вблизи 9,0 (Наградова и Асриянц, 1969). Поскольку в физиологических условиях тетрамерная ГАФД заряжена положительно, она способна формировать прочные комплексы с полианионами за счт электростатических взаимодействий. Как и следовало ожидать, в этих условиях фермент не проявляет склонности к взаимодействию с поликатионами. Однако ситуация меняется на прямо противоположную в щелочных средах. Проведение опытов в рН-оптимуме сопровождалось резким ростом стабильности белок-поликатионных комплексов и ослаблением взаимодействия с полианионами. Таким образом, исследуя комплексообразование одного и того же белка с полиэлектролитами разного знака заряда, нам удалось выявить влияние полимеров на агрегацию белка и показать, что такое влияние носит общий характер.

В данной работе мы использовали следующие синтетические полианионы: полиметакриловую кислоту (ПМАК), полиакриловую кислоту (ПАК) и полистиролсульфонат натрия (ПСС) (Рис. 4); и синтетические поликатионы: поли-N-этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭВП), сополимеры 4-винилпиридина и N-этил-4-винилпиридиний бромида (ПЭВП- ) различной степени алкилирования, n,n-ионены, поли-N-алкил-4-винилпиридиний бромид (ПАВП-m) содержащий m метильных групп в N-заместителе (Рис. 5).

Использование различных полиэлектролитов позволяло нам варьировать их степень полимеризации, а также степень заряженности цепи и их гидрофобность.

Полиметакриловая кислота, кислота, ПМАК Влияние соотношения заряженных групп белка и полиэлектролита на термоагрегацию ГАФД Агрегацию белка проводили при 60°C. На Рис. 6 приведены типичные кинетические кривые термоагрегации ГАФД в свободном виде (кривая 1) и в смесях с ПМАК1000. В данной системе по мере увеличения концентрации полиэлектролита (при фиксированной концентрации белка) оптическая плотность растворов в ходе тепловой агрегации последовательно снижается (кривые 2–4). Такое подавление агрегации наблюдалось при использовании всех вышеперечисленных полиэлектролитов.

Отметим, что в экспериментах основное нарастание оптической плотности происходило в течение первых четырх минут. В качестве параметра, характеризующего агрегацию в системах, мы выбрали отношение значения оптической плотности после 5 мин агрегации с полимером к оптической плотности соответствующей агрегации свободного белка, А320,5мин/А320,5мин(ГАФД). Очевидно, что отношение А320,5мин/А320,5мин(ГАФД) равное нулю соответствует полному предотвращению агрегации полиэлектролитом, тогда как отношение равное единице соответствует максимальной агрегации.

Разумно полагать, что обнаруженное нами последовательное подавление агрегации ГАФД все возрастающими количествами вводимых полиионов происходит в результате образования растворимых белок-полимерных комплексов, стабилизированных электростатическими взаимодействиями разноименно заряженных групп белка и полимера. Как следует из результатов многочисленных исследований смесей белков с полиэлектролитами, которые проводили при комнатной температуре, при стехиометрическом (1:1) соотношении противоположно заряженных групп полимера и белка в системах образуются нерастворимые белокполиэлектролитные комплексы (Xia and Dubin, 1994). Добавление в такие смеси избыточного количества полиэлектролита приводит, как правило, к растворению осадка за счет возникновения растворимых белокполиэлектролитных комплексов (Izumrudov et al., 1999). Если следовать предложенной нами схеме образования таких комплексов (Рис. 7), которая опирается на экспериментально доказанное сосуществование в растворе нерастворимых и растворимых комплексов (Зайцев и др., 1992), то полученные нами результаты можно объяснить следующим образом.

При относительно низком содержании полимера в смеси (кривая 2 на Рис. 6) основными продуктами взаимодействия ГАФД с ПМАК являются электростатически нейтральные нерастворимые комплексы (Рис. 7, А).

Очевидно, что нерастворимые комплексы не способны защитить белок от агрегации. По мере увеличения концентрации полимера (кривые 3 и 4 на Рис.

6) происходит перераспределение белковых глобул среди заряженных цепей полиэлектролитов, которое приводит к возникновению и последовательному нарастанию количества растворимых белок-полиэлектролитных комплексов (Рис. 7, Б и В). Перераспределение осуществляется за счт межмолекулярных реакций обмена, которые характерны для белок-полиэлектролитных систем и протекают достаточно легко (Izumrudov, 1996). Растворимость комплексов обеспечивают заряженные группы полиэлектролита, не участвующие в электростатическом взаимодействии с белком и находящиеся в смеси в избыточном количестве. Наконец, при достижении некоторого критического состава смеси, агрегация ГАФД полностью подавляется, что свидетельствует о превращении всех нерастворимых комплексов в растворимые белокполимерные комплексы (Рис. 7, В). Заряженные петли полимера с некомпенсированными заряженными группами поддерживают белковые глобулы в растворимом состоянии, предотвращая их агрегацию.

Рис. 7. Механизм образования белок-полиэлектролитного комплекса.

Влияние степени полимеризации полиэлектролита на термоагрегацию ГАФД Способность полиэлектролитов предотвращать термоагрегацию белка во многом определяется длиной их цепей. На Рис. 8 представлена зависимость агрегации белка от степени полимеризации присутствующих в смеси полианионов. Уменьшение степени полимеризации полимера (при фиксированном соотношении белок/полиэлектролит) понижает эту способность, а использование совсем коротких цепей практически не оказывает влияния на агрегацию ГАФД.

A320,5мин /A320,5мин (ГАФД) Как упоминалось выше, для формирования растворимых белокполиэлектролитных комплексов необходимо избыточное количество заряженных цепей полиэлектролита в комплексе. При уменьшении степени полимеризации полиэлектролита набирание петли нужного размера становится вс более затруднительным, а для совсем коротких цепей петлеобразование вовсе не характерно (Рис. 9). Тем не менее, формирование растворимых комплексов возможно, но они не эффективны для предотвращения агрегации. Вводимые новые избыточные цепи полиэлектролитов накапливаются в растворе и не принимают участия в комплексообразовании.

Итак, для эффективного предотвращения агрегации белка следует использовать высокомолекулярные полиэлектролиты, которые образуют протяженные заряженные петли, поддерживающие белок в растворимом состоянии. В полном соответствии с этим выводом находятся данные по изучению комплексов с полианионами различной плотности заряда, изложенные далее.

Влияние плотности заряда цепи полиэлектролита на термоагрегацию ГАФД Способность высокомолекулярных поликарбоновых кислот подавлять агрегацию ГАФД заметно различается, причем у ПАК2360 (Рис. 10, кривая 2) она выражена сильнее по сравнению с ПМАК1000 (кривая 1). Это отличие Рис. 9. Механизм образования комплексов белка с короткими цепями A320,5 мин/A320,5мин(ГАФД) можно объяснить разницей в значениях рКа полимерных кислот, которые составляют 5,5 и 6,5 соответственно. В условиях экспериментов (рН 7,5) степень ионизации ПМАК (рКа 6,5) ниже, то есть при фиксированной молярной концентрации звеньев полианиона заряд/зарядовое соотношение в смеси не в пользу образования растворимого комплекса ПМАК/ГАФД. В отличие от слабых поликарбоновых кислот, полистиролсульфонатный анион в условиях экспериментов полностью ионизован. Соответственно, использование ПСС даже в предельно малых концентрациях эффективно подавляет термоагрегацию белка (Рис. 10, кривая 3).

Приведенные данные указывают на важную роль плотности заряда цепей в предотвращении термоагрегации ГАФД. Рост степени ионизации ионогенных групп полимера способствует образованию растворимых белокполиэлектролитных комплексов, обуславливая высокий заряд и протяженность их петель.

Влияние гидрофобности цепи полиэлектролита на термоагрегацию ГАФД Чтобы убедиться в универсальности воздействия плотности заряда цепей на образование растворимых белок-полиэлектролитных комплексов, мы расширили рамки исследования, включив в него поликатионы. В качестве поликатионов различной плотности заряда использовали высокомолекулярные частично алкилированные поли-N-этил-4винилпиридиний бромиды (Рис. 5). В сополимерах ПЭВП-, имеющих одинаковую степень полимеризации 1600, содержатся заряженные алкилированные звенья и незаряженные пиридиновые звенья, распределенные по цепи статистически. Плотность заряда ПЭВПопределяется долей его алкилированных звеньев, %.

На Рис. 11 приведена зависимость термоагрегации ГАФД от параметра, полученная в смесях белка с различными ПЭВП- при фиксированной концентрации алкилированных звеньев сополимера. Вопреки ожиданиям, уменьшение плотности заряда на цепи не приводит к ослаблению ее способности подавлять агрегацию белка, как это наблюдалось в смесях с полианионами. Кривая имеет явно выраженный S-образный вид, свидетельствующий о росте эффективности воздействия катионного сополимера на белок с уменьшением степени алкилирования его цепи, которое резко усиливается при < 70 %.

Причина столь явного несходства в воздействии полианионов и поликатионов может заключаться в существенном отличии их незаряженных звеньев. Незаряженные протонированные карбоксильные группы поликарбоновых кислот весьма гидрофильны. Что касается незаряженных пиридиновых групп ПЭВП-, то в условиях опытов (рН 9,0) они непротонированы и гидрофобны (неалкилированный поли-4-винилпиридин не растворим в воде при рН > 3,5).

A320,5мин /A320,5мин (ГАФД) Можно полагать, что гидрофобные неалкилированные звенья ПЭВПвзаимодействуют с гидрофобными пятнами белка, которые экспонируются в раствор при нагревании, и блокируют их. При этом сродство блокированных участков белка друг к другу уменьшается, что препятствует слипанию молекул ГАФД и предотвращает их агрегацию. Для эффективного подавления агрегации цепь должна содержать относительно протяжнные гидрофобные участки, для формирования которых при статистическом распределении звеньев сополимера требуется достаточно большое количество незаряженных звеньев.

Для подтверждения этого предположения мы изучили термоагрегацию ГАФД в присутствии специально приготовленных поликатионов, несущих в цепях гидрофобные алкильные участки с различным числом метиленовых групп. Использовали исчерпывающе алкилированные ( > 95%) поли-Nалкил-4-винилпиридиниевые катионы ПАВП-m одинаковой степени полимеризации 1600, имеющие m метиленовых групп в N-алкильных заместителях (Рис. 5), а также n,n-ионены, различающиеся количеством n метиленовых групп в алкильных развязках между зарядами в основной цепи (Рис. 5). Увеличение гидрофобности алкилированных звеньев ПАВП-m при возрастании m приводило к уменьшению термоагрегации, особенно заметной при увеличении числа метиленовых групп в заместителе от 3 до 5 (Рис. 12).

Тот же эффект наблюдался при удлинении алкильных развязок между зарядами в n,n-ионенах, причем наиболее гидрофобный 10,10-ионен подавлял термоагрегацию ГАФД практически полностью (Рис. 13).

А320,5мин /А320,5мин (ГАФД) А320,5мин /А320,5мин (ГАФД) оказывать определяющее воздействие на термоагрегацию белка, блокируя белок-белковые гидрофобные взаимодействия. По всей вероятности, этот эффект играет главенствующую роль, нивелируя отрицательное влияние, которое должно было бы оказывать снижение плотности заряда поликатионов.

Обнаруженный нами эффект может составить основу для разработки стабилизаторов белковых растворов. Так, химической модификацией заряженных цепей полисахаридов алкильными фрагментами можно создавать гидрофобные области, которые должны значительно усиливать способность подавлять белковую агрегацию, что открывает новые пути создания различных биосовместимых и биодеградируемых стабилизаторов белковых смесей.

Влияние ионной силы раствора на термоагрегацию ГАФД Электростатический характер связывания полиэлектролитов с ГАФД предопределяет чувствительность образующихся белок-полиэлектролитных низкомолекулярного электролита ослабляло эффект подавления агрегации белка, а при достаточно высокой концентрации соли и вовсе отменяло его.

Так, термоагрегация ГАФД, подавленная одним из наиболее эффективных поликатионных стабилизаторов ПЭВП-35 (Рис. 14, кривая 2), возобновлялась вновь при добавлении в систему хлористого натрия и протекала с все возрастающей интенсивностью по мере увеличения ионной силы (Рис. 14, кривые 3 – 5). Разрушение белок-полимерного комплекса под действием соли предполагает выход свободного белка в раствор, где при 60°С он немедленно агрегирует.

Таким образом, электростатическое взаимодействие полиэлектролита с олигомерным белком может оказывать существенное влияние на термоагрегацию белка, которое контролируется соотношением заряженных групп полиэлектролита и белка в смеси, длиной и плотностью заряда цепей полииона, а также наличием в цепи полиэлектролита гидрофобных участков, способных связываться с гидрофобными пятнами, появляющимися на белке в результате его тепловой обработки.

Термоинактивация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Комплексообразование белка с заряженными полимерами подавляет его агрегацию, но не препятствует термоденатурации фермента, которая может даже усиливаться в присутствии полиэлектролитов. Это следует из результатов измерения ферментативной активности свободной ГАФД и ГАФД в смесях с различными ПЭВП- после 1 минуты инкубации при различных температурах (Рис. 15). Присутствие исчерпывающе алкилированного ПЭВП1600 не сказывалось на каталитическую активность до 45°С, после чего способствовало инактивации фермента. Частично алкилированные ПЭВП- той же степени полимеризации 1600 оказывали влияние на активность ГАФД даже при невысоких температурах, причем это воздействие усиливалось с уменьшением (Рис. 15).

Активность, % Эти данные указывают на то, что гидрофобные участки полиэлектролита могут не только блокировать взаимодействие гидрофобных пятен денатурированного белка друг с другом, препятствуя термоагрегации, но и вызывать изменения структуры фермента, которые приводят к его инактивации. Гидрофобные взаимодействия способствуют разворачиванию белковых глобул, которое может протекать даже при комнатной температуре.

Эти конформационные изменения влекут за собой нарушения структуры активного центра фермента, приводящие к снижению или даже полной потере каталитической функции.

О структурных изменениях белка при его связывании с гидрофобным полиэлектролитом свидетельствуют результаты исследования белокполиэлектролитных комплексов методом дифференциальной сканирующей калориметрии. На Рис. 16 в качестве примера приведены данные, полученные для свободного фермента (кривая 1) и смеси ГАФД с ПЭВП- (кривая 2), из которых следует, что в присутствии катионного сополимера плавление белка начинается на 7°С раньше. Характерно, что температурные сдвиги в смесях ГАФД с различными ПЭВП- находятся в хорошем соответствии со способностью тех же сополимеров инактивировать фермент.

Мы показали, что введение в такие системы полиэлектролита-конкурента способно высвобождать белок из комплекса и практически полностью восстанавливать его термостабильность (кривая 3).

Cp, ккал*моль *K Реактивация фермента, участвующего в комплексообразовании Воспользовавшись описанным выше приемом разрушения белокполиэлетролитного комплекса путм добавления полимера-конкурента, нам удалось показать, что высвобождение фермента сопровождается его частичной реактивацией. Присутствие относительно гидрофобного полианиона ПСС приводит к практически полной потере каталитической активности ГАФД за одну минуту инкубации смеси при 55°С (начальный участок кривой 3, Рис. 17). Гидрофильная полиакриловая кислота оказывает менее выраженное инактивирующее действие, хотя и в этом случае за минуты инкубации активность фермента падает на 70% (начальный участок кривой 2). Смеси ГАФД/полианион инкубировали 3 минуты при 55°С, а затем к ним добавляли эквимолярное по звеньям количество высокомолекулярного поликатиона ПЭВП1600 (отмечено стрелкой на Рис. 17) и инкубировали при комнатной температуре. Аналогичным образом термоинактивировали свободную ГАФД (Рис. 17, кривая 1), добавляли ПЭВП1600 и реактивировали при комнатной температуре. Как упоминалась выше, в данных условиях (рН 7,5) ГАФД не взаимодействует с поликатионами. Реактивация фермента в смеси ПЭВП1600 совпадала с реактивацией свободного фермента и составляла не более 3 % (Рис. 17, кривая 1). В обеих системах, содержащих полианионы, наблюдалась реактивация фермента (кривые 2, 3), которая в случае ПСС достигала 40% при инкубации смеси в течение 1 часа (кривая 3).

Итак, разрушением белок-полиэлектролитного комплекса, которое осуществляется при добавлении полиэлектролита-конкурента, можно реактивировать фермент. Обнаруженное восстановление каталитической активности и предотвращение агрегации фермента важно при моделировании искусственных шаперонов. Гомотетрамерный фермент ГАФД был успешно использован в качестве модели для изучения сворачивания белков и механизма ответа на тепловой шок (Polyakova et al., 2005). Синтетические полиэлектролиты с высокой степенью полимеризации могут быть использованы для выполнения таких функций Активность, % как стабилизация неполностью сврнутых интермедиатов, предотвращение их агрегации и переведение в нативную форму.

ВЫВОДЫ

Показано, что удельная активность глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы в мозге животных при различных способах моделирования болезни Альцгеймера уменьшается. При этом содержание белка глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в нерастворимых фракциях мозга трансгенных мышей TG увеличивается.

Выявлена кросс-реактивность антител 6Е10, выработанных на амилоид, с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой и подобраны условия избирательной идентификации двух белков.

Показано, что высокомолекулярные синтетические поликатионы и полианионы подавляют агрегацию глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы.

Показано, что после термоинактивации глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы в составе белок-полиэлектролитного комплекса и последующего вытеснения белка из комплекса можно провести реактивацию фермента с восстановлением до 40 % удельной активности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Журнальные статьи:

1. Shalova I.N., Naletova I.N., Saso L., Muronetz V.I., and Izumrudov V.A.

(2007) Interaction of polyelectrolytes with proteins, 3 a Influence of complexing polycations on the thermoaggregation of oligomeric enzyme.

Macromol. Biosci. 7, 929 – 939.

2. Schmalhausen E.V., Zhlobek E.B., Shalova I.N., Firuzi O., Saso L., and Muronetz V.I. (2007) Antioxidant and prooxidant effects of quercetin on glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Food and Chemical Toxicology 3. Shalova I.N., Cechalova K., Rehakova Z., Dimitrova P., Ognibene E., Caprioli A., Schmalhausen E.V., Muronetz V.I., and Saso L. (2007) Decrease of dehydrogenase activity of cerebral glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in different animal models of Alzheimer’s disease. Biochim.

Biophys. Acta 1770, 826 – 832.

Налтова И.Н., Шмальгаузен Е.В., Шалова И.Н., Плетень А.П., Цирюльников К.Н., Эртль Т., Муронец В.И. (2006) Стимулирование агрегации белков нефункционирующим шаперонином GroEL.

Биомедицинская химия 52, 518 – 524.

5. Shalova I.N., Asryants R.A., Sholukh M.V., Saso L., Kurganov B.I., Muronetz V.I., and Izumrudov V.A. (2005) Interaction of Polyanions with Basic Proteins, Influence of Complexing Polyanions on the Thermoaggregation of Oligomeric Enzymes. Macromol. Biosci. 5, 1184 – Статьи в сборниках:

1. Markossian K.A., Kurganov B.I., Levitsky D.I., Khanova H.A., Chebotareva N.A., Samoilov A.M., Eronina T.B., Fedurkina N.V., Mitskevich L.G., Merem’yanin A.V., Kleymenov S.Yu., Makeeva V.F., Muronetz V.I., Naletova I.N., Shalova I.N., Asryants R.A., Shmalhausen E.V., Saso L., Panyukov Yu.V., Dobrov E.N., Yudin I.K., Timofeeva A.C., Muranov K.O.

and Ostrovsky M.A. (2006) Mechanism of the chaperone-like activity. Protein Folding: New Research. Nova Science Publishers, USA, New York, p. 89 – 2. Muronetz V.I., Schmalhausen E.V., Poliakova O.V., Naletova I.N., Shalova I.N., and Saso L. (2005) Amyloidoses and oxidative stress. Biotechnology and health, Armenia, Erevan, p. 55 – 62.

Тезисы конференций:

1. Shalova I.N. and Izumrudov V.A. (2007) Synthetic polyelectrolytes as a tool for creation of artificial chaperons. EMBO-FEBS Workshop on "Chaperones in Normal and Aberrant Protein Folding, Aging and Cancer", Portugal, Tomar, June 9 – 14, p. 113.

Muronetz V.I., Pleten’ A.P., Schmalhausen E.V., Asryants R.A., Naletova I.N., Shalova I.N., and Saso L. (2007) Oxidized proteins block chaperones irreversibly (Role in the induction of amyloidoses). VIII International Conference Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases: Progress and New Perspectives, Austria, Salzburg, March 14 – 18, p. 62.

Шалова И.Н., Асриянц Р.А., Муронец В.И., Изумрудов В.А. (2007) Создание искусственных шаперонов на основе синтетических полиэлектролитов. IV Всероссийская Каргинская конференция «Наука о полимерах 21-му веку», Москва, 29 января – 2 февраля, том 2, с. 444.

4. Muronetz V.I., Pleten’ P.A., Schmalhausen E.V., Asryants R.A., Naletova I.N., Shalova I.N., Saso L., and Haertle T. (2006) Oxidative stress and amyloidosis. II International conference “Chemistry, structure and function of biomolecules” Belorussia, Minsk, October 3 – 5, p. 99.

5. Muronetz V.I., Schmalhausen E.V., Poliakova O.V., Naletova I.N., Shalova I.N., and Saso L. (2005) Amyloidoses and oxidative stress. International alumni seminar on "Biotechnology and health", Armenia, Erevan, October 6. Muronetz V.I., Polyakova O.V., Naletova I.N., Shalova I.N., Asryants R.A., Pleten' A.P., Saso L., Izumrudov V.A., and Schmalhausen E.V. (2005) Mechanisms of protein denaturation and design of new inhibitors of protein aggregation for the treatment of condensation diseases. International Conference Biocatalysis – 2005: Fundamentals and Application. Dedicated to 250th Anniversary of Moscow State University. St. Peterburg – Kizhiy – Valaam, Russian Federation, 19 – 23 June, p. 58.

7. Shalova I.N., Gurecka K., and Saso L. (2005) Changes of activity of cerebral glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in different models of Alzheimer’s disease. EMBO – FEBS WORKHOP on Biology of Molecular Chaperones. Heat Shock Proteins in Molecular Medicine Misfolding Disease and Cancer, Poland, Zakopane, 28 May – 2 June, p. 120.

8. Шалова И.Н., Асриянц Р.А., Муронец В.И. (2005) Влияние синтетических полианионов на термоагрегацию глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы. XII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учных «Ломоносов 2005», Секция Биоинженерии и Биоинформатики, Подсекция Биоинженерии, Москва, 12 – 15 апреля, с. 49 – 50.

9. Налтова И.Н., Шалова И.Н., Сасо Л., Шмальгаузен Е.В., Муронец В.И.

(2005) Роль окисления глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в индукции апоптоза и формировании амилоидных структур. Юбилейная конференция, посвящнная 70-летию основоположника российской школы биоэнергетики академика В.П. Скулачва, «Российская биоэнергетика: от молекулы к клетке», Москва, 21 – 23 февраля, с. 53.

10. Шалова И.Н., Асриянц Р.А., Муронец В.И. (2004) Влияние синтетических полианионов на термоагрегацию глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы. XI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учных «Ломоносов 2004», Секция Биологии, Подсекция Биохимии, Москва, 12 – 15 апреля, с. 176 – 177.